Name: Analyse de la localisation spliceosomale snRNA dans les cellules humaines dHela utilisant la microinjection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Découvrez la microinjection d'ARN fluorescents pour étudier la localisation des snRNA épissosomaux dans les corps de Cajal des cellules HeLa. Cette méthode permet d'identifier les séquences essentielles au transport nucléaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par la Fondation tchèque pour la science (18-10035S), le Programme national de développement durable I (LO1419), le soutien institutionnel (RVO68378050), le Fonds européen de développement régional (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16-013/0001775) et l'Agence de subventions de Université Charles (GAUK 134516). Nous reconnaissons en outre le Centre de microscopie légère, IMG CAS, Prague, République tchèque (soutenu par des subventions (Czech-Bioimaging - LM2015062).

1. Préparation des snARN pour la microinjection
<ol><li>Préparer un modèle d'ADN contenant la version intégrale ou tronquée/mutée de l'ARNs par PCR à l'aide d'une configuration PCR suivante : 98 oC pour 60 s, 98 oC pour 15 s, 68 oC pour 30 s, 72 oC pour 1 min, 98 oC pour 15 s pour 35x , et 72 oC pendant 5 min.</li>
	<li>L'apprêt avant doit contenir une séquence de promoteur pour la transcription in vitro juste en amont du premier nucléotide transcrit. Amplifiez la séquence snRNA de U2 à l'aide de l'amorce avant contenant le promoteur T7 et l'amorce inverse, qui se termine par le dernier nucléotide transcrit (voir tableau des matériaux pour plus de détails).</li>
	<li>Synthétiser l'ARS à l'aide d'un kit pour la synthèse à court ARN (voir tableau des matériaux pour plus de détails) contenant la polymérase d'ARN T7. Ajouter 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimethylguanosine cap analogue (m32,2,7G(5')ppp(5')G), 1 mL d'un inhibiteur d'ARN et 500-700 ng du modèle d'ADN au mélange de réaction et d'incubation à 37 oC pendant la nuit.</li>
	<li>Ajouter 1 l (2U) de DNase dans la réaction et couver pendant 15 min supplémentaires à 37 oC.</li>
	<li>Isoler le snRNA par extraction acide de phénol/chloroforme. Retirez la phase supérieure de l'eau et ajoutez 1/10 du volume initial de 3 M d'acétate de sodium (pH à 5,2), 3 l de glycogène pour une meilleure visualisation des granulés et 2,5 volumes d'éthanol à 100 %. Incuber pendant 1 h à -80 oC, centrifugeuse pendant 10 min à 14 000 x g et 4 oC.</li>
	<li>Laver la pastille avec 70 % d'éthanol et dissoudre dans 12 L d'eau exempte de nucléane. Le rendement habituel d'ARN était d'environ 600 ng/mL. Conserver à -80 oC.</li>
	<li>Surveiller l'intégrité des snARN transcrits in vitro par électrophores de gel d'agarose.</li>
	<li>Avant la microinjection, diluer l'ARN jusqu'à la concentration finale de 200 ng/mL dans de l'eau contenant 10 g/L dextran-TRITC 70 kDa.</li>
</ol>2. Cellules
<ol><li>Avant l'utilisation, traiter les rémaquilles avec 1 M HCl pendant 1 h, laver soigneusement dans de l'eau distillée et les conserver dans 100 % d'éthanol. Le traitement acide favorise l'adhérence des cellules pour empêcher l'épluchage cellulaire pendant ou après l'injection. Pour une identification plus facile des cellules injectées, utilisez un bordereau avec une grille.</li>
	<li>HeLa de graine ou d'autres cellules adhérentes 1 jour avant la microinjection sur des couvertures de 12 mm (no 1 ou no. 1.5) pour atteindre 50% de confluency au moment de la microinjection.</li>
</ol>3. Injection
REMARQUE: Les cellules HeLa ont été microinjectées dans le médium d'aigle modifié du Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L D-glucose contenant du rouge phénol et des antibiotiques). L'injection a été effectuée à l'aide d'un injecteur et d'un micromanipulateur équipé de l'aiguille stérile (voir tableau des matériaux pour plus de détails). L'ensemble du système microscopique/micromanipulateur a été préchauffé à 37 oC pendant au moins 4 h afin d'éviter la fluctuation des différentes parties du microscope et du micro-injecteur.
