Détection des parasites extravasculaires de trypanosoma par l'aspiration fine d'aiguille

La cytologie fine d’aspiration d’aiguille est une technique peu coûteuse, simple, rapide et minimalement envahissante que nous utilisons pour recueillir des trypanosomes des lésions palpables dans les organes chez les souris vivantes. Étant donné que l’aspiration fine de l’aiguille est une procédure non terminale, elle permet l’échantillonnage répété chez le même animal au fil du temps. Si ces résultats peuvent être traduits en bovins, cette méthode sera très utile pour les vétérinaires de diagnostiquer la trypanosomique chez les bovins dans une ferme.

Ana Margarida Santos, technologue adjointe de mon laboratoire, démontrera la procédure de coloration du frottis. Pour commencer, confirmer l’anesthésie avec la méthode de pincement des pieds. Lorsque le réflexe de rétractation de la jambe est absent, placez la souris dans la récumbence dorsale.

Palper soigneusement les testicules pour déterminer la taille et la distance de la peau qui s’en apercture, puis la retenir entre l’index et le majeur ou entre l’index et le pouce. Pour immobiliser davantage la cible, étirez la peau trop serrée et nettoyez la surface avec des lingettes d’alcool. Ensuite, insérez la pointe de l’aiguille d’une aiguille de calibre 23 reliée à une seringue de cinq millilitres dans la cible pour vous assurer que le piston est dans l’état de repos.

Pour appliquer l’aspiration, rétractez le piston de seringue à la marque de trois à quatre millimètres deux à trois fois. Pour augmenter la probabilité d’obtenir un échantillon représentatif et de cibler des structures plus petites comme l’épididyme, redirigez l’aiguille à l’intérieur de l’organe soit en ligne droite, soit le long de plusieurs tangentes différentes. Relâchez l’aspiration, puis retirez l’aiguille.

L’aiguille ne peut être enlevée qu’après que la pression négative est relâchée en lââant le piston. Sinon, l’aspirate est aspiré dans la seringue et est irrécupérable. Appliquez de la pression à l’aide d’une éponge de gaze stérile au point de ponction pour contrôler tout saignement.

Déconnecter la seringue de l’aiguille et la remplir d’air. Reconnectez l’aiguille, placez le bout de l’aiguille très près ou même sur la lame et éjectez doucement le contenu de l’aiguille sur la glissière. Pour assurer la reproduction de l’échantillonnage, effectuez au moins une aspiration supplémentaire par organe et par animal.

Après avoir retourné l’anesthésie avec une injection sous-cutanée de 200 microlitres d’un milligramme par kilogramme d’Atipamezole en solution saline, retourner les animaux dans leur cage d’origine pour la récupération. À l’aide de la main non dominante, ramasser la lame qui a la goutte d’aspirer pincer l’extrémité givré entre le pouce et l’index. À l’aide de la main dominante, prenez une glissière d’éperoir propre et placez-la en bord lisse sur la deuxième glissière juste au-dessus de la chute à un angle d’environ 30 degrés.

Pour obtenir un film mince, glissez la glissière vers l’avant avec un léger mouvement continu et régulier. Reposez la glissière et laissez sécher l’air complet et rapide du matériau. Étiquetez le bord givré de la lame à l’aide d’un crayon.

Pour le protocole de coloration Giemsa, fixer les frottis séchés à l’air en immergeant les glissières dans un bocal Coplin contenant 100% de méthanol pendant cinq minutes. Ensuite, transférez les glissières dans un bocal Coplin contenant 20% de solution Giemsa et de l’eau distillée pendant 30 minutes. Rincer les glissières à l’eau du robinet et tamponner de papier de soie pour bien sécher.

Tout en tenant la glissière horizontalement, appliquer plusieurs gouttes de milieu de montage nonaqueous sur le frottis. Placez le bord d’un verre de couverture sur la glissière, abaissez-le et appuyez doucement pour enlever les bulles d’air. Pour l’immunocytochimie, fixer les frottis séchés à l’air dans 100% méthanol à température ambiante pendant 10 minutes.

