Name: Enregistrements électrophysiologiques de courants ioniques unicellulaires sous un stress bien défini (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Découvrez l'enregistrement électrophysiologique de canaux ioniques mécanosensibles activés par cisaillement dans une chambre d'écoulement réutilisable. Cette méthode permet l'analyse en temps réel des réponses cellulaires aux forces mécaniques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ces travaux ont été financés par le National Heart, Lung, and Blood Institute (R01 HL073965, IL) et (T32 HL007829-24, ISF). Les auteurs aimeraient également remercier le Scientific Machine Shop de l'Université de l'Illinois à Chicago pour avoir généré nos dernières chambres de flux mPP.

L'utilisation d'animaux dans nos études est approuvée par l'Université de l'Illinois au Chicago Animal Care Committee (#16-183).
1. Assemblage de la chambre de flux de plaques parallèles modifiées
REMARQUE: Veuillez consulter le tableau 1 et la figure 1 pour les pièces d'information de la chambre de circulation des députés. Veuillez consulter la figure 1 pour un schéma détaillant l'orientation des pièces de chambre pour l'assemblage.
<ol><li>Pour adhérer au verre rectangulaire de couverture, pièce D, au fond de la pièce C, faites d'abord la solution d'élastomère de silicone en mélangeant soigneusement l'agent de durcissement d'élastomère de silicone de 500 l dans 5 ml de base d'élastomère de silicone.</li>
	<li>Appliquer une fine couche de la solution d'élastomère de silicone autour des bords de l'espace rectangulaire de la pièce C et placez délicatement la pièce rectangulaire en verre D directement sur la solution d'élastomère de telle sorte que la pièce D couvre complètement l'espace rectangulaire ouvert de la pièce C. Essuyez soigneusement l'excès de solution d'élastomère de silicone.</li>
	<li>Répétez l'étape 1.2 pour adhérer au verre de couverture rectangulaire, pièce F, au fond de la pièce E et permettre à la solution d'élastomère de silicone de guérir pendant la nuit à température ambiante. REMARQUE: Une fois durci, le verre rectangulaire restera respecté jusqu'à six mois avant d'avoir besoin d'être remplacé.</li>
	<li>Commençant par la pièce de chambre inférieure, pièce E, assembler la chambre d'écoulement MPP en plaçant séquentiellement chaque pièce sur le dessus de la précédente dans l'ordre suivant : pièce E (en bas), pièce C, pièce B, pièce A (en haut).</li>
	<li>Alignez les trous de vis de chaque pièce dans les coins et vissez fermement les morceaux ensemble pour éviter que des fuites ne se produisent pendant l'administration de l'écoulement vers la chambre d'écoulement du MPP.</li>
</ol>2. Préparation cellulaire et ensemencement dans la Chambre de flux du MPP
REMARQUE: Suivez les étapes 2.1-2.7 pour les cellules endothéliales cultivées. Suivez la méthode détaillée dans les étapes 2.8-2.14 pour isoler les cellules endothéliales de l'arcade artérielle mésentérique de souris et la préparation des cellules endothéliales fraîchement isolées.
<ol><li>Dans une plaque de 6 puits, placez quatre à cinq cercles de verre de 12 mm et des cellules de semences entre 10 % et 30 % de confluence de sorte que les cellules simples peuvent être consultées pour les enregistrements électrophysiologiques.</li>
	<li>Incuber les cellules dans des conditions de culture standard (5% CO2, 37 oC) pendant pas moins de 2 h pour permettre aux cellules d'adhérer et pas plus de 24 h que les cellules endothéliales dans l'expérience des auteurs deviennent très plat et difficile à patcher lorsqu'il est ensedu à la sous-confluence pour plus de 24 h.</li>
	<li>Retirer un verre de couverture contenant des cellules adhérentes d'un puits de la plaque de 6 puits, rincer rapidement à la saline tamponnée par le phosphate (PBS) et transférer dans un plat Petri de 35 mm contenant une solution de bain électrophysiologique de 2 ml (tableau 2) avant le transfert au débit MPP chambre.</li>
	<li>Transférer le cercle de verre de couverture sur le verre de couverture rectangulaire, pièce D, qui est adhéré à la pièce C de la chambre d'écoulement MPP étant sûr que la solution adéquate reste sur le verre de couverture de sorte que les cellules ne soient pas exposées à l'air. Ajouter la solution de bain désirée (250 l) aux cellules afin que le cercle de verre de couverture et les cellules soient complètement immergés dans la solution.</li>
	<li>Placez le cercle de verre de couverture de telle sorte qu'il repose dans la moitié la plus proche du côté du réservoir de vide de sorte que les cellules seront en ligne avec les ouvertures de fendu de la pièce B. Assurez-vous que le cercle de couverture en verre adhère à la pièce D par l'adhérence de verre de solution de sorte que l'application de l'écoulement vers la chambre ne perturbe pas la position du cercle de verre de couverture.</li>
	<li>Assembler la chambre d'écoulement du MPP en sitoyant les pièces dans l'ordre approprié, tel que décrit dans les étapes 1.4 et 1.5 et comme indiqué à la figure 1. Transférer la chambre au stade du microscope et perfuser immédiatement la chambre avec une solution de bain de sorte que la solution atteigne le réservoir de vide pour l'aspiration (10 ml).</li>
	<li>Identifiez une cellule saine pour l'expérience en identifiant une cellule avec une bordure foncée et un noyau évident. Évitez les cellules qui semblent être des taches ou des cellules qui sont en contact avec d'autres cellules. REMARQUE: Dans le laboratoire des auteurs, les cellules endothéliales aortiques humaines et les cellules endothéliales mésentériques primaires de souris dans la culture sont employées. Cependant, tout autre type de cellule adhérente qui est d'intérêt pour les besoins de recherche spécifiques peuvent être utilisés de la même manière.</li>
	<li>Laver l'arcade artérielle isolée dans la solution de dissociation (tableau 2). Transférer l'arcade dans un tube centrifugeur de 2 ml contenant 2 ml de solution de dissociation préréchauffée (37 oC) (recette de solution de dissociation indiquée dans le tableau 2) contenant de la protéase neutre (0,5 mg/ml) et de l'élastase (0,5 mg/mL). Incuber pendant 1 h à 37 oC en secouant doucement toutes les 10 min.</li>
	<li>Retirez 1 mL de la solution de dissociation neutre de protéase/élastase et ajoutez 1 mg/mL de collagène de type 1. Remettre la solution de collagène à la solution contenant les artères pour une concentration finale de collagène de type 1 de 0,5 mg/mL. Incuber pendant 2 h 3 min à 37 oC.</li>
