Génération de neurosphères à partir de neurones hippocampes et corticales primaires mixtes isolées de l'embryon de rat Sprague Dawley E14-E16

L’objectif global de cette procédure est de démontrer le développement des neurosphères à partir de neurones hippocampaux et corticals primaires mixtes isolés de l’embryon de rat Sprague Dawley E14-E16, afin d’offrir une plate-forme robuste et peu coûteuse pour étudier l’effet de diverses pistes neurothérapeutiques. Comme vous le savez, ce cerveau est un réseau complexe de neurones associés à un grand nombre de cellules de soutien. Pour comprendre la fonction cérébrale, la plupart des recherches sont souvent rééditées à partir d’expériences in vitro, qui impliquent des lignées cellulaires dérivées de lignées neurales disponibles dans le commerce.

Cependant, ces lignées cellulaires sont des lignées cellulaires transformées qui souffrent de variations génotypiques et phénotypiques. Pour résoudre ce problème, la culture des neurones primaires est l’approche appropriée. Ici, nous avons illustré un protocole simple et rentable pour la culture des neurones primaires et construit une plate-forme de dépistage robuste pour diverses thérapeutiques neuronales.

Le principal avantage de ce protocole est que juste en modulant les densités de placage cellulaire, nous pouvons présenter deux plates-formes contrastantes de culture de neurones où la basse densité mène à la culture primaire prolongée de neurone, et la haute densité génère des neurosphères spontanées. Prenez deux assiettes de 24 puits. L’un pour la haute densité, et l’autre pour le placage à faible densité.

Transférer 12 mm de couvertures stériles en verre dans les plaques de 24 puits. Versez 300 microlitres de solution PDL dans chacun des puits d’une manière qu’il couvre entièrement la surface de l’ensemble du coverslip. Préparer la solution PDL à une concentration de 0,1 mg/mL dans l’eau déionisée.

Envelopper les assiettes de feuilles d’aluminium pour éviter le séchage et les conserver dans l’incubateur de CO2 pendant la nuit. Le lendemain, avant le placage, aspirer la solution PDL. Laver correctement avec de l’eau stérile pendant deux à trois fois.

Ajouter ensuite les supports de placage et remettre les assiettes à l’incubateur jusqu’au placage. Sacrifiez un rat Sprague-Dawley enceinte de temps E14-E16, faites une coupe en forme de V dans la région abdominale à l’aide de forceps stériles et d’une paire de ciseaux émoussés. Retirez tous les fœtus et placez-les soigneusement sur la plaque de Pétri avec la solution HBSS froide.

Sortez les embryons des sacs embryonnaires et lavez-les soigneusement dans une boîte de Pétri séparée dans du HBSS frais et froid. Décapiter la tête à l’aide de ciseaux stériles. Transférer les têtes dans les plaques de Pétri stériles de 90 mm avec du HBSS froid.

Sous le microscope stéréo, tenez la tête de la région du museau avec les forceps dentelés stériles, et sortez le cerveau en coupant la peau et le crâne ouverts. Enlevez toutes les méninges des hémisphères et du cerveau moyen en tenant le tronc cérébral. Retirez soigneusement les hémisphères intacts, ressemblant à des chapeaux de champignons qui contiennent l’hippocampe et le cortex.

Recueillir les hémisphères contenant le cortex et l’hippocampe intact dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de médias de dissociation. Permettre aux tissus recueillis de s’installer, et aspirer le milieu de dissociation, laissant cinq à dix pour cent de milieu en elle. Encore une fois, ajouter 10 mL de dissociation fraîche moyenne à elle, et répéter cette étape deux fois.

Ajouter 4,5 mL de milieu de dissociation et 0,5 mL de solution trypsine-EDTA. Gardez-le dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes pour que la digestion se poursuive. Aspirer le milieu et laver avec 10 mL de milieu de dissociation et de placage moyen, consécutivement.

Resuspendez-les en 2,5 mL de support de placage. Conserver un plat stérile de 90 mm sur le couvercle inversé du plat et le verser à la base d’un plat stérile de 90 mm. Titrer les tissus digérés dans la base d’angle du plat, en utilisant 1000 pointe de pipette microliter, afin d’occuper le moins de volume.

Passez la suspension cellulaire obtenue à travers la passoire cellulaire de 70 micromètres, à l’exclusion de tout morceau de tissu. Déterminez la densité des cellules viables à l’aide de l’exclusion du colorant bleu trypan et comptez le nombre de cellules dans un compteur de cellules automatisé. Diluer le nombre de cellules obtenues de manière à plaquer 1,5 en 10 à la puissance de 5 cellules par mL pour le placage à haute densité, et 20 000 cellules par mL pour le placage de basse densité dans deux tubes séparés contenant 30 mL de milieu de placage.