Lavez la lame pendant cinq minutes dans un bocal Coplin avec 1X PBS répétant cette étape trois fois en utilisant 1X PBS frais à chaque fois. Après avoir retiré les glissières du bocal Coplin, essuyez l’excès de tampon sans toucher le frottis et tracez une ligne autour du frottis à l’aide d’un stylo anti-eau. Tout en tenant la glissière horizontalement, appliquez 150 microlitres de solution primaire diluée d’anticorps à chaque frottis et incubez pendant une heure à température ambiante.

Après l’incubation, lavez les glissières pendant cinq minutes dans un bocal Coplin avec 1X PBS répétant cette étape trois fois en utilisant 1X PBS frais à chaque fois. Tout en tenant la glissière horizontalement, appliquez 150 microlitres de système de visualisation du radis de cheval DAB disponible dans le commerce à chaque frottis, puis incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Lavez les diapositives à nouveau trois fois pendant cinq minutes dans PBS.

Puis contre-taches en immergeant les diapositives dans un bocal Coplin contenant de l’hématoxyline Harris pendant 10 secondes. Rincer à l’eau du robinet et tamponner de papier pour bien sécher. Tout en tenant la glissière horizontalement, appliquer plusieurs gouttes de milieu de montage nonaqueous sur le frottis.

Placez le bord d’un verre de couverture sur la glissière, abaissez-le et appuyez doucement pour enlever les bulles d’air. Un frottis de bonne qualité a été caractérisé par un monocouche de cellules avec une bonne densité et des dispositifs morphologiques préservés permettant l’identification de leur tissu d’origine et la proportion relative entre les uns et les autres. En outre, les parasites étaient efficacement immunotachés, identifiables et dé countables.

Les résultats pauvres ou négatifs d’aspiration d’aiguille fine peuvent être dus à trop peu de matériel et donc sous le représentant de la masse ou de l’organe. Il peut également être dû à trop de matériel sur une seule diapositive faisant des frottis trop épais et altérant l’évaluation cytologique. Ce qu’on appelle artefact écrasé se produit en raison de trop de force appliquée lors de la fabrication du frottis laissant aux cellules perturbées résultant en beaucoup de noyaux nus et des stries d’ADN.

Lorsqu’il n’y a pas assez de force appliquée pendant la préparation du frottis, les cellules ne se désaggrégent pas, ce qui entraîne une couche stratifiée qui entrave l’évaluation des caractéristiques morphologiques des cellules. Comparaison de la cytopathologie fine d’aspiration d’aiguille avec l’histopathologie, la cytopathologie a eu l’avantage de la morphologie cellulaire mieux préservée et d’une meilleure évaluation des proportions relatives et du comptage des cellules. L’immunocytochimie est plus simple, plus rapide et plus facile à optimiser que l’immunohistochimie.

Pour l’aspiration fine d’aiguille, assurez toujours une bonne immobilisation de l’animal, la stabilisation des organes ou de la masse à aspirer, et une application et une libération coordonnées de vide. Ensuite, pour les frottis de haute qualité, se propager immédiatement après que le matériau a été placé sur le verre et être doux sur la force appliquée pour faire le frottis pour éviter les artefacts écrasés par cellules. En plus de la microscopie et de l’immunocytochimie courantes, ce matériau peut également être utilisé pour la microscopie électronique, l’analyse biochimique, la cytométrie du débit, la biologie moléculaire, ou même pour les essais in vitro.

Cette technique nous a permis de démontrer que l’aspiration fine d’aiguille peut être employée pour diagnostiquer et étudier la maladie chez les animaux expérimentaux. Nous avons pu diagnostiquer le tropisme des parasites de Trypanosoma aux organes reproducteurs masculins externes et également caractériser cette maladie au cours de l’infection.