	<li>À l'aide de forceps de 5 grades, déplacez rapidement l'arcade sur un plat Petri de 35 mm de diamètre contenant une goutte de 750 ll de solution de dissociation fraîche et réfrigérée. Dissocier davantage le tissu en utilisant deux aiguilles de seringue séparices de 20 G pour libérer mécaniquement les cellules endothéliales des artères enzymatiquement digérées.</li>
	<li>À l'aide d'une tuyauterie en verre Pasteur jetable de 9 po, triturate la solution cellulaire 10x avant de transférer les cellules dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 ml à l'aide de la tuyauterie en verre.</li>
	<li>Laver le plat Petri avec une autre solution de dissociation de 750 l et transférer dans le même tube. À l'aide de la pipette en verre, disperser mécaniquement les cellules en pipetting au moins 10x pour créer une suspension de cellule unique en prenant soin de ne pas introduire des bulles qui peuvent endommager l'intégrité des cellules endothéliales.</li>
	<li>Ajouter directement 750 l de la suspension des cellules endothéliales (500 à 1 000 cellules) directement à la pièce D de la chambre d'écoulement du MPP sur la moitié la plus proche du côté du vide du réservoir. Laisser les cellules endothéliales adhérer entre 45 min et 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Assembler la chambre d'écoulement du MPP en sitoyant les pièces dans l'ordre approprié, tel que décrit dans les étapes 1.4 et 1.5 et comme le montre la figure 1. Transférer la chambre au stade du microscope et perfuser immédiatement la chambre avec une solution de bain de sorte que la solution atteint l'aspiration du vide (10 ml). Identifier les cellules endothéliales accessibles par leur phénotype rugueux et rond19,20. REMARQUE: Une variété de méthodes de digestion et de cocktails enzymatiques ont été utilisés pour isoler les cellules endothéliales de différents lits artériels. Voir le tableau 3 pour les descriptions détaillées des protocoles qui ont été utilisés par une variété de chercheurs pour isoler les cellules endothéliales pour l'électrophysiologie de pince patch des canaux ioniques mécanosensibles. Ces méthodes sont probablement appropriées pour une utilisation en combinaison avec la chambre de débit MPP.</li>
</ol>3. Contrôler le stress de cisaillement à la chambre de flux de MPP pour des enregistrements électrophysiologiques des canaux mécanosensibles activés par cisaillement
<ol><li>Mettre en place un système de perfusion gravitationnelle en connectant un cylindre de seringue gradué de 30 ml à une serrure luer à 3 voies équipée d'un tube microbore (diamètre interne : 0,05 pouce, diamètre externe : 0,09 pouce) adapté à l'insertion dans le trou d'entrée de 3 mm de diamètre de la pièce A du MPP chambre.</li>
	<li>Attachez le cylindre gradué à la face extérieure de la cage de Faraday entourant la plate-forme d'électrophysiologie (Figure 2) à l'aide de ruban à double face. Avant d'insérer le tube dans la chambre du MPP, remplissez la seringue et le tube avec une solution de bain (voir le tableau 2 pour la solution de bain utilisée pour étudier les canaux de rectification intérieure de K dans les cellules endothéliales). Insérer le tube dans le trou d'entrée de la chambre d'écoulement MPP de la pièce A.</li>
	<li>Préremplir la chambre d'écoulement MPP avec une solution telle que la solution est enlevée dans le réservoir sous vide. Arrêter le flux vers la chambre et remplir le cylindre gradué à la marque supérieure. Calculez les débits manuellement en permettant à la solution de circuler dans la chambre et en utilisant un chronomètre pour calculer les mL/s à une hauteur de cylindre de seringue donnée.</li>
	<li>Soulevez ou abaissez la seringue pour modifier le débit, et ainsi cisaillez dans la chambre, et continuez ce processus jusqu'à ce qu'un niveau désiré de stress de cisaillement soit trouvé.</li>
	<li>Calculez le stress de cisaillement dans une chambre parallèle en utilisant l'équation suivante21: 6 Q/h2w où la viscosité fluide (g/cm), le débit Q et la largeur de la chambre de plaque parallèle (w - 2,2 cm) et la hauteur (h à 0,1 cm) sont des taux d'écoulement. REMARQUE: Dans le système actuel de perfusion gravitationnelle, à hauteur de cylindre de seringue (mesurée du haut du cylindre) de 57 cm au-dessus du stade du microscope, le débit est de 0,3 ml/s. Le cisaillement calculé dans la chambre à cette hauteur et débit de cylindre de seringue est 0.7 dyn/cm2. Il convient également de noter que d'autres systèmes de perfusion, comme une pompe péristétique, peuvent être utilisés pour contrôler le débit vers la chambre d'écoulement du MPP. Cependant, ces dispositifs peuvent ajouter la turbulence non désirée et influencer la stabilité des mesures d'électrophysiologie sous l'écoulement, ainsi, utilisant le système de perfusion de gravité décrit ici est recommandé.</li>
	<li>Transférer une chambre assemblée contenant des cellules adhérentes au stade du microscope de la plate-forme d'électrophysiologie et insérer le tube prérempli avec une solution de bain dans le trou de la pièce A. Remplir simultanément la chambre et laver les cellules avec 10 ml de solution de bain par tournant le verrou luer à trois voies de telle sorte que la solution s'écoule vers la chambre.</li>
	<li>Une fois que la configuration de patch désirée est obtenue avec succès permettent aux courants de canal de se stabiliser dans un bain statique à température ambiante. Une fois que les courants se sont stabilisés, appliquez le cisaillement d'une manière progressive permettant aux augmentations de courant de se stabiliser avant l'augmentation suivante du stress de cisaillement. REMARQUE: Les auteurs trouvent le plus grand succès avec la configuration perforée de correction en étudiant les canaux d'ion mécanisés dans les cellules endothéliales. Pour effectuer des configurations perforées de patchs à cellules entières, ajoutez 5 l d'un stock de 60 mg/mL d'amphotericinbb dans du sulfure de diméthyle (DMSO) à 1 ml de solution de pipette filtrée stérile de 0,2 m. Après avoir généré un joint giga-ohm dans la configuration cellulaire, des plaques de cellules entières perforées se forment dans un délai de 2 à 5 minutes.</li>
	<li>Supprimer l'exposition au cisaillement des cellules en arrêtant le flux vers la chambre, ce qui permet aux courants de canaux mécanosensibles de revenir aux courants de base observés dans le bain statique.</li>
	<li>Isoler les courants d'intérêt des canaux ioniques mécanosensibles en modifiant la valence des solutions (p. ex., 60 mM Kdans la solution de bain avec 0 Ca2 dans la solution pipette pour étudier les canaux de K ' vers l'intérieur. Le tableau 2 montre des exemples de recettes de solutions) et/ou d'inhibition pharmacologique des sources actuelles potentiellement contaminantes.</li>
</ol>

