Name: Purification dune protéine de masse moléculaire élevée chez Streptococcus mutans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Découvrez une méthode efficace de purification de protéines de haute masse moléculaire chez Streptococcus mutans. Cette technique par PCR simplifie l'étude des protéines membranaires difficiles à exprimer.

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Ce travail a été soutenu par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) (numéros de subvention 16K15860 et 19K10471 à T. M., 17K12032 à M. I., et 18K09926 à N. H.) et la SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (numéro de subvention 2018.09.10 No 1).

REMARQUE: Génération de S. mutans gtfC, dans lequel toute la région de codage du gène gtfC est remplacée par spcr, doit être complétée avant d'effectuer ces protocoles. Consultez l'article publié pour plus de détails sur la génération5.
1. Conception d'apprêt
<ol><li>
Préparer les amorces pour la construction de S. mutans His-gtfC. REMARQUE: Les séquences d'amorce utilisées dans ce protocole sont indiquées dans le tableau 1. La méthode PCR de fusion en deux étapes pour la génération de S. mutans His-gtfC est schématiquement illustrée dans la figure 2.<ol>
<li>Amorces de conception(gtfC-reverse et spcr-forward)pour l'attachement de sa séquence de codage de tag, intervenant entre le gène gtfC et spcr (Figure 2A).<ol>
<li>Inclure le lien GS et la séquence de codage His-tag dans les deux amorces gtfC-reverse et spcr-avant,dans lesquelles 24 bases aux régions de 5' sont complémentaires les unes aux autres. REMARQUE : La séquence d'acides aminés du lien GS et de son étiquette (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-His) est attachée au terminus C de GTF-SI par la traduction de gènes.</li>
			<li>Concevoir une amorce gtfC-avantpour cibler le gène gtfC dans le génome de S. mutans WT en aval du gène et l'amorce spcr-reversepour cibler la région de flanc en aval de spcr dans le S. mutans -gtfC. Définir la température de fonte8 (Tm) du gtfC-avant et spcr-inverse amorces pour correspondre avec les températures de fonte de la gtfC-inverse et spcr- amorces avant, respectivement.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Concevoir des amorces non-parisées (nichées vers l'avant et inversées) pour le deuxième PCR (Figure 2B).</li>
		<li>Amorces de conception(gtfC-avant et colonie-revers) spécifiques pour l'ADN génomique du transformateur (figure 2C; les amorces sont utilisées pour la colonie PCR). REMARQUE: Les amplicons chevauchent la frontière entre gtfC et spcr. L'amorce avant gtfCpeut être appliquée comme amorce avant.</li>
		<li>Amorces de conception (vers l'avant et vers le bas) pour la confirmation finale de la génération de S. mutans His-gtfC (Figure 2C; le produit PCR amplifié par les amorces est utilisé pour le séquençage de l'ADN).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extraction d'ADN génomique de S. mutans
REMARQUE: Chaque souche de S. mutans doit être cultivée dans le milieu d'infusion cardiaque du cerveau (BHI) à 37 oC dans des conditions anaérobies. Les souches mutantes de S. mutans et S. mutans His-gtfC sont cultivées en BHI complétées par une spectinomycine de 100 g/mL.
<ol><li>Streak S. mutans WT et S. mutans -gtfC séparément sur chacune des plaques d'agar BHI. Incuber pendant la nuit à 37 oC.</li>
	<li>Choisissez des colonies simples de S. mutans WT ou S. mutans -gtfC à l'aide d'un cure-dent stérilisé et inoculez-vous dans 1,5 ml de bouillon BHI. Incuber pendant la nuit à 37 oC. REMARQUE: Les colonies peuvent être utilisées comme source d'ADN modèle pour le premier PCR (étape 3.1).</li>
	<li>Transférer 1 ml de chaque culture bactérienne dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Centrifugelant la culture pendant 1 min à 15 000 x g.</li>
	<li>Retirez le supernatant et ajoutez 1 ml du tampon Tris-EDTA (pH 8,0) pour suspendre à nouveau le granule cellulaire.</li>
	<li>Centrifugeuse suspension pendant 1 min à 15 000 x g. Retirez le supernatant. Resuspendre la pastille cellulaire dans 50 oL de tampon Tris-EDTA (pH 8,0).</li>
	<li>Chauffer la suspension à l'aide d'un incubateur de blocs pendant 5 min à 95 oC. Centrifugeuse suspension pendant 5 min à 15 000 x g.</li>
	<li>Transférer le supernatant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml (le supernatant servira d'ADN modèle pour le premier PCR).</li>
</ol>3. Amplification DE PCR
REMARQUE: Le tableau 1, le tableau 2et le tableau 3 résument respectivement les amorces, les réactifs et les cycles d'amplification du PCR.
