Name: Caractériser les mutants liés à la maladie des kinases familiales de la RAF en utilisant un ensemble de méthodes pratiques et réalisables (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Découvrez des méthodes pratiques pour caractériser les mutants des kinases RAF liés aux maladies. Ces techniques sensibles et reproductibles utilisent des cellules 293T et des tests de luciférase pour étudier l'activité catalytique et les interactions protéiques.

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Les auteurs aimeraient reconnaître la bourse hairy Cell Leukemia Fellowship pour le soutien de Yuan Jimin. Ce travail a été soutenu par Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), and SHF Academic Medicine Subvention de recherche (AM/TP011/2018).

1. In Vitro Kinase Assay for Measuring the Catalytic Activity of RAF Mutants
<ol><li>Construire des vecteurs codant les mutants de la RAF (figure1A) avec l'étiquette FLAG (DYKDDDDDK) au terminus C en utilisant l'assemblage Gibson ou les méthodes traditionnelles de clonage moléculaire.
	<ol>
<li>Introduire l'étiquette FLAG et les mutations dans les séquences de codage RAF par PCR, puis insérer des séquences entières dans le vecteur pCDNA3.1 (MD) en utilisant l'assemblage Gibson ou la ligature d'ADN T4 et en suivant les protocoles de la manufacture. Utiliser les conditions suivantes pour les réactions de PCR : (1) 95 oC, 2 min; (2) 95 oC, 30 s; (3) 59 oC, 30 s; (4) 68 oC, 3 min; (5) 20 cycles de (2 à 4); (6) une cale de 4 oC. REMARQUE: Les amorces PCR pour le clonage: 5- AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 et 5-CAGCGGGTTTAAACGGGCCCCTTA-3.</li>
		<li>Insérez la séquence de codage de la TPS en amont des séquences de codage mutantde de la RAF pour générer des vecteurs codant les mutants de la RAF fusionnés par la TPS en utilisant les mêmes méthodes que décrites à l'étape 1.1.1.</li>
		<li>Valider tous les vecteurs par séquençage de l'ADN avant la transfection.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaque 293T cellules dans des plaques de 6 puits à une densité de 5 x 105 cellules/ bien un jour avant la transfection. Lorsque la densité cellulaire atteint 80 à 90 % de confluence le deuxième jour, transfect avec des vecteurs codant les kinases DE la RAF marquées par le FLAG ou leurs mutants à partir de l'étape 1.1 dans les cellules en suivant le protocole de fabrication des réactifs de transfection (Tableau des matériaux).</li>
	<li>Remplacer le milieu de culture 24 h après la transfection.</li>
	<li>Aspirer le milieu de culture 48 h après la transfection et ajouter 400 l/puits de tampon de lyse (25 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA), 0.25% NP-40, pH 7.2) complété par des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase pour lyser les cellules sur la glace. REMARQUE: La concentration de NP-40 dans le tampon de lyse est critique pour détecter l'activité catalytique des mutants de RAF avec l'affinité/stabilité modérée de dimer in vitro. Une forte concentration de détergent ou un détergent solide dans le tampon de lyse peut briser les diures de la RAF et ainsi tuer l'activité catalytique des kinases de la RAF ou de leurs mutants.</li>
	<li>Transférer les lysates cellulaires dans un tube de 1,5 ml et faire tourner de 12 000 x g pendant 10 min à 4 oC pour épuiser les débris cellulaires.</li>
	<li>Transférer 300 L par échantillon de lysates de cellules entières propres à des tubes de 1,5 ml, ajouter 20 l par échantillon de perles d'affinité anti-FLAG et tourner dans une chambre froide (4 oC) pendant 1 h. Prenez également 40 L par échantillon de lysate de cellules entières propres de côté pour détecter l'expression et l'activité (phospho-ERK1/2) des mutants de la RAF par immunoblots comme décrit ci-dessous.</li>
	<li>Laver les perles anti-FLAG une fois avec le tampon de lyse, puis une fois avec le tampon de réaction kinase (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 m M Na3VO4, 0,5 mM DTT, pH 7,2), et ajouter 20 oL de mélange de réaction kinase (2 g de MEK1 (K97A) et 100 M ATP en 20 'L de kinase re tampon d'action) par échantillon. REMARQUE: Le lavage de perle doit être complété doucement et rapidement, le tampon résiduel doit être aspiré complètement avant d'ajouter le mélange de réaction de kinase, et toutes les opérations à cette étape devraient être effectuées à 4 oC dans une chambre froide.</li>