<ol><li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans%3A+Role+of+Hemodynamic+Stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li>
<li>Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%2C+hemodynamic+forces%2C+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).</li>
<li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K%2B+current+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li>
<li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secrets+of+the+code%3A+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li>
<li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li>
<li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inwardly+rectifying+K%28%2B%29+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li>
<li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K%28%2B%29+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li>
<li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li>
<li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomed+Engineering%22%5BJournal%5D)">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K%2B+channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li>
<li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330(2014).</li>
<li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478(2018).</li>
<li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Assembly+and+Application+of+%27Shear+Rings%27%3A+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital%2C+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632(2016).</li>
<li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li>
<li>Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li>
<li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li>
<li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-activated+Na%28%2B%29and+K%28%2B%29Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li>
<li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li>
<li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+SK%28Ca%29+and+IK%28Ca%29+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereberal+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li>
<li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349(2012).</li>
<li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li>
<li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li>
<li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette%3A+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228(2019).</li>
<li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K%28%2B%29+current+by+convectively+restoring+%5BK%28%2B%29%5D+at+the+cell+membrane+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585(2016).</li>
<li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li>
<li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li>
<li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li>
<li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li>
<li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le système vasculaire est constamment exposé aux forces hémodynamiques actives, qui activent les canaux ioniques mécanosensibles3,22 mais les rôles physiologiques de ces canaux dans la mécanotransduction induite par le stress de cisaillement est seulement commence à émerger4,6,8. Les mécanismes responsables de la méchanosensibilité des canaux activés par le stress de cis...

