Enregistrements électrophysiologiques de courants ioniques unicellulaires sous un stress bien défini

Le but de ce protocole est de décrire une chambre parallèle modifiée d'écoulement de plaque pour l'usage en étudiant l'activation en temps réel des canaux d'ion mechanosensitive par le stress de cisaillement.

L’utilisation de la chambre d’écoulement parallèle modifiée de plaque peut aider des chercheurs à répondre aux questions clés relatives à la réponse fonctionnelle des canaux iion mécanosensibles au stress de cisaillement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une enquête en temps réel pour couler les canaux iion activés dans une chambre d’écoulement parallèle facilement assemblée et réutilisable. Pour commencer la procédure, appliquez une fine couche de solution élastomer en silicone sur les bords de l’espace rectangulaire de la pièce C, et placez doucement le verre rectangulaire de couverture, pièce D, directement sur la solution élastomères pour couvrir complètement l’espace rectangulaire ouvert de la pièce C.Essuyez soigneusement l’excès de solution d’élastomères en silicone.

Ensuite, répétez la procédure d’adhésion du verre rectangulaire de couverture, pièce F, au fond de la pièce E et permettre à la solution élastomères de silicone de guérir toute la nuit à température ambiante. Maintenant, assemblez la chambre de flux MPP en plaçant séquentiellement chaque pièce sur le dessus de la précédente, en commençant par la chambre inférieure, pièce E, puis pièce C, pièce B, suivie de la pièce A sur le dessus. Ensuite, alignez les trous de vis de chaque pièce aux coins et vissez étroitement les morceaux ensemble pour empêcher les fuites de se produire tout en administrant le flux à la chambre d’écoulement de MPP.

Dans une assiette de six puits, placer de quatre à cinq, 12 millimètres couvrir les cercles de verre dans chaque puits. Sauver les cellules entre 10% et 30% confluence, de sorte que les cellules simples peuvent être consultés pour les enregistrements électrophysiologiques. Par la suite, incuber les cellules dans des conditions de culture standard pendant pas moins de deux heures pour permettre aux cellules d’adhérer, et pas plus de 24 heures, car les cellules endothéliales deviendront plates et difficiles à patcher lorsqu’elles sont ensemencées au sous-fluent pendant plus de 24 heures.

Ensuite, retirez un verre de couverture contenant les cellules adhérentes d’un puits de la plaque de six puits et rincez rapidement dans PBS. Ensuite, transférez le verre de couverture avec des cellules dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant deux millilitres de solution électrophysiologique de BAF. Transférez immédiatement le verre de couverture avec des cellules à la chambre d’écoulement de MPP.

Transférer le cercle de verre de couverture dans le verre rectangulaire de couverture, pièce D, qui est adhéré à la pièce C de la chambre d’écoulement MPP. Ajouter la solution BAF pour submerger complètement le cercle de verre de couverture et les cellules. Par la suite, placez le cercle de verre de couverture sur la pièce D de telle sorte que les cellules seront en ligne avec les ouvertures de fente de la pièce B.Assurez-vous que le cercle de verre de couverture adhère à la pièce D par l’adhérence en verre de solution pour éviter la perturbation de la position du cercle de verre de couverture par l’application de flux.

Ensuite, assemblez la chambre d’écoulement du député en vissant les pièces ensemble dans l’ordre approprié. Transférez la chambre au stade du microscope et infusez immédiatement la chambre avec la solution BAF. Ensuite, identifiez une cellule saine avec une bordure foncée et un noyau évident pour l’expérience.

Évitez les cellules qui semblent être des graisses ou des cellules qui sont en contact avec d’autres cellules. Pour contrôler le stress du cisaillement, installez un système de perfusion par gravité en connectant un cylindre de seringue gradué de 30 millilitres à une serrure Luer à trois sens équipée d’un tube de microbore. Ensuite, attachez le cylindre gradué à la cage de Faraday entourant la plate-forme d’électrophysiologie à l’aide de ruban adhésif à double face.

Avant d’insérer le tube dans la chambre du député, pré-remplir la seringue et le tube avec la solution BAF. Ensuite, insérez le tube dans le trou d’entrée de la chambre d’écoulement du député de la pièce A.Pré-remplissez la chambre d’écoulement du député avec une solution, de sorte qu’il est enlevé dans le réservoir de vide. Arrêtez le flux vers la chambre et remplissez le cylindre gradué jusqu’à la marque supérieure.

Calculez le débit manuellement à l’aide d’un chronomètre en permettant à la solution de circuler à travers la chambre à une hauteur de cylindre de seringue donnée. Soulevez ou abaissez la seringue pour modifier le débit et calculer le stress de cisaillement dans une chambre parallèle à l’aide de cette équation. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’un niveau désiré de stress de cisaillement soit trouvé.

Par la suite, transférez une chambre assemblée contenant des cellules adhérentes au stade du microscope de la plate-forme d’électrophysiologie. Et insérer le tube, pré-rempli de solution BAF, dans le trou de la pièce A.Then, remplir la chambre et laver les cellules avec 10 millilitres de solution BAF, simultanément. Une fois que la configuration de patch désirée est obtenue avec succès, laissez les courants de canal se stabiliser dans un bain statique à température ambiante.

Dès que les courants se sont stabilisés, appliquez le cisaillement d’une manière pas à pas, permettant à l’augmentation du courant de se stabiliser avant la prochaine étape de l’augmentation du stress de cisaillement. Éliminez l’exposition au cisaillement des cellules en arrêtant le flux vers la chambre, ce qui permet aux courants de canaux mécanosensibles de revenir aux courants de base observés dans le bain statique. Montré ici est un enregistrement brut représentatif du courant kir à partir d’une cellule endothéliale mésentérique de souris primaire avec courant de fuite linéaire notable vers l’extérieur.

Une rampe de 140 à 40 millivolts positifs a été appliquée au patch sur 400 millisecondes. Le courant de fuite empêche l’analyse de l’activité réelle du canal Kir. Pour soustraire le courant de fuite, calculez d’abord la conductance linéaire de la pente du courant de fuite.

Pente de G multiple par les tensions correspondantes de la trace brute entière pour tracer le courant de fuite sur les données brutes. La ligne doit superposer la fuite linéaire vers l’extérieur exactement. Ensuite, soustrayez le courant de fuite tracé de toute la trace de sorte que le courant extérieur linéaire est d’environ zéro picoamperes par picofarad, et le courant kir réel peut être analysé.

La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est de positionner correctement le verre de couverture dans la chambre afin que les cellules soient accessibles pour des expériences. En outre, assurez-vous que le bordereau de couverture est adéquatement adhéré à la pièce D, de sorte que le flux de liquide ne perturbe pas le verre de couverture contenant des cellules.