	<li>Incuber les réactions de kinase à température ambiante (25 oC) pendant 10 min, et retourner les tubes contenant des réactions de kinase avec les doigts toutes les deux minutes pendant l'incubation.</li>
	<li>Ajouter 5 ll de tampon d'échantillon SDS 5x (375 mM Tris HCl, 9% de sulfate de dodécyl de sodium (SDS), 50% de glycérol, 0,03% de broménol bleu) par échantillon pour arrêter les réactions de kinase, puis chauffer les échantillons à 90 oC pendant 5 min.</li>
	<li>Exécuter les échantillons dans 9 -12% polyacrylamide gel électrophoresis (PAGE) avec 0,1% SDS, transférer les protéines à la membrane de nitrocellulose, et de détecter les niveaux de phospho-MEK et RAF mutants dans les échantillons par immunoblots. REMARQUE: Le phospho-MEK peut également être quantifié en utilisant l'incorporation de P-ATP32. En bref, 10 'M'32P-ATP est ajouté au tampon de réaction kinase, et la quantité de MEK phosphorylé est ensuite quantifiée après la séparation de PAGE en utilisant l'autoradiographie standard, phosphorimaging, ou des techniques de comptage de scintillation liquide comme approprié.</li>
</ol>2. Mise à la co-activation de la RAF pour évaluer l'activité allostérique des mutants de la RAF morts de Kinase
<ol><li>Construire des vecteurs codant le récepteur RAF (domaine Kinase CRAF avec motif NtA non phosphoryltable, AAFF) ou les activateurs RAF kinase-morts (domaine kinase RAF avec motif NtA imité par phosphorylation, SSDD, DDEE ou DGEE) (Figure 1A) comme décrit à l'étape 1.1.</li>
	<li>Transfect 293T cellules avec deux vecteurs codant à la fois le récepteur RAF et l'activateur de la RAF kinase-mort ou un seul vecteur codant l'une des protéines telles que décrites dans les étapes 1.2 et 1.3.</li>
	<li>Remplacer le milieu de culture à 24 h après la transfection, et récolter 293T transfectants à 48 h pour préparer les lysates de la cellule entière comme décrit dans les étapes 1.4 et 1.5.</li>
	<li>Mélanger le lysate de cellules propres avec un tampon d'échantillon SDS de 5 x rapidement à température ambiante (25 oC) et faire bouillir à 90 oC pendant 5 min.</li>
	<li>Exécuter les échantillons de lysate de cellules entières bouillies dans 9-12% PAGE avec 0,1% SDS, transférer les protéines à la membrane de nitrocellulose, et de détecter les niveaux de phospho-ERK1/2 et contrôler les protéines par immunoblots.</li>
</ol>3. Analyse de Luciferase fractionnée complémentaire pour mesurer l'affinité relative de Dimer/Stabilité des mutants de RAF
<ol><li>Construire des vecteurs codant les mutants de la RAF marqués PAR LE FLAG fusionnés au terminus N de Nluc (N-terminus de luciferase luciferase, aa2-416) ou le terminus C de Cluc (terminus C de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase, aa398-550) comme décrit à l'étape 1.1.</li>
	<li>Transfect 293T cellules avec une paire de vecteurs codant différents mutants Nluc-RAF et mutants Cluc-RAF comme décrit à l'étape 1.2.</li>
	<li>À 24 h après la transfection, replate293T transfectants cellulaires dans des plaques d'image noir Krystal à la densité cellulaire de 2x105 par puits avec milieu sans couleur (c.-à-d., DMEM sans phénol rouge).</li>
	<li>24 h plus tard, ajouter la D-luciferine (0,2 mg/mL) aux transfectants cellulaires 293T, incuber pendant 30 min, et mesurer les signaux de luciferase à l'aide d'un système de détection multi (tableaudes matériaux).</li>
	<li>Après avoir mesuré les signaux de luciferase, aspirer le milieu et lyse retasses les transfectants 293T avec un tampon de lyse pour préparer les lysates de la cellule entière telles que décrites dans les étapes 1.4 et 1.5.</li>
	<li>Exécutez l'ensemble des échantillons de lysate cellulaire dans 9-12% PAGE avec 0,1% SDS et détecter les niveaux d'expression des mutants Nluc-RAF et Cluc-RAF mutants par immunoblot anti-FLAG tel que décrit à l'étape 2.5. Les niveaux d'expression relatifs des mutants DeLuc-RAF et des mutants de Cluc-RAF dans les transfectants 293T sont quantifiés en utilisant l'image J de leurs immunoblots.</li>
	<li>Normalisez les signaux de luciferase des transfectants de cellules 293T selon les niveaux d'expression des mutants De Nluc-RAF et des mutants de Cluc-RAF. En bref, ceci est réalisé en divisant le signal de luciferase brut par les niveaux d'expression relatifs des mutants de Nluc-RAF et des mutants de Cluc-RAF de l'étape 3.6.</li>
</ol>