Les forces hémodynamiques générées par le flux sanguin sont bien connues pour jouer des rôles majeurs dans la fonction endothéliale et vasculaire1,2. Il est également bien connu que plusieurs types de canaux ioniques répondent vivement aux changements dans le stress de cisaillement3,4,5 conduisant à l'hypothèse que les canaux ioniques peuvent être des capteurs de stress de cisaillement primaire. Plus récemment, nous et d'autres avons montré que les canaux ioniques mécanosensibles jouent des rôles critiques dans plusieurs fonctions vasculaires sensibles au stress de cisaillement, y compris la réponse vasoactive au stress de cisaillement6,7,8 , et l'angiogenèse développementale9. Les mécanismes de la sensibilité de cisaillement-stress des canaux d'ion, cependant, sont presque totalement inconnus. Cette lacune de connaissances est probablement due à la difficulté technique d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous un stress bien défini. Dans cet article, par conséquent, nous fournissons un protocole détaillé étape par étape régulièrement effectué dans notre laboratoire pour atteindre cet objectif6,7,10,11.
L'objectif global de cette méthode est de permettre l'investigation en temps réel de la mécanactivation du canal ionique sous un stress bien défini dans la gamme physiologique. Ceci est réalisé en modifiant une chambre parallèle standard d'écoulement de plaque pour permettre à une pipette électrophysiologique d'être abaissée dans la chambre et aux cellules d'accès cultivées sur la plaque inférieure pendant l'exposition en temps réel au flux, fournissant une approche unique pour réaliser ceci but6,7,11. En revanche, les chambres parallèles standard d'écoulement de plaque, décrites dans les publications précédentes peuvent être employées pour l'analyse en temps réel d'imagerie des cellules exposées aux forces de cisaillement12 ou à d'autres approches non-invasives13,14 mais pas pour Électrophysiologie. De même, l'appareil de cône et de plaque, une autre approche puissante pour exposer des cellules au stress de cisaillement15,16 n'est pas non plus approprié pour des enregistrements électrophysiologiques. Ainsi, ces dispositifs de débit ne permettent pas l'enquête sur la sensibilité au stress de cisaillement des canaux ioniques. La difficulté d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous le flux est la principale raison du manque d'informations sur les mécanismes responsables de ces effets cruciaux.
Pour ce qui est des approches alternatives pour atteindre le même objectif, il n'y en a aucune qui soit aussi précise ou contrôlée. Certaines études antérieures ont tenté d'enregistrer l'activité des canaux ioniques sous le flux en exposant les cellules à un flux de liquide provenant d'une autre pipette apportée à proximité d'une cellule de plus de17,18. C'est très non physiologique, car les forces mécaniques générées dans ces conditions ont peu en commun avec les profils physiologiques du stress de cisaillement dans les vaisseaux sanguins. Des préoccupations similaires s'appliquent aux tentatives de simuler le stress physiologique du cisaillement par perfusion de chambres ouvertes. Comme nous l'avons vu en détail dans notre étude précédente10, une interface à ciel liquide ouvert crée de multiples perturbations et recirculation, qui ne sont pas physiologiques. Pour répondre à toutes ces préoccupations, nous avons conçu une chambre de débit de plaque parallèle modifiée (MPP), également appelée « dispositif d'écoulement mini-invasif » dans nos études antérieures6,7,10,11, faite de l'acrylique et largement utilisé dans notre laboratoire. Cependant, en dépit du fait que la description originale de la conception a été publiée il y a près de 20 ans et qu'elle est le seul dispositif d'écoulement qui permet d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sous un stress bien défini, cette méthodologie n'a pas été adopté par d'autres laboratoires et il n'y a que très peu d'études qui tentent d'enregistrer les courants en cours d'écoulement. Nous croyons, par conséquent, que fournir une description détaillée de l'utilisation de la chambre de débit MPP sera d'une grande aide pour les chercheurs qui s'intéressent aux canaux ioniques mécanosensibles et la biologie vasculaire.