<ol><li>Mettre le plat Petri (30 mm) contenant 2 ml de milieu de culture avec la couverture au milieu dans le support du microscope. Chargez 3 ll de mélange de snRNA dans l'aiguille à l'aide d'un microchargeur. Installez l'aiguille dans le support du micro-injecteur à 45 degrés par rapport à la surface du plat Petri.</li>
	<li>Pour trouver l'aiguille, utilisez un objectif 10x longue distance. Tout d'abord, définir la vitesse COARSE sur l'injecteur et abaisser l'aiguille jusqu'à ce qu'il touche le milieu de culture. À l'aide des jumelles au microscope, trouver la tache lumineuse, qui est l'endroit où l'aiguille touche le milieu de culture.</li>
	<li>Changez la vitesse à FINE et abaissez davantage l'aiguille tout en regardant dans le microscope jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille soit observée. Déplacez l'aiguille au milieu du champ visuel et passez à un objectif 40x longue distance.</li>
	<li>Après avoir changé l'objectif, sélectionnez la cellule et déplacez l'aiguille au-dessus de cette cellule. Définir les pressions et le temps pour le contact cellulaire (voir Conseils et dépannage en discussion).</li>
	<li>Déplacez l'aiguille vers le bas dans la cellule, puis définir la limite inférieure sur le micromanipulateur. Veillez à ne pas déplacer l'aiguille sous la cellule.</li>
	<li>Après avoir fixé la limite inférieure, déplacez l'aiguille au-dessus de la cellule et appuyez sur le bouton d'injection sur le joystick de l'injecteur. L'aiguille se déplace automatiquement à l'intérieur de la cellule à l'endroit où la limite est fixée et injecte le mélange d'ARN.</li>
	<li>Pour finir, appuyez sur le bouton MENU sur l'injecteur et retirez l'aiguille du support. Débranchez ensuite le tube de l'injecteur avant d'éteindre l'injecteur et le micromanipulateur.</li>
</ol>4. Fixation cellulaire et coloration
<ol><li>Après la microinjection, retourner les cellules dans un incubateur de CO2 et incuber à 37 oC pendant 1 h.</li>
	<li>Après l'incubation, rincer les cellules trois fois avec la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) à température ambiante, fixer pendant 20 min avec 4% de paraformaldéhyde dans 0.1 M PIPES pH 6.9, et laver trois fois avec la température ambiante PBS. Si seulement la localisation de snRNA est analysée, rincez brièvement les cellules dans l'eau et montez dans un milieu de montage avec DAPI.</li>
	<li>En cas de localisation supplémentaire des protéines, perméabiliser les cellules avec 0,5% Triton-X100 en PBS pendant 5 min à température ambiante. Après trois rinçaments avec PBS, incuber les cellules avec des anticorps primaires et secondaires et après les lavages finaux en PBS et le rinçament bref dans l'eau, monter dans un milieu de montage avec DAPI.</li>
</ol>5. Microscopie
<ol><li>S'il n'est pas photographié immédiatement après le montage, rangez les diapositives à 4 oC jusqu'à l'imagerie.</li>
	<li>Acquérir des images à l'aide d'un système microscopique à fluorescence haut de gamme équipé d'un objectif d'immersion (60X ou 100x/1.4NA).</li>
	<li>Une fois les cellules microinjectées identifiées, collectez une pile de 20 z-sections avec 200 nm z par échantillon et soumises à une déconvolution mathématique. Des projections maximales ou des piles z individuelles ont ensuite été présentées.</li>
	<li>Pour quantifier le signal fluorescent, dessinez Région d'intérêt (ROI) autour d'un corps cajal identifié par l'immunostaining de coilin. Mesurez l'intensité du signal snRNA dans le retour sur investissement défini par la bobine. Déterminer ensuite l'intensité de la fluorescence de l'ARNde dans le retour sur investissement placé au hasard dans le nucléoplasme et calculer le rapport de signal d'ARN dans le corps cajal et le nucléoplasme.</li>
</ol>