<ol><li>Effectuez le premier PCR en utilisant le génome S. mutans WT et S. mutans gtfC comme modèles PCR. Amplifiez les régions abritant la partie aval du gène gtfC et celles qui hébergent spcr à l'aide des amorces décrites à l'étape 1.1.1.2 (Figure 2A).</li>
	<li>Électrophorese chaque produit PCR sur 1% gel agarose. Accises les fragments d'ADN souhaités d'environ 1 000 pb et 2 000 pb. Purifiez les fragments des gels à l'aide de la méthode d'extraction de gel à base de membrane de silice. REMARQUE: Les procédures de base pour PCR9, l'électrophorèse de gel d'ADN10,et la purificationd'ADN 11 sont détaillées ailleurs.</li>
	<li>Effectuez un deuxième PCR à l'aide des produits du premier PCR (environ équimolar) comme modèles PCR avec les amorces non remue-avant et nichées -inversées (figure 2B).</li>
	<li>Électrophorese un dixième du mélange PCR sur le gel d'agarose. Confirmer la génération de l'amplicon approprié d'environ 3 000 pb.</li>
	<li>
Précipitez le produit PCR restant. REMARQUE : La purification du produit PCR n'est pas nécessaire, car les amplicons non spécifiques générés par le deuxième PCR n'interfèrent pas avec la recombinaison homologue.<ol>
<li>Ajouter de l'eau sans nauséabonde au mélange DE PCR et porter le volume total à 100 l, suivi de 0,1 volume (10 l) d'acétate de sodium de 3 M (pH 5,2) et de 2,5 volumes (250 l) d'éthanol absolu. Mélanger et conserver le mélange pendant 10 min à température ambiante (RT).</li>
		<li>Centrifuger l'échantillon pendant 20 min à 15 000 x g à 4 oC. Jetez le supernatant. Ajouter 1 ml d'éthanol à 70 % pour laver le granule d'ADN.</li>
		<li>Centrifuger l'échantillon pendant 5 min à 15 000 x g à 4 oC. Jetez le supernatant. Séchez et dissez la pastille d'ADN avec 10 l l d'eau exempte de nucléane.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Transformation cellulaire
<ol><li>Préparer compétent S. mutans WT pour introduire le deuxième produit PCR en suivant les étapes décrites dans la publication précédente5. Conserver les cellules à -80 oC. REMARQUE: Pour cette expérience, les cellules WT compétentes de S. mutanont déjà été conservées en -80 oC pour générer S. mutans etgtfC.</li>
	<li>Mélanger 5 'L du deuxième produit PCR concentré à l'aliquot de 50 L de cellules compétentes glacées congelées précédemment. Ajouter le mélange dans des cuvettes d'électroporation. Donner une seule impulsion électrique (1,8 kV, 2,5 ms, 600 , 10 F) aux cellules à l'aide de l'appareil d'électroporation.</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans 500 'L de bouillon BHI. Immédiatement, étalez 10 à 100 l de la suspension sur des plaques d'agar BHI contenant de la spectinomycine. Incuber les assiettes pendant 2 à 6 jours à 37 oC jusqu'à ce que les colonies aient suffisamment grandi pour être ramassées.</li>
</ol>5. Vérification de larecombinaison et du stockage de Genome 
<ol><li>Effectuer la PCR de la colonie, à l'aide d'amorces gtfC-avant et de colonie-inversées pour dépister la recombinaison. Électrophorese chaque produit PCR de colonie sur un gel d'agarose. Confirmer le fragment d'ADN d'environ 1 500 pb.</li>
	<li>Choisissez l'une des colonies positives à l'aide d'un cure-dent stérilisé et la sous-culture des cellules pendant la nuit dans 2 ml de bouillon BHI contenant de la spectinomycine.</li>