<table><tbody><tr><td>0,2 et micro ; m filtres pour seringues stériles</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Utilisé pour filtrer la solution de pipette électrophysiologique</td></tr> 5 <tr><td>pinces de qualité</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>1252-30</td><td>Utilisé pour transférer les artères digérées vers une solution fraîche</td></tr><tr><td>9" Pasteur Pipet</td><td>Fisher Scientifc</td><td>13-678-20D</td><td>Utilisé pour perturber mécaniquement les artères digérées et transférer des cellules endohteliales fraîchement isolées&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cercles de verre de couverture de 12 mm de diamètre</td><td>Fisher Scientifc</td><td>12-545-80</td><td>À utiliser avec des études impliquant des cellules cultivées et des traitements multiples. Les cellules collées sur le verre de protection sont utilisées pour les analyses par patch clamp</td></tr><tr><td>Verre de couverture rectangulaire de 24 mm x 40 mm Verre de couverture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS2975224</td><td>Verre de couverture à ajouter aux pièces de la chambre d’écoulement MPP C (Figure 1)</td></tr><tr><td>Verre de couverture rectangulaire de 24 mm x 50 mm Verre de couverture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS2975245</td><td>Verre de couverture à ajouter à la chambre d’écoulement MPP E (Figure 1)</td></tr><tr><td>Aiguilles de seringue de 20 g Becton</td><td>Dickinson and Co</td><td>305175</td><td>Pour utilisation dans la perturbation mécanique des artères mésentériques digérées</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri de 35 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td>Pour utilisation dans la perturbation mécanique des artères mésentériques digérées</td></tr><tr><td>Amphotéricine B solubilisée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-50MG</td><td>Utilisé pour générer la configuration de patch perforé à cellules entières.</td></tr><tr><td>Colagénase, type I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>100 mg - LS004194</td><td>Enzyme utilisée dans notre laboratoire comme une brève digestion après le cocktail initial de protéase neutre et d’élastase</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientifc</td><td>67-68-5</td><td>Solvant pour amphotéricine B utilisé dans un patch clamp perforé à cellules entières</td></tr><tr><td>Elastase, lyophilisée</td><td>Worthington Biochemical</td><td>25 mg - LS002290&nbsp ;</td><td>Enzyme utilisée dans notre laboratoire dans un cocktail avec de la protéase/dispase neutre pour commencer la digestion des artères pour l’isolement des cellules endothéliales.</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire Falcon, 6 puits, fond plat avec couvercle à faible évaporation&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>À utiliser avec des études impliquant des cellules cultivées et des traitements multiples</td></tr><tr><td>Protéase/dispase neutre</td><td>Worthington Biochemical</td><td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td><td>Enzyme utilisée dans notre laboratoire dans un cocktail avec de l’élastase pour commencer la digestion des artères pour l’isolement des cellules endothéliales</td></tr><tr><td>SylGard&nbsp ;</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Élastomère de silicone pour l’adhérence de la lamelle rectangulaire sur les pièces C et E de la chambre d’écoulement MPP (Figure 1)</td></tr><tr><td>Tube Tygon ND 10-80</td><td>Tube Microbore</td><td>AAQ04133</td><td>ID : 0,05 po, Diamètre extérieur : 0,09 po, tube de perfusion d’entrée pour l’administration du débit vers la chambre</td></tr></tbody></table>

enregistrements électrophysiologiques de courants ioniques unicellulaires sous un stress bien défini