<ol><li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li>
<li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li>
<li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+bodies%3A+news+insights+into+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curentr+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li>
<li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li>
<li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li>
<li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs%3A+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li>
<li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5%27-to-3%27+exonucleolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+message+clear%3A+visualizing+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li>
<li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+U4%2FU6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Nous avons employé la microinjection des snRNAs fluorescents pour déterminer des séquences importantes pour la localisation de snRNA dans les corps nucléaires de Cajal. En raison de la préparation rapide et assez simple des ARN étiquetés (préparation du modèle d'ADN par PCR suivi de la transcription in vitro), la méthode offre une analyse efficace de la façon dont les différentes séquences contribuent à la localisation de l'ARN. En relativement peu de temps, nous avons pu analyser dix suppressions ou substitutions différ...

L'épissage de l'ARN est l'une des étapes cruciales dans l'expression des gènes, qui est catalysée par un grand complexe de ribonucléoprotéines appelé l'épiscédsome. Au total, plus de 150 protéines et 5 petits ARN nucléaires (ARNN) sont intégrés dans l'épisséoce à différents stades de la voie d'épissage. Les snRNAS U1, U2, U4, U5 et U6 participent à l'épissage des principaux introns GU-AG. Ces snRNAs se joignent à l'épiscédsome comme petites particules de ribonucléoprotéines nucléaires préformées (snRNPs) qui contiennent de l'ARNs, sept protéines Sm associées à l'ARSS (ou protéines Like-Sm, qui s'associent à l'ARNT U6) et 1-12 protéines spécifiques pour chaque snRNP.
L'assemblage des snRNPs implique des étapes cytoplasmiques et nucléaires. L'ARS nouvellement transcrit est exporté vers le cytoplasme où il acquiert un anneau assemblé à partir de sept protéines Sm. L'anneau Sm sert par la suite de signal pour la réimportation de l'ARNds vers le noyau. Les snARN défectueux qui ne s'associent pas aux protéines Sm sont conservés dans le cytoplasme1. Les snRNP nouvellement importés apparaissent pour la première fois dans le corps de Cajal où ils rencontrent des protéines spécifiques au snRNP et terminent leur maturation (revue en référence2,3). Nous avons récemment montré que l'inhibition des étapes finales de maturation entraîne la séquestration des snRNPs immatures dans les corps de Cajal4,5. Nous avons proposé un modèle où la maturation finale de snRNP est sous contrôle de qualité qui surveille l'addition des protéines snRNP-spécifiques et la formation des snRNPs actifs. Cependant, les détails moléculaires de la façon dont les cellules font la distinction entre les particules matures et immatures aberrantes correctement assemblées restent insaisissables.
Pour déterminer les séquences d'ARNs qui sont essentielles pour le ciblage et l'accumulation des ARNs dans les corps nucléaires de Cajal, nous avons décidé d'utiliser la microinjection de snRNAs fluorescents. La microinjection était une méthode de choix parce que : 1) il ne faut pas une étiquette de séquence supplémentaire pour distinguer les snRNAs synthétiques forment leurs homologues endogènes qui est particulièrement important pour les ARN courts avec peu d'espace pour l'insertion de séquence supplémentaire d'étiquette ; 2) il permet l'analyse des séquences qui sont importantes pour la biogenèse. Par exemple, la séquence Sm est essentielle pour l'assemblage de l'anneau Sm et la réimportation dans le noyau6. Lorsque les snRNAS sont exprimés dans la cellule, les snRNAs dépourvus de la séquence Sm sont dégradés dans le cytoplasme et n'atteignent pas le noyau et les corps cajal7. Cependant, les snRNAs sans la séquence Sm peuvent être directement microinjectés dans le noyau et donc un rôle potentiel de la séquence Sm dans la localisation du corps Cajal a été mis en compte.
Ici, nous décrivons en détail une méthode de microinjection que nous avons appliquée pour déterminer les séquences snRNA nécessaires pour cibler les ARNs dans le corps cajal5. Nous avons montré que les sites de liaison Sm et SMN sont ensemble nécessaires et suffisants pour localiser non seulement les ARN, mais aussi divers ARN courts non codants dans le corps de Cajal. Sur la base de la microinjection ainsi que d'autres preuves, nous avons proposé que l'anneau Sm assemblé sur le site de liaison Sm est le signal de localisation du corps Cajal.