<ol><li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li>
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<li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li>
<li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+kinases%3A+oncogenesis+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li>
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<li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alike+but+different%3A+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li>
<li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li>
<li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinases+and+pseudokinases%3A+lessons+from+RAF%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li>
<li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudokinases+from+a+structural+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li>
<li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li>
<li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795(2018).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li>
<li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF%28V600E%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li>
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<li>García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Interactions%3A+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li>
<li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+regulated+protein%E2%80%93protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li>
<li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li>
<li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF%2C+EGFR%2C+and+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Dans cet article, nous avons présenté trois méthodes pour caractériser les mutants de la RAF liés à la maladie, qui incluent l'analyse in vitro de kinase, l'analyse de co-activation de RAF, et l'analyse fractionnée gratuite de luciferase. Puisque les kinases de RAF ont l'activité catalytique et l'activité allosteric, divers mutants de RAF peuvent activer la signalisation en aval par deux mécanismes distincts13,14,16,<...

Les kinases de la famille RAF sont un composant clé de la cascade de signalisation RAS/RAF/MEK/ERK, qui transmet un signal de RAS pour activer la kinase protéine activée par mitogène (MEK)1,2,3,4. Cette famille de kinases joue un rôle crucial dans la croissance cellulaire, la survie et la différenciation, et leurs altérations induisent de nombreuses maladies, notamment le cancer5,6,7,8. Récemment, les séquençages génomiques ont identifié de nombreux mutants de la RAF liés à la maladie qui présentent des propriétés différentes dans la transmission du signal de la cascade RAS/RAF/MEK/ERK9,10,11. Une caractérisation minutieuse des mutants de la RAF nous aidera à comprendre les mécanismes moléculaires de la façon dont les mutants de la RAF modifient la production de signaux de la cascade RAS/RAF/MEK/ERK, et éventuellement choisir des approches appropriées pour traiter diverses maladies mutantes de la RAF.
Les kinases de la famille RAF comprennent trois membres, CRAF, BRAF, et ARAF, qui ont des structures moléculaires similaires, mais différentes capacités pour activer la signalisation en aval1,2,3,4. Parmi ces paralogs, BRAF a la plus forte activité en raison de son Formatement phosphorylé NtA (N-terminal acidic) motif12,13,14, tandis que l'ARAF a le plus bas l'activité découlant de son motif APE non canonique15. Ceci peut expliquer les différentes fréquences de mutation des paralogs de RAF dans les maladies : BRAF-gt;CRAF-gt;ARAF. En outre, au sein du même paralog de la RAF, les mutations dans différents sites peuvent déclencher la signalisation en aval de manièredistincte, ce qui ajoute une autre couche de complexité à la régulation des kinases familiales de la RAF. Des études récentes ont démontré que toutes les kinases de la RAF ont à la fois des activités catalytiques et allostériques13,14,16,17,18. Les mutants de la RAF constitutivement actifs allument la signalisation en aval directement en phosphorylisant MEK, tandis que les mutants de la RAF morts par kinase peuvent transactiver leurs homologues de type sauvage par dimerisation d'un côté à l'autre et activer la signalisation MEK-ERK16 ,19,20. L'affinité/stabilité dimère est un paramètre clé qui détermine non seulement l'activité allostérique des mutants de la RAF morts en kinase, mais affecte également l'activité catalytique des mutants de la RAF constitutivement actifs15,21, 22. Les mutants de la RAF morts par la kinase avec une affinité/stabilité élevée de dimère peuvent transactiver les RAF endogènes de type sauvage directement15, tandis que ceux avec l'affinité/stabilité intermédiaire de dimer exigent une coordination de Ras actif ou d'un niveau élevé de molécules de type sauvage RAF pour fonctionner13,15,20,21,23. De même, les mutants de la RAF constitutivement actifs phosphoryent MEK d'une manière dimère-dépendante, et ceux avec l'affinité/stabilité faible dimère perdent leur activité catalytique in vitro sur l'immunoprécipitation qui casse les dimers faibles de RAF15,, 21,22. L'affinité/stabilité dimère détermine également la sensibilité des mutants de RAF à leurs inhibiteurs, et corrèle positivement à la résistance des inhibiteurs de RAF24. Par conséquent, pour caractériser les mutants de la RAF liés à la maladie, il est nécessaire de mesurer leurs activités catalytiques et allostériques, et l'affinité dimer / stabilité.
Ces dernières années, notre laboratoire et d'autres ont développé diverses méthodes pour caractériser les kinases de la famille RAF et leurs mutants. Selon notre laboratoire et l'expérience d'autres personnes, nous pensons que les trois essais suivants ont des avantages à définir les mutants de la RAF liés à la maladie : (1) l'analyse in vitro de la kinase qui peut être effectuée facilement pour détecter l'activité catalytique de la maladie mutants actifs de la RAF15; (2) l'analyse de co-activation de la RAF qui est une méthode fiable et pratique pour mesurer l'activité allostérique des mutants de la RAF kinase-morts13,15,21,22,23, 25; (3) l'analyse de luciferase fractionnée gratuite qui a une sensibilité beaucoup plus élevée dans la mesure de l'affinité relative dimer / stabilité des mutants DE la RAF en contraste avec l'analyse traditionnelle co-immunoprécipitation, et est capable d'effectuer sans équipement de pointe dans contraste avec les méthodes d'analyse quantitative s'ils sont telles que l'analyse SPR (Surface Plasmon Resonance)15,22. En combinant ces trois essais, nous pouvons comprendre facilement comment un mutant de la RAF lié à la maladie modifie la signalisation en aval et ainsi utiliser une stratégie thérapeutique appropriée pour traiter la maladie causée par cette mutation de la RAF.