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Le stress de cisaillement de fluide est bien connu pour jouer un rôle important dans la fonction endothéliale. Dans la plupart des lits vasculaires, le stress élevé de cisaillement des augmentations aigues du flux sanguin déclenche une cascade de signalisation ayant pour résultat la vasodilatation atténcitant ainsi le stress mécanique sur la paroi vasculaire. Le modèle de l'effort de cisaillement est également bien connu pour être un facteur critique dans le développement de l'athérosclérose avec l'effort laminaire de cisaillement étant atheroprotective et le stress perturbé de cisaillement étant pro-atherogenic. Bien que nous ayons une compréhension détaillée des différentes voies intermédiaires de signalisation cellulaire, les récepteurs qui traduisent d'abord le stimulus mécanique en médiateurs chimiques ne sont pas complètement compris. Les canaux ioniques mécanosensibles sont essentiels à la réponse au cisaillement et régulent la signalisation cellulaire induite par le cisaillement contrôlant ainsi la production de médiateurs vasoactifs. Ces canaux sont parmi les premiers composants de signalisation activés à cisaillement et ont été liés à la vasodilatation induite par le cisaillement par la promotion de la production d'oxyde nitrique (p. ex., rectification intérieure de Ket potentiel récepteur transitoire [TRP] canaux) et facteur d'hyperpolarisation de l'endothélium (p. ex., canaux K et K activés par le calcium) et vasoconstriction induite par le cisaillement par un mécanisme indéterminé qui implique des canaux piézoïdes. Comprendre le mécanisme biophysique par lequel ces canaux sont activés par des forces de cisaillement (c.-à-d. directement ou par un récepteur mécano-récepteur primaire) pourrait fournir de nouvelles cibles potentielles pour résoudre la pathophysiologie associée au dysfonctionnement endothélial et l'athérogenèse. Il est encore un défi majeur d'enregistrer l'activation induite par le flux des canaux ioniques en temps réel en utilisant l'électrophysiologie. Les méthodes standard pour exposer les cellules à un stress bien défini, comme le rhéomètre de cône et de plaque et la chambre d'écoulement parallèle fermée de plaque ne permettent pas l'étude en temps réel de l'activation de canal d'ion. Le but de ce protocole est de décrire une chambre de flux de plaque parallèle modifiée qui permet l'enregistrement électrophysiologique en temps réel des canaux ioniques mécanosensibles sous le stress bien défini de cisaillement.

Plusieurs photographies montrant des vues différentes de la chambre d'écoulement du MPP à l'étape du microscope (panneau supérieur) et une représentation schématique de la chambre d'écoulement du MPP (panneau inférieur) sont présentées à la figure 1. Le schéma détaille les dimensions de l'ensemble de l'appareil et de la chambre d'écoulement. La figure 2 montre une photographie du système de perfusion gravitationnelle vers la cham...

Le but de ce protocole est de décrire une chambre parallèle modifiée d'écoulement de plaque pour l'usage en étudiant l'activation en temps réel des canaux d'ion mechanosensitive par le stress de cisaillement.

Enregistrements électrophysiologiques de courants ioniques unicellulaires sous un stress bien défini

