Analyse de la localisation spliceosomale snRNA dans les cellules humaines d'Hela utilisant la microinjection

Ici, nous avons appliqué la microinjection d’ARN étiquetés fluorescents pour détecter les séquences d’ARN qui sont essentielles à la localisation des ARN nucléaires courts dans des structures nucléaires appelées corps cajal. Cette technique présente deux avantages majeurs. Tout d’abord, il peut être appliqué pour les ARN courts qui sont par ailleurs difficiles à étiqueter et à suivre.

Et deuxièmement, il permet le dépistage rapide de différentes séquences et de tester leur rôle dans la localisation de l’ARN. Un jour avant la microinjection, les graines HeLa ou d’autres cellules adhérentes sur des coverslips de 12 millimètres pour atteindre 50% de confluence au moment de la microinjection. Pour commencer, placez un coverslip préparé au centre d’une boîte de Petri, ajoutez des cellules et deux millimètres de médias culturels.

Le lendemain, placez la boîte de Pétri remplie de cellules sur une scène de microscope. À l’aide d’un microchargeur, charger trois microlitres du mélange de snRNA dans l’aiguille et installer l’aiguille dans le support du microinjecteur à un angle de 45 degrés par rapport à la surface de la boîte de Pétri. Utilisez un objectif 10X longue distance pour trouver l’aiguille.

Tout d’abord, réglez la vitesse grossière sur l’injecteur et abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche le milieu de culture. À l’aide des jumelles au microscope, trouvez le point lumineux qui est l’endroit où l’aiguille touche le milieu de culture. Changez la vitesse pour affiner et abaisser davantage l’aiguille tout en regardant dans le microscope jusqu’à ce que le bout de l’aiguille soit observé.

Déplacez l’aiguille au milieu du champ visuel et passez à un objectif 40X longue distance. Après cela, sélectionnez la cellule et déplacez l’aiguille au-dessus de la cellule. Réglez la pression et le temps pour le contact cellulaire.

Déplacez l’aiguille vers le bas dans la cellule, puis réglez la limite inférieure du micromanipulateur. La fixation de la limite inférieure est la partie la plus critique du protocole. Parce que la surface de coverslip n’est pas parfaite et parce que chaque cellule est différente, vous devrez définir la limite inférieure plusieurs fois pendant la session d’injection.

Ensuite, déplacez l’aiguille au-dessus de la cellule et appuyez sur le bouton d’injection sur le joystick de l’injecteur. L’aiguille se déplacera automatiquement à l’intérieur de la cellule à l’endroit où la limite est définie pour injecter le mélange d’ARN. Pour terminer, appuyez sur le bouton du menu sur l’injecteur et retirez l’aiguille du support.

Déconnectez ensuite le tube de l’injecteur avant d’éteindre l’injecteur et le micromanipulateur. Après la microinjection, retourner les cellules dans un incubateur de dioxyde de carbone et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, rincez les cellules trois fois avec du PBS à température ambiante.

Fixer les cellules pendant 20 minutes avec 4% de paraformaldéhyde dans 0,1 tuyaux molaires au pH 6,9. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec la température ambiante PBS. Si seule la localisation de l’ARNN est analysée, rincez brièvement les cellules à l’eau et montez dans un milieu de montage avec DAPI.

En cas de localisation supplémentaire des protéines, perméabiliser les cellules avec 0,5%Triton X-100 en PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Rincez les cellules trois fois avec du PBS et tachez-les avec les anticorps primaires et secondaires appropriés tels que décrits dans le protocole de texte. Rincez ensuite trois fois avec PBS et rincez une fois à l’eau.

Après cela, monter les cellules dans un milieu de montage avec DAPI. Lorsque vous êtes prêt à l’image, utilisez un système microscopique de fluorescence haut de gamme équipé d’un objectif d’immersion pour acquérir les images. Une fois que les cellules microinjectées sont identifiées, recueillir une pile de 20 sections Z avec 200 étapes Z nanométriques par échantillon et soumis à la déconvolution mathématique.

Pour quantifier le signal fluorescent, ouvrez d’abord l’image de microscopie dans ImageJ et divisez les canaux en fenêtres. Synchronisez les fenêtres par l’outil de fenêtre de synchronisation. Ensuite, dessinez la région d’intérêt autour d’un corps de Cajal identifié par immunostaining de bobine.

Mesurer l’intensité du signal snRNA dans le retour sur investissement défini par la bobine. Déterminer l’intensité de la fluorescence du snRNA dans le retour sur investissement placé au hasard dans le nucléoplasme. Enregistrez les valeurs mesurées et calculez le rapport du signal d’ARN dans le corps et le nucléoplasme de Cajal.

Dans cette étude, les snARN étiquetés fluorescents sont microinjectés afin de surveiller leur transport à l’intérieur de la cellule. Pour vérifier si le site SM est important pour l’accumulation du corps de Cajal, l’ARN snRNA dépourvu du site SM est microinjecté directement dans le noyau. L’injection dans le cytoplasme sert de contrôle tandis que l’ARN snRNA pleine longueur est microinjecté pour servir de contrôle positif.

Après incubation, les cellules microinjectées sont fixées et la bobine du marqueur du corps cajal est visualisée par immunofluorescence indirecte. Le snRNA pleine longueur s’est accumulé dans les corps de Cajal après des injections nucléaires et cytoplasmiques. En revanche, le snRNA n’ayant pas le site SM est resté dans le cytoplasme après microinjection dans ce compartiment tandis que la microinjection nucléaire de snRNA sans le site SM révèle que la séquence de liaison SM est importante pour la localisation du corps de Cajal car ce snRNA reste dans le noyau mais ne s’accumule pas dans les corps de Cajal.

Parfois, la microinjection dans un seul compartiment cellulaire échoue et trompé Dextran 70 kilodalton peut être trouvé à la fois dans le noyau et le cytoplasme. Ces cellules sont écartées d’une analyse plus approfondie. Malgré le fait que les snARN étiquetés fluorescents sont stockés à 80 degrés Celsius négatifs avant l’injection, la dégradation de l’ARN peut se produire.

Le snRNA dégradé injecté dans le cytoplasme n’est pas transporté dans le noyau et reste localisé dans le cytoplasme. Un tel ARNN doit être rejeté et un nouvel ARNn doit être synthétisé. Il est important d’ajuster correctement les pressions d’injection et de compensation pour votre type de cellule.

Et comme dit auparavant, fixer une limite inférieure correcte pour l’injection cellulaire est essentiel pour une bonne microinjection. S’il vous plaît rappelez-vous que le phénol-chloroforme utilisé pendant l’isolement de l’ARN est dangereux et que l’aiguille de microinjection est un objet pointu. Soyez prudent lors de la manipulation de ces matériaux.