Aspirer le milieu de placage précédemment ajouté et plaque 500 microlitres de cellules dispersées dans le milieu de placage dans chaque puits. Après cela, retourner les assiettes à l’incubateur pendant quatre heures. Quatre heures après le placage, examiner les cellules pour l’adhérence sous le microscope.

Après quatre heures de placage, dans les plaques de haute et basse densité, les neurones montrent une bonne adhérence aux plaques. Remplacez le milieu de chaque puits par 500 microlitres de milieu d’entretien frais et incubez-le dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Nous devons faire la culture de ces neurones plaqués à haute et basse densité.

Alors que les neurones plaqués de faible densité peuvent être utilisés pour des cultures prolongées, jusqu’à 30 jours, en changeant le milieu d’entretien deux fois par semaine, les neurones plaqués haute densité commencent à générer spontanément des neurosphères, qui sont venues le lendemain de notre maintien dans une plaque d’attachement ultra-basse. Après 24 heures de placage, on observe des neurones plaqués haute et basse densité pour afficher une morphologie saine. Une image de contraste de phase des neurones plaqués de basse densité, cultivés pendant environ sept jours, est affichée ici.

Les neurones affichent une morphologie saine, et peuvent être maintenus jusqu’à 30 jours avec un routage et des interconnexions plus vigoureux. Le diagramme de barre montre ici environ 90 pour cent de viabilité des neurones plaqués de basse densité, même après 30 jours de culture, tel que déterminé par l’analyse MTT. Les neurones primaires ici ont été caractérisés par l’immunostaining avec Tuj 1, un marqueur des neurones différenciés, et tau, un marqueur des axones neuronaux.

La pureté des neurones est confirmée par l’absence de coloration dans les marqueurs non neuronaux GFAP pour les astrocytes et O4 pour les oligodendrocytes. Dans toutes les études de caractérisation, les noyaux ont été tachés avec Hoechst 33258. Ici, les cellules ensemencées de basse densité ont été tachées avec le marqueur astrocytique GFAP et le marqueur neuronal Tuj 1 pour vérifier la pureté de la culture jusqu’à sept jours.

Il est observé que ce protocole soutient la croissance préférentielle des neurones sur les astrocytes comme indiqué par l’analyse quantitative. Les noyaux ont été tachés avec Hoechst 33258. De même, dans les cellules ensemencées à haute densité, les astrocytes ont été tachés de GFAP et de neurones par Tuj 1.

Ici, dans l’analyse quantitative, environ 17 pour cent des astrocytes sont observés contre 83 pour cent de neurones. Les noyaux ont été tachés avec Hoechst 33258. Après sept jours, on observe des neurosphères multiples formées spontanément dans les neurones à haute densité.

Vers le huitième au dixième jour de culture, dans les neurones plaqués haute densité, les neurosphères commencent à former de grandes projections et des ponts composés d’extensions radiales en forme de glial. Les flèches noires indiquent le pont entre deux neurosphères nouvellement formées. Des analyses de cellules vivantes et mortes ont été effectuées sur les neurosphères pendant 15 jours.

Dans la coloration dense de Calcein AM, sans tache d’iodure de propidium, indique presque 100 pour cent de viabilité des neurosphères dans la culture. Le graphique linéaire indique ici une expansion de la taille des neurosphères avec le passage du nombre de jours. Cette image trop tachée de la neurosphère indique une riche population de cellules progénitrices neurales grâce à l’expression accrue des marqueurs NPC Nestin et Tuj 1.

Les neurosphères montrent ici de grandes quantités d’astrocytes marquées par la forte expression du GFAP, accompagnées d’une expression encore plus élevée du marqueur neuronal Tuj 1. Les noyaux ont été tachés avec Hoechst 33258. Donc, je pense que notre protocole est très excitant et intéressant, compte tenu du fait que d’une seule stratégie, nous sommes en mesure d’obtenir deux plates-formes: un 2-D et un 3-D.

Et ce sera une excellente plate-forme pour le dépistage de différentes pistes neurothérapeutiques. Donc je suppose que c’est vraiment très utile à tous les neuroscientifiques. Un autre aspect important est que les neurosphères dans laquelle nous optons sont extrêmement riches en cellules progénitrices neurales, les PNJ.

Et ils peuvent être utilisés pour les différencier en neurones et lignées non neuronales. Donc, je pense que si, vraiment, les gens peuvent maîtriser cette technique en prenant l’aide de cette vidéo, il sera vraiment très utile pour tout le monde. Merci.