<table><tbody><tr><td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td><td>ThermoFisher</td><td>C11403</td><td>Concentration de stock 1 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium - high glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>Contenant 4,5 g&frasl ; L D-glucose, Phénol rouge et antibiotiques</td></tr><tr><td>FemtoJet express Injecteur</td><td>Eppendorf</td><td>5247000013</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td>Aiguille de micro-injection de 0,5 & micro ; m intérieur et 0,7 & micro ; m diamètre extérieur</td></tr><tr><td>Fluoromont G avec DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9510</td><td>Concentration de stock 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Lamelles en verre quadrillé</td><td>Ibidi</td><td>10817</td><td>Lamelles avec une grille, pas d’expérience directe avec celles-ci</td></tr><tr><td>Micromanipulateur InjectMan NI 2</td><td>Eppendorf</td><td>5181000017</td><td></td></tr><tr><td>m3-2,2,7G(5')ppp(5')G chapeau triméthylé analogue</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-853-1</td><td>Concentration de stock 40 mM</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Kit de transcription</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Lunettes de protection de microscope 12 mm, n° 1</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>111520</td><td>Pour le travail de routine</td></tr><tr><td>Lunettes de protection de microscope 12 mm, n° 1.5</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>117520</td><td>Pour haute résolution d’images</td></tr><tr><td>Microscope DeltaVision</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Pour l’acquisition d’images</td></tr><tr><td>Microscope DMI6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Pour la micro-injection</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde 32 % solution EM grade</td><td>EMS</td><td>15714</td><td>Dissous dans PIPES jusqu’à la concentration finale 4</td></tr><tr><td> %Phénol :Chloroforme 5:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Amorces pour l’amplification U2 : Avant : 5'-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Arrière : 5&aigu ; TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>T7 séquence rpromoter en italique</td></tr><tr><td>Phusion Haute Fidélité ADN polymérase</td><td>BioLab</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>Concentration de stock 40 mM</td></tr><tr><td>Isothiocyanate de tétraméthylrhodamine Dextran 65-85 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1162</td><td>Dissous dans l’eau, concentration de base 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Serva</td><td>37240</td><td>Dissous dans l’eau, concentration de la matière 10 %</td></tr></tbody></table>

analyse de la localisation spliceosomale snrna dans les cellules humaines d'hela utilisant la microinjection

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

La biogenèse des snRNAr spliceosomal est un processus complexe impliquant des phases nucléaires et cytoplasmiques et la dernière étape se produit dans un compartiment nucléaire appelé le corps de Cajal. Cependant, les séquences qui dirigent la localisation de l'ARNs dans cette structure sous-nucléaire n'ont pas été connues jusqu'à récemment. Pour déterminer des séquences importantes pour l'accumulation des snRNAs dans les corps de Cajal, nous avons employé la microinjection des snRNAs fluorescents étiquetés suivis de leur localisation à l'intérieur des cellules. Tout d'abord, nous avons préparé des mutants de suppression de snRNA, synthétisé des modèles d'ADN pour la transcription in vitro et snRNAs transcrits en présence de l'UTP couplé avec Alexa488. Les snARN étiquetés ont été mélangés avec 70 kDa-Dextran conjugués avec TRITC, et microinjectés au noyau ou au cytoplasme des cellules humaines de HeLa. Les cellules ont été incubées pendant 1 h et fixes et la coiline de marqueur de corps de Cajal a été visualisée par immunofluorescence indirecte, alors que les snARN et le dextran, qui sert de marqueur de l'injection nucléaire ou cytoplasmique, ont été observés directement utilisant une microscope fluorescence. Cette méthode permet des tests efficaces et rapides de la façon dont diverses séquences influencent la localisation de l'ARN à l'intérieur des cellules. Ici, nous montrons l'importance de la séquence Sm-contraignante pour une localisation efficace des arnaques dans le corps cajal.