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

L’utilisation de la chambre d’écoulement parallèle modifiée de plaque peut aider des chercheurs à répondre aux questions clés relatives à la réponse fonctionnelle des canaux iion mécanosensibles au stress de cisaillement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une enquête en temps réel pour couler les canaux iion activés dans une chambre d’écoulement parallèle facilement assemblée et réutilisable. Pour commencer la procédure, appliquez une fine couche de solution élastomer en silicone sur les bords de l’espace rectangulaire de la pièce C, et placez doucement le verre rectangulaire de couverture, pièce D, directement sur la solution élastomères pour couvrir complètement l’espace rectangulaire ouvert de la pièce C.Essuyez soigneusement l’excès de solution d’élastomères en silicone.Ensuite, répétez la procédure d’adhésion du verre rectangulaire de couverture, pièce F, au fond de la pièce E et permettre à la solution élastomères de silicone de guérir toute la nuit à température ambiante. Maintenant, assemblez la chambre de flux MPP en plaçant séquentiellement chaque pièce sur le dessus de la précédente, en commençant par la chambre inférieure, pièce E, puis pièce C, pièce B, suivie de la pièce A sur le dessus. Ensuite, alignez les trous de vis de chaque pièce aux coins et vissez étroitement les morceaux ensemble pour empêcher les fuites de se produire tout en administrant le flux à la chambre d’écoulement de MPP.Dans une assiette de six puits, placer de quatre à cinq, 12 millimètres couvrir les cercles de verre dans chaque puits. Sauver les cellules entre 10% et 30% confluence, de sorte que les cellules simples peuvent être consultés pour les enregistrements électrophysiologiques. Par la suite, incuber les cellules dans des conditions de culture standard pendant pas moins de deux heures pour permettre aux cellules d’adhérer, et pas plus de 24 heures, car les cellules endothéliales deviendront plates et difficiles à patcher lorsqu’elles sont ensemencées au sous-fluent pendant plus de 24 heures.Ensuite, retirez un verre de couverture contenant les cellules adhérentes d’un puits de la plaque de six puits et rincez rapidement dans PBS. Ensuite, transférez le verre de couverture avec des cellules dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant deux millilitres de solution électrophysiologique de BAF. Transférez immédiatement le verre de couverture avec des cellules à la chambre d’écoulement de MPP.Transférer le cercle de verre de couverture dans le verre rectangulaire de couverture, pièce D, qui est adhéré à la pièce C de la chambre d’écoulement MPP. Ajouter la solution BAF pour submerger complètement le cercle de verre de couverture et les cellules. Par la suite, placez le cercle de verre de couverture sur la pièce D de telle sorte que les cellules seront en ligne avec les ouvertures de fente de la pièce B.Assurez-vous que le cercle de verre de couverture adhère à la pièce D par l’adhérence en verre de solution pour éviter la perturbation de la position du cercle de verre de couverture par l’application de flux.Ensuite, assemblez la chambre d’écoulement du député en vissant les pièces ensemble dans l’ordre approprié. Transférez la chambre au stade du microscope et infusez immédiatement la chambre avec la solution BAF. Ensuite, identifiez une cellule saine avec une bordure foncée et un noyau évident pour l’expérience.Évitez les cellules qui semblent être des graisses ou des cellules qui sont en contact avec d’autres cellules. Pour contrôler le stress du cisaillement, installez un système de perfusion par gravité en connectant un cylindre de seringue gradué de 30 millilitres à une serrure Luer à trois sens équipée d’un tube de microbore. Ensuite, attachez le cylindre gradué à la cage de Faraday entourant la plate-forme d’électrophysiologie à l’aide de ruban adhésif à double face.Avant d’insérer le tube dans la chambre du député, pré-remplir la seringue et le tube avec la solution BAF. Ensuite, insérez le tube dans le trou d’entrée de la chambre d’écoulement du député de la pièce A.Pré-remplissez la chambre d’écoulement du député avec une solution, de sorte qu’il est enlevé dans le réservoir de vide. Arrêtez le flux vers la chambre et remplissez le cylindre gradué jusqu’à la marque supérieure.Calculez le débit manuellement à l’aide d’un chronomètre en permettant à la solution de circuler à travers la chambre à une hauteur de cylindre de seringue donnée. Soulevez ou abaissez la seringue pour modifier le débit et calculer le stress de cisaillement dans une chambre parallèle à l’aide de cette équation. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’un niveau désiré de stress de cisaillement soit trouvé.Par la suite, transférez une chambre assemblée contenant des cellules adhérentes au stade du microscope de la plate-forme d’électrophysiologie. Et insérer le tube, pré-rempli de solution BAF, dans le trou de la pièce A.Then, remplir la chambre et laver les cellules avec 10 millilitres de solution BAF, simultanément. Une fois que la configuration de patch désirée est obtenue avec succès, laissez les courants de canal se stabiliser dans un bain statique à température ambiante.Dès que les courants se sont stabilisés, appliquez le cisaillement d’une manière pas à pas, permettant à l’augmentation du courant de se stabiliser avant la prochaine étape de l’augmentation du stress de cisaillement. Éliminez l’exposition au cisaillement des cellules en arrêtant le flux vers la chambre, ce qui permet aux courants de canaux mécanosensibles de revenir aux courants de base observés dans le bain statique. Montré ici est un enregistrement brut représentatif du courant kir à partir d’une cellule endothéliale mésentérique de souris primaire avec courant de fuite linéaire notable vers l’extérieur.Une rampe de 140 à 40 millivolts positifs a été appliquée au patch sur 400 millisecondes. Le courant de fuite empêche l’analyse de l’activité réelle du canal Kir. Pour soustraire le courant de fuite, calculez d’abord la conductance linéaire de la pente du courant de fuite.Pente de G multiple par les tensions correspondantes de la trace brute entière pour tracer le courant de fuite sur les données brutes. La ligne doit superposer la fuite linéaire vers l’extérieur exactement. Ensuite, soustrayez le courant de fuite tracé de toute la trace de sorte que le courant extérieur linéaire est d’environ zéro picoamperes par picofarad, et le courant kir réel peut être analysé.La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est de positionner correctement le verre de couverture dans la chambre afin que les cellules soient accessibles pour des expériences. En outre, assurez-vous que le bordereau de couverture est adéquatement adhéré à la pièce D, de sorte que le flux de liquide ne perturbe pas le verre de couverture contenant des cellules.

electrophysiological-recordings-single-cell-ion-currents-under-well

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo montre le processus de la cellule entière enregistrements pince de tension dans la tranche la rétine de la salamandre aquatique tigre. Nous démontrons la préparation de la tranche ainsi que la façon d'effectuer des enregistrements de patch-clamp pendant la stimulation visuelle de la rétine.