<table><tbody><tr><td>anti-phosphosphoERK1/2</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>anti-phosphoMEK1/2</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9154</td><td></td></tr><tr><td>anti-ERK1/2</td><td>AB clonal</td><td>A0229</td><td></td></tr><tr><td>anti-MEK1/2</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9124</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG(mouse)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anti-HA</td><td>Novus Biologicals</td><td>MAB6875</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG(Rabbit)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>14793</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta ;-actine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>billes anti-FLAG(M2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4596</td><td></td></tr><tr><td>HRP conjugué anti-souris Jackson</td><td>Laboratories</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugué anti-IgG de</td><td>lapin Jackson Laboratories</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>In vitrogen</td><td>V79020</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning&nbsp ; Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Roche</td><td>11 814 443 001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sans rouge de phénol</td><td>Invitrogen</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>D-luciférine&nbsp ;</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>6xhis-étiqueté MEK1 (K97A)</td><td>&nbsp ; préparé dans nos études précédentes</td><td>N.A.</td><td>Référence 15.</td></tr><tr><td>Système de détection GloMax-Multi.</td><td>Promega</td><td>E7041</td><td></td></tr></tbody></table>

caractériser les mutants liés à la maladie des kinases familiales de la raf en utilisant un ensemble de méthodes pratiques et réalisables

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Les kinases de la famille du fibrosarcome accéléré (RAF) jouent un rôle central dans la biologie cellulaire et leur dysfonctionnement conduit à des cancers et des troubles du développement. Une caractérisation des mutants de la RAF liés à la maladie nous aidera à choisir des stratégies thérapeutiques appropriées pour le traitement de ces maladies. Des études récentes ont montré que les kinases de la famille RAF ont à la fois des activités catalytiques et allostériques, qui sont étroitement réglementées par la dimerisation. Ici, nous avons construit un ensemble de méthodes pratiques et réalisables pour déterminer les activités catalytiques et allostériques et l'affinité relative dimer / stabilité des kinases de la famille RAF et de leurs mutants. Tout d'abord, nous avons modifié l'assay kinase in vitro classique en réduisant la concentration de détergent dans les tampons, en utilisant une procédure de lavage rapide doux, et en employant un glutathion S-transferase (GST) fusion pour empêcher les dissécages RAF de se dissocier pendant purification. Cela nous permet de mesurer l'activité catalytique des mutants de la RAF constitutivement actifs de manière appropriée. Deuxièmement, nous avons mis au point un nouvel essai de co-activation de la RAF pour évaluer l'activité allostérique des mutants de la RAF morts par la kinase en utilisant des protéines de la RAF tronquées n-terminales, éliminant ainsi l'exigence de Ras actif dans les protocoles actuels et réalisant ainsi une sensibilité. Enfin, nous avons généré un essai unique de luciferase fractionnée complémentaire pour mesurer quantitativement l'affinité relative dimère/stabilité de divers mutants de RAF, qui est plus fiable et sensible comparée à l'essai traditionnel de co-immunoprécipitation. En résumé, ces méthodes présentent les avantages suivants : (1) conviviale; (2) capable d'effectuer efficacement sans équipement de pointe; (3) rentable; (4) très sensible et reproductible.