Pour surveiller la localisation de snRNA et le rôle du site de liaison de Sm dans le ciblage de corps de Cajal, nous avons préparé un modèle d'ADN contenant le promoteur de T7 et l'ARNs de S2 pleine longueur ou le snRNA de U2 manquant les sept nucléotides (AUUUUUG) formant le site de liaison de Sm. les snRNAs ont été transcrits in vitro, isolés et mélangés avec le dextran-70kDa TRITC-coupled. Nous avons microinjecté le mélange contenant l'ARNs transcrit in vitro dans le noyau ou le cytoplasme des cellules de HeLa.
<p...

La biogenèse des snRNAr spliceosomal est un processus complexe impliquant divers compartiments cellulaires. Ici, nous avons utilisé la microinjection de snRNAs fluorescents afin de surveiller leur transport à l'intérieur de la cellule.

Analyse de la localisation spliceosomale snRNA dans les cellules humaines d'Hela utilisant la microinjection

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Ici, nous avons appliqué la microinjection d’ARN étiquetés fluorescents pour détecter les séquences d’ARN qui sont essentielles à la localisation des ARN nucléaires courts dans des structures nucléaires appelées corps cajal. Cette technique présente deux avantages majeurs. Tout d’abord, il peut être appliqué pour les ARN courts qui sont par ailleurs difficiles à étiqueter et à suivre.Et deuxièmement, il permet le dépistage rapide de différentes séquences et de tester leur rôle dans la localisation de l’ARN. Un jour avant la microinjection, les graines HeLa ou d’autres cellules adhérentes sur des coverslips de 12 millimètres pour atteindre 50% de confluence au moment de la microinjection. Pour commencer, placez un coverslip préparé au centre d’une boîte de Petri, ajoutez des cellules et deux millimètres de médias culturels.Le lendemain, placez la boîte de Pétri remplie de cellules sur une scène de microscope. À l’aide d’un microchargeur, charger trois microlitres du mélange de snRNA dans l’aiguille et installer l’aiguille dans le support du microinjecteur à un angle de 45 degrés par rapport à la surface de la boîte de Pétri. Utilisez un objectif 10X longue distance pour trouver l’aiguille.Tout d’abord, réglez la vitesse grossière sur l’injecteur et abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche le milieu de culture. À l’aide des jumelles au microscope, trouvez le point lumineux qui est l’endroit où l’aiguille touche le milieu de culture. Changez la vitesse pour affiner et abaisser davantage l’aiguille tout en regardant dans le microscope jusqu’à ce que le bout de l’aiguille soit observé.Déplacez l’aiguille au milieu du champ visuel et passez à un objectif 40X longue distance. Après cela, sélectionnez la cellule et déplacez l’aiguille au-dessus de la cellule. Réglez la pression et le temps pour le contact cellulaire.Déplacez l’aiguille vers le bas dans la cellule, puis réglez la limite inférieure du micromanipulateur. La fixation de la limite inférieure est la partie la plus critique du protocole. Parce que la surface de coverslip n’est pas parfaite et parce que chaque cellule est différente, vous devrez définir la limite inférieure plusieurs fois pendant la session d’injection.Ensuite, déplacez l’aiguille au-dessus de la cellule et appuyez sur le bouton d’injection sur le joystick de l’injecteur. L’aiguille se déplacera automatiquement à l’intérieur de la cellule à l’endroit où la limite est définie pour injecter le mélange d’ARN. Pour terminer, appuyez sur le bouton du menu sur l’injecteur et retirez l’aiguille du support.Déconnectez ensuite le tube de l’injecteur avant d’éteindre l’injecteur et le micromanipulateur. Après la microinjection, retourner les cellules dans un incubateur de dioxyde de carbone et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, rincez les cellules trois fois avec du PBS à température ambiante.Fixer les cellules pendant 20 minutes avec 4% de paraformaldéhyde dans 0,1 tuyaux molaires au pH 6,9. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec la température ambiante PBS. Si seule la localisation de l’ARNN est analysée, rincez brièvement les cellules à l’eau et montez dans un milieu de montage avec DAPI.En cas de localisation supplémentaire des protéines, perméabiliser les cellules avec 0,5%Triton X-100 en PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Rincez les cellules trois fois avec du PBS et tachez-les avec les anticorps primaires et secondaires appropriés tels que décrits dans le protocole de texte. Rincez ensuite trois fois avec PBS et rincez une fois à l’eau.Après cela, monter les cellules dans un milieu de montage avec DAPI. Lorsque vous êtes prêt à l’image, utilisez un système microscopique de fluorescence haut de gamme équipé d’un objectif d’immersion pour acquérir les images. Une fois que les cellules microinjectées sont identifiées, recueillir une pile de 20 sections Z avec 200 étapes Z nanométriques par échantillon et soumis à la déconvolution mathématique.Pour quantifier le signal fluorescent, ouvrez d’abord l’image de microscopie dans ImageJ et divisez les canaux en fenêtres. Synchronisez les fenêtres par l’outil de fenêtre de synchronisation. Ensuite, dessinez la région d’intérêt autour d’un corps de Cajal identifié par immunostaining de bobine.Mesurer l’intensité du signal snRNA dans le retour sur investissement défini par la bobine. Déterminer l’intensité de la fluorescence du snRNA dans le retour sur investissement placé au hasard dans le nucléoplasme. Enregistrez les valeurs mesurées et calculez le rapport du signal d’ARN dans le corps et le nucléoplasme de Cajal.Dans cette étude, les snARN étiquetés fluorescents sont microinjectés afin de surveiller leur transport à l’intérieur de la cellule. Pour vérifier si le site SM est important pour l’accumulation du corps de Cajal, l’ARN snRNA dépourvu du site SM est microinjecté directement dans le noyau. L’injection dans le cytoplasme sert de contrôle tandis que l’ARN snRNA pleine longueur est microinjecté pour servir de contrôle positif.Après incubation, les cellules microinjectées sont fixées et la bobine du marqueur du corps cajal est visualisée par immunofluorescence indirecte. Le snRNA pleine longueur s’est accumulé dans les corps de Cajal après des injections nucléaires et cytoplasmiques. En revanche, le snRNA n’ayant pas le site SM est resté dans le cytoplasme après microinjection dans ce compartiment tandis que la microinjection nucléaire de snRNA sans le site SM révèle que la séquence de liaison SM est importante pour la localisation du corps de Cajal car ce snRNA reste dans le noyau mais ne s’accumule pas dans les corps de Cajal.Parfois, la microinjection dans un seul compartiment cellulaire échoue et trompé Dextran 70 kilodalton peut être trouvé à la fois dans le noyau et le cytoplasme. Ces cellules sont écartées d’une analyse plus approfondie. Malgré le fait que les snARN étiquetés fluorescents sont stockés à 80 degrés Celsius négatifs avant l’injection, la dégradation de l’ARN peut se produire.Le snRNA dégradé injecté dans le cytoplasme n’est pas transporté dans le noyau et reste localisé dans le cytoplasme. Un tel ARNN doit être rejeté et un nouvel ARNn doit être synthétisé. Il est important d’ajuster correctement les pressions d’injection et de compensation pour votre type de cellule.Et comme dit auparavant, fixer une limite inférieure correcte pour l’injection cellulaire est essentiel pour une bonne microinjection. S’il vous plaît rappelez-vous que le phénol-chloroforme utilisé pendant l’isolement de l’ARN est dangereux et que l’aiguille de microinjection est un objet pointu. Soyez prudent lors de la manipulation de ces matériaux.

analysis-spliceosomal-snrna-localization-human-hela-cells-using

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

En raison de la nature transitoire de pré-ARNm, il peut être difficile d'isoler et...

