Un modèle double humanisé DE BLT-souris avec un microbiome humain stable-comme l'intestin et le système immunitaire humain

Notre protocole est significatif, car il peut être utilisé pour créer reproductiblement des souris avec à la fois un microbiome intestinal humain et un système immunitaire humain. Nous appelons ces souris, des souris doublement humanisées. Le double modèle humanisé de souris peut être utilisé pour la recherche biomédicale fondamentale et translationnelle, y compris l’étude des relations in vivo entre le microbiome intestinal humain et le système immunitaire humain.

Jianshui Zhang, postdoc, et Yilun Chang, doctorant de notre laboratoire, démontreront la procédure. Pour implanter les tissus hépatiques et thymus dans la capsule rénale gauche, placez d’abord la souris dans une hotte. Le jour de la chirurgie, traiter les souris avec l’irradiation sublétale du corps entier à un 12 centigrays par gramme de dose de poids corporel.

Raser chaque souris autour du côté latéral gauche et médial après avoir confirmé un niveau approprié de sedation. Appliquez de l’onguent ophtalmique sur les yeux de l’animal et appliquez une étiquette d’oreille au besoin. Désinfecter la peau avec trois iode séquentiels et 70% de gommages isopropanol.

Lorsque la peau a été préparé, utilisez des forceps pour charger un à un à six millimètres cubes fragment de tissu hépatique fœtal humain en trocar, suivie d’un fragment de tissu thymus humain en cubes d’un à 1,6 millimètre. Utilisez les forceps pour soulever la peau, et utilisez un scalpel pour faire une petite coupe longitudinale dans la peau. Étendre la coupe à 1,5 à deux centimètres sur le côté gauche de la souris.

Et utilisez des forceps pour soulever la couche musculaire. Utilisez des ciseaux pour ouvrir la couche musculaire longitudinal, en étendant la coupe si nécessaire pour exposer le rein, et saisir doucement le tissu adipeux entourant le rein. Utilisez un scalpel pour faire une incision d’un à deux millimètres à l’extrémité postérieure de la capsule rénale et insérez lentement le trocar préchargé dans l’incision parallèle à l’axe long du rein.

Relâchez les tissus entre la capsule rénale et le rein, et retournez le rein et l’intestin à leurs positions normales. Ensuite, utilisez des sutures pour fermer la couche musculaire et les agrafes chirurgicales pour fermer la peau. Placez la souris dans une cage de microisolateur autoclavée avec surveillance jusqu’à ce que la recumbancy complète.

Six heures après l’opération, placez les souris sous une lampe thermique et désinfectez les queues avec 70% d’isopropanol. Injecter 1,5 à 5 fois 10 à 34 CD34 positifs du tissu hépatique fœtal humain isolés cellules souches hémopoïétiques dans 200 microlitres de PBS dans une veine de queue dilaté par animal. Ensuite, arrêtez tout saignement avec une pression douce et retournez les souris dans leur cage d’origine.

Neuf à 12 semaines après la chirurgie, utilisez une retenue de peigne en plastique de taille appropriée pour isoler une jambe d’une souris humanisée, et pulvériser le côté médial de la jambe isolée avec 70% d’isopropanol. Étendre les antibio antibiotiques et les onguents analgésiques sur le site de collecte. À l’aide d’une aiguille de calibre 25 maintenue à un angle de 90 degrés, percer la veine saphenous pour recueillir de 50 à 100 microlitres de sang dans un tube de collecte de sang recouvert d’EDTA.

Lorsqu’un volume approprié de sang a été obtenu, appliquez une pression sur le site avec un morceau stérile de gaze pour arrêter le saignement avant de retourner la souris dans sa cage. Ensuite, utilisez l’échantillon de sang périphérique prélevé pour évaluer le niveau de reconstitution des cellules immunitaires humaines par cytométrie de flux à l’aide d’anticorps contre les CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 et souris CD45 humains. Pour la collecte d’échantillons fécaux frais, placez des sacs en papier autoclavés individuels dans une hotte de fumée et placez une souris dans chaque sac jusqu’à ce que chaque animal défèque.

Retournez ensuite les souris dans leur cage et utilisez des forceps stériles pour transférer chaque échantillon fécal dans un tube de 1,5 millilitre par souris pour un stockage de moins 80 degrés Celsius. À la fin du traitement antibiotique de 14 jours, changer l’eau potable en eau stérilisée autoclavée, et transférer les souris dans une nouvelle cage autoclavée. 24 et 48 heures après l’arrêt des antibiotiques décongeler les sources correctement préparées de matériel de greffe de microbiote fécal, et aliquot les échantillons dans une chambre anaérobie dans des conditions anaérobies.

Pour effectuer une greffe fécale, livrez 200 microlitres de matériel de transplantation de microbiote fécal par gavage oral à chaque animal expérimental, et répandez tout matériel dégelé restant sur la fourrure des souris humanisées ou sur la literie de la cage. Ici, un exemple d’analyse de cytométrie de flux du sang périphérique d’une souris humanisée de BLT 10 semaines après chirurgie est montré. Les populations de lymphocytes T et B peuvent être identifiées, ainsi que les sous-ensembles de lymphocytes T positifs CD4 et CD8.

Dans ce graphique, on peut observer l’abondance relative des échantillons de donneurs fécaux humains utilisés pour transférer un microbiome intestinal pour créer des souris doublement humanisées. Les changements phénotypiques à la rate et au cecum induits par le traitement antibiotique sont semblables à ceux observés chez les animaux exempts de germes. Cette parcelle principale d’analyse des composants des données représentatives sur le séquençage de l’ARN ribosomal 16S révèle que les souris doublement humanisées ont des microbiomes intestinaux humains qui sont uniques à l’échantillon de donneur humain.

L’aspect le plus critique de ce protocole est de limiter l’introduction de bactéries indésirables pour s’assurer que les souris restent en bonne santé et maintenir le microbiome intestinal humain. Ce modèle a le potentiel de faire progresser la médecine personnalisée et de nous permettre d’examiner l’impact des maladies humaines sur le microbiome intestinal tout en contrôlant d’autres facteurs atténuants.