Les kinases de la famille RAF ont des activités catalytiques et allostériques, qui permettent à leurs mutants liés à la maladie d'allumer la signalisation en aval par différents mécanismes13,14,16,17 ,18. Les mutants de la RAF, qui sont constitutifs, phosphoryent directement leurs substrats, tandis que les mutants de la RAF morts par la kinase remplissent leu...

Dans cet article, nous avons présenté un ensemble de méthodes pratiques et réalisables pour caractériser les mutants liés à la maladie des kinases de la famille raf, qui comprennent l'analyse in vitro de kinase, l'analyse de co-activation de RAF, et l'analyse de luciferase fractionnée complémentaire.

Caractériser les mutants liés à la maladie des kinases familiales de la RAF en utilisant un ensemble de méthodes pratiques et réalisables

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Cette méthode facilite la caractérisation efficace des méthodes de kinase de RAF liées à la maladie. Cette technique est très sensible et reproductible, rentable, conviviale, et ne nécessite aucun équipement de pointe. Pour mesurer l’activité catalytique des mutants de la RAF, introduisez des mutations technologiques du drapeau dans la séquence de codage de la RAF par PCR, avant d’insérer des séquences entières dans le vecteur approprié selon les protocoles standard.Insérez le glutathion comme séquence de codage transferase en amont des séquences de codage mutant de la RAF, pour générer des vecteurs codant le glutathion comme mutants de la RAF fusionnés transferase, de la même manière. Transvect 80% à 90% confluent 293T cultures cellulaires avec les vecteurs codant le drapeau marqué KINASEs RAF ou leurs mutants, selon les protocoles de normes. Après 24 heures de culture, remplacez le médium dans chaque culture.Après 48 heures de culture, ajouter 400 microlitres de tampon de lyse complétés par des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase, à chaque puits sur la glace. Après cinq à dix minutes, transférer la cellule lysates dans un tube de 1,5 millilitre pour centrifugation pour sédimenter les débris cellulaires. Transférer 300 microlitres de chaque échantillon dans des tubes individuels de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre.Mettre de côté 40 microlitres par échantillon pour la vente en gros en aval lysate fossile signal cellulaire supplémentaire réglementé kinase une et deux expression et l’activité amino blot analyse. Ajouter 20 microlitres de perles d’affinité anti-FLAG à chaque tube, pour une incubation d’une heure avec rotation dans une chambre froide de quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez rapidement et doucement les perles anti-drapeau une fois avec un tampon de lyse dans la chambre froide et une fois avec un tampon de réaction de kinase avant d’ajouter 20 microlitres de mélange de réaction de kinase.Graph Mutants avec une faible affinité Dima peut perdre leur activité catalytique in vitro en raison de la dissociation Dima. Par conséquent, le lavage rapide et doux est critique. Après 10 minutes à température ambiante avec retournement toutes les deux minutes, arrêter les réactions kinase avec cinq microlitres de cinq tampon échantillon XSDS, par échantillon et faire bouillir les échantillons à 90 degrés Celsius pendant cinq minutes.À la fin de l’incubation, exécuter les échantillons sur un gel d’électrophoresis polyacrylamide de 9 à 12 % avec 0,1 % de SDS, puis transférer les protéines dans une membrane de nitrocellulose pour permettre la détection des niveaux de kinase protéique activée par phospho mitogène et de mutants RAF dans chaque échantillon, par immunoblotting. Pour évaluer l’activité allosterique des mutants de la RAF morts de kinase, construisez des vecteurs codant le récepteur de la RAF ou les activateurs de la RAF morts de kinase. Transvect 293 cellules T avec deux vecteurs codant à la fois le récepteur RAF et l’activateur mort kinase RAF, ou un seul vecteur codant l’une des protéines comme démontré.Récolter la cellule entière lysates après 48 heures de culture comme démontré, et mélanger rapidement la cellule entière propre