Un rapide à haut débit Méthode de cartographie ribonucléoprotéines (RNP) sur l&#39;homme pré-ARNm

Nous décrivons ici un test qui utilise la puissance du micro-injection couplé à...

Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

ARN L’hybridation in situ (ISH) permet de visualiser les ARN dans les cellules et les tissus. Nous montrons ici comment la combinaison de l’ARNASCOPE ISH avec l’immunohistochimie ou les colorants histologiques peut être utilisée avec succès pour détecter les ARNm localisés aux axones dans des sections de cerveaux de souris et d’humains.

Détection de axonaux localisée ARNm dans les sections de cerveau en utilisant haute résolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation

Un protocole in situ (ISH) de l’hybridation qui utilise courts oligonucléotides antisens pour détecter les modes épissage alternatif pré-ARNm dans les sections de cerveau de souris est décrite.

Analyse quantitative de l’épissage alternatif pré-ARNm dans les Sections de cerveau de souris à l’aide de RNA essai In Situ hybridation avec

Nous décrivons ici une analyse de l’hybridation in situ qui permet la détection sensible et spécifique des séquences aussi courtes que 50 nucléotides avec résolution de simple-nucléotide au niveau unicellulaire. L’analyse, qui peut être réalisé manuellement ou automatiquement, pouvez activer la visualisation des variants d’épissage, courtes séquences et des mutations dans le cadre de tissu.

Visualisation des Variants génétiques, quelques cibles et des Mutations ponctuelles dans le cadre de tissu morphologique avec un ARN essai In Situ hybridation avec

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour générer un modèle de système dans lequel la transcription d’un gène endogène d’intérêt peut être conditionnellement contrôlée dans les animaux vivants ou de cellules à l’aide d’activator, renforcée lac répresseur et tet .

Application in vivo de la système de télécommande pour la Manipulation d’Expression des gènes endogènes

Pour compter reproductible les numéros des ARNm dans les ovocytes, in situ en fluorescence seule molécule RNA hybridation (RNA-poisson) a été optimisée pour les cellules non adhérentes. Ovocytes ont été recueillis, hybridaient avec des sondes spécifiques de transcription et quantifiées à l’aide d’un logiciel de quantification d’image.

Utilisation d’unique molécule fluorescente hybridation In Situ (FISH-SM) afin de quantifier et Localize ARNm dans les ovocytes murin

Ce protocole présente un outil rapide et utile pour évaluer le rôle d’une protéine avec la fonction uncaracterized dans le règlement d’épissage alternatif après traitement chimiothérapeutique.

Utilisation de l’outil E1A Minigene pour étudier les changements d’épissage de l’ARNm

Ce protocole décrit un test rapporteur minigène pour surveiller l’impact des mutations du site de l’épissure 5'sur l’épissage et développe un suppresseur U1 snRNA pour le sauvetage de l’inhibition de l’épissage induite par mutation. Les constructions de l’ARNN U1 rapporteur et suppresseur sont exprimées dans les cellules HeLa, et l’épissage est analysé par extension d’amorce ou RT-PCR.

Un test cellulaire basé sur un rapporteur pour surveiller l’efficacité de l’épissage

Ce protocole décrit la préparation détaillée et à faible entrée de l’échantillon pour le séquençage à noyau unique, y compris la dissection des ganglions cervicaux et stellaires supérieurs de souris, la dissociation cellulaire, la cryoconservation, l’isolement du noyau et le codage à barres hashtag.

Isolement et multiplexage de noyaux à faible entrée avec des anticorps à code-barres de ganglions sympathiques de souris pour le séquençage de l’ARN à noyau unique

Découvrez la microinjection d'ARN fluorescents pour étudier la localisation des snRNA épissosomaux dans les corps de Cajal des cellules HeLa. Cette méthode permet d'identifier les séquences essentielles au transport nucléaire.

Analyse de la localisation spliceosomale snRNA dans les cellules humaines d'Hela utilisant la microinjection

Explorer plus de vidéos