Cellules entières Recordings of Light évoqués courants synaptiques excitateurs dans la tranche la rétine

Dans cette vidéo, des cultures de cellules rénales embryonnaires exprimant des protéines de canaux ioniques dépendantes de la lumière fusionnées avec un rapporteur fluorescent démontrent l’effet de la lumière sur le mouvement des ions. La pince patch à cellules entières est utilisée pour surveiller le mouvement des ions.

Enregistrement électrophysiologique optogénétique de cellules avec des canaux ioniques dépendants de la lumière

Nous décrivons la préparation de tranches minces de la rétine aquatique salamandres tigrées...

Les enregistrements de cellules entières simultanées de photorécepteurs et les neurones de second ordre dans une préparation de tranches rétine Amphibian

Nous décrivons l'isolement des myocytes auriculaires humains qui peuvent être utilisés pour intracellulaire de...

Isolation des myocytes auriculaires humaines pour la mesure simultanée de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitoires et courants membranaires

Ce protocole décrit les étapes de procédure de base pour effectuer des cellules entières enregistrements de patch-clamp. Cette technique permet l'étude du comportement électrique des neurones, et lorsqu'elle est effectuée dans des tranches de cerveau, permet d'évaluer les différentes fonctions de neurones à partir de neurones qui sont encore intégrés dans des circuits du cerveau relativement bien conservées.

Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

Ce manuscrit fournit des protocoles qui utilisent électroporation in utero (IUE) pour décrire la connectivité structurelle des neurones au niveau d'une seule cellule et l'excitabilité des neurones marqués par fluorescence. L'histologie est utilisé pour caractériser dendritique et projections axonales. enregistrement cellules entières en tranches aiguës est utilisée pour étudier l'excitabilité.

In Utero électroporation approches pour étudier l&#39;excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire

Nous décrivons ici les étapes essentielles pour des enregistrements de patch-clamp de la cellule entière faites de neurones substantia gelatinosa (SG) dans la tranche de la moelle épinière en vitro . Cette méthode permet les propriétés membranaires intrinsèques, la transmission synaptique et la caractérisation morphologique des neurones de la SG à étudier.

Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa

Présenté ici est une méthode pour phénotyper mécaniquement des cellules individuelles en utilisant une plate-forme microfluidique basée sur l’électronique appelée détection mécano-nœud-pore (mécano-NPS). Cette plateforme maintient un débit modéré de 1 à 10 cellules/s tout en mesurant les propriétés biophysiques élastiques et visqueuses des cellules.

Mechano-node-pore Sensing: une plate-forme rapide et sans marquage pour les mesures viscoélastiques multi-paramètres à cellule unique

Ce protocole décrit la quantification des propriétés mécaniques des lignées cellulaires cancéreuses et non cancéreuses in vitro. Les différences conservées dans la mécanique des cellules cancéreuses et normales peuvent agir comme un biomarqueur qui peut avoir des implications dans le pronostic et le diagnostic.

Protocole de dosage de cisaillement pour la détermination des propriétés d’un matériau unicellulaire

Ce protocole décrit une méthode rapide et efficace pour isoler les cellules musculaires lisses de l’artère basilaire du rat et enregistrer les courants des canaux potassiques rectificatifs vers l’intérieur dans ces cellules à l’aide de la technique du patch clamp de cellules entières. Il offre une nouvelle approche aux chercheurs qui étudient l’artère basilaire et les canaux ioniques.

Enregistrement des courants K+ rectificatifs vers l’intérieur dans des cellules musculaires lisses de l’artère basilaire fraîchement isolées par la technique du patch clamp

Ici, nous présentons un protocole pour fabriquer un dispositif microfluidique unique à deux couches pour étudier la régulation électromécanique de l’homéostasie du tissu épithélial. L’appareil applique des courants électriques physiologiques statiques perpendiculaires au plan tissulaire, ce qui a un impact sur l’adhésion, la prolifération et l’extrusion entre les cellules. L’imagerie de cellules vivantes et les mesures de contraintes mécaniques révèlent les mécanismes de ces processus.

Révéler le contrôle électromécanique de l’homéostasie tissulaire à l’aide d’un dispositif microfluidique à deux couches

Découvrez l'enregistrement électrophysiologique de canaux ioniques mécanosensibles activés par cisaillement dans une chambre d'écoulement réutilisable. Cette méthode permet l'analyse en temps réel des réponses cellulaires aux forces mécaniques.

Enregistrements électrophysiologiques de courants ioniques unicellulaires sous un stress bien défini

Explorer plus de vidéos