lysate avec cinq tampon échantillon XSDS à température ambiante, Avant de faire bouillir les lysates pendant cinq minutes à 90 degrés Celsius. Ensuite, exécutez les échantillons bouillis de lysate de cellules entières sur un gel d’électrophoresis de 9 à 12%polyacrylamide qui est 0.1%SDS et transférez les protéines à une membrane de nitrocellulose pour détecter les niveaux de phospho le signal cellulaire supplémentaire réglé kinase un et deux et les protéines de contrôle par le buvard immunisé comme démontré. Pour mesurer l’affinité relative de dimère et ou la stabilité des mutants de la RAF construire des vecteurs codant mutants projet de technologie drapeau fusionné au terminus de Firefly luciferase ou le Terminus C une luciferase luciferase luciferase firefly.Transvect 293 cellules T avec une paire de vecteurs codant différents et Terminus de mutants firefly luciferase RAF et C Terminus une luciferase luciferase MUTANTS RAF comme démontré. 24 heures après la transvection replater deux fois 10 à la cinquième 293 transactions de cellules T par puits en plaques d’image noir cristal dans le milieu sans couleur. 48 heures après la transvestion ajouter la luciferine à 293 transvectents à cellules T et incuber pendant 30 minutes.Avant de mesurer les signaux de luciferase sur un système de détection multi. À la fin de la mesure aspirer les supernatents, et blice les 293 cellules T traitées avec tampon lysas comme démontré. Exécutez les échantillons entiers de lysate de cellules sur un gel d’électrophoresis de polyacrylamide de neuf à 12%avec 0.1%SDS.Détecter les niveaux d’expression du terminus final des mutants firefly luciferase RAF, ou le terminus C des mutants firefly luciferase RAF par tache anti-drapeau aminé comme démontré. Ensuite, normalisez les signaux de luciferase des 293 transvectants à cellule T en fonction des niveaux d’expression du terminus final de Firefly luciferase et C terminus des mutants firefly luciferase RAF. Le kinase asa in vitro peut être utilisé pour sonder efficacement l’activité catalytique de certains mutants constitutifs actifs de la colonne vertébrale R, mais pas celle des mutants morts kinase avec une colonne vertébrale C fusionnée.L’activité catalytique des mutants de raf constitutifs actifs avec une affinité ou une stabilité faible de dimère cependant, pourrait ne pas être sondée en utilisant cet ASA car leurs dimers sont cassés pendant le processus de purification. Pour éviter la perte d’activité catalytique des mutants de la RAF avec une faible affinité ou stabilité dimer, ces mutants peuvent être fusionnés avec glutothionas transferase pour sauver l’activité catalytique des mutants. L’ASA de co-activation de raf peut être employée pour évaluer l’activité allosteric des mutants morts de RAF de kinase.Comme les mutants morts kinase illustrés avec un motif terminal d’extrémité acide et la fusion de la colonne vertébrale C, fonctionnent comme activateurs allosteriques pour déclencher l’activité catalytique des mutants avec un motif terminal acide non phosphore relatable, lorsqu’il est co-exprimé dans les cellules 293T. En outre, un luciferase SA split gratuit peut être utilisé pour mesurer l’affinité relative dimer ou la stabilité des kinases de la famille RAF et de leurs mutants. L’utilisation d’un tampon de lysas avec une faible concentration de détergent, et une procédure de lavage rapide douce pendant la purification de l’échantillon est essentielle pour un succès in vitro kinase SA. Cette technique aidera les chercheurs à déterminer précisément comment la maladie relaie les mutants de la RAF, active la voie en aval, facilitant la sélection de stratégies thérapeutiques appropriées pour le traitement de la maladie.

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Caractériser les mutants liés à la maladie des kinases familiales de la RAF en utilisant un ensemble de méthodes pratiques et réalisables (Vidéo) | JoVE Journal

Caractériser les mutants liés à la maladie des kinases familiales de la RAF en utilisant un ensemble de méthodes pratiques et réalisables

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