	<li>Mélanger 0,8 ml de culture bactérienne avec 0,8 ml de glycérol stérile à 50 % et stocker à -80 oC ou -20 oC.</li>
	<li>Transférer les 1 ml restants de suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Répétez les étapes 2.3-2.7 pour extraire l'ADN génomique des cellules.</li>
	<li>Effectuez PCR en utilisant les amorces vers l'avant et vers le bas et l'ADN génomique comme modèle. Répétez l'étape 3.2 pour purifier le produit d'ADN amplifié des gels.</li>
	<li>Déterminer la séquence d'ADN de l'amplicon purifié par séquençage de l'ADN. REMARQUE: Assurez-vous de confirmer la génération de S. mutans Son-gtfC par séquençage de l'ADN.</li>
</ol>6. Purification du GTF-SI étiqueté polyhistidine
<ol><li>Streak S. mute sa gtfC sur une plaque d'agar BHI contenant de la spectinomycine. Incuber pendant la nuit à 37 oC.</li>
	<li>Ramassez une seule colonie à l'aide d'un cure-dent stérilisé et de cellules de sous-culture dans 3 ml de bouillon de BHI. Incuber toute la nuit à 37 oC.</li>
	<li>Préparer deux flacons coniques avec 1 L de bouillon BHI sans spectinomycine. Inoculer 1 ml de la suspension de culture de nuit dans 1 L du bouillon BHI. Incuber toute la nuit à 37 oC.</li>
	<li>Concentrer les protéines du supernatant de culture par la précipitation de sulfate d'ammonium. REMARQUE : Extraire des corps cellulaires si une protéine cible est intracellulaire. Les procédures de base pour les précipitations de sulfate d'ammonium sont détaillées ailleurs12.<ol>
<li>Centrifugelant la suspension de culture bactérienne pendant 20 min à 10 000 x g à 4 oC. Récupérer le supernatant de culture dans un bécher en verre de 3 L.</li>
		<li>Ajouter 1 122 g de sulfate d'ammonium à 2 L du supernatant (80% de saturation) avec un remuant vigoureux à l'aide d'un agitateur magnétique. Laisser le précipité se former pendant 4 h ou plus à 4 oC en remuant. REMARQUE : La formation précipitée peut se poursuivre pendant la nuit.</li>
		<li>Centrifugeuse solution précipitée par le sulfate d'ammonium à 15 000 x g pendant 20 min à 4 oC. Decant le supernatant.</li>
		<li>Recueillir le précipité à l'une spatule et le transférer dans un bécher en verre de 200 ml. Resuspendre les granulés en 35 ml de tampon de liaison (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM imidazole, pH 8,0).</li>
		<li>Dialyser la suspension contre 2 500 ml du tampon de liaison à l'aide d'un tube de dialyse de cellulose régénéré, à 4 oC, en remuant. Remplacer la solution de dialyse après 2 h et poursuivre la dialyse toute la nuit.</li>
		<li>Remplacez à nouveau la solution de dialyse. Continuer à dialyser pendant 2 h supplémentaires.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifuger la suspension dialysée à 20 000 x g pendant 10 min à 4 oC. Filtrer le supernatant à l'aide d'un filtre à membrane à l'aide d'un équipement de filtration par aspiration. Transférer le filtrate dans un flacon de 75 cm2.</li>
	<li>Fractionner le GTF-SI étiqueté polyhistidine de la suspension filtérée par chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC).
	<ol>
<li>Transférer 2 ml de boue de résine IMAC chargée par Ni (environ 1 ml de résine) dans une colonne chromatographique dont la sortie est montée sur un tube de silicone. Retirez la solution de stockage par le flux de gravité. MISE EN GARDE: Ne laissez pas la résine sécher dans l'ensemble de l'IMAC.</li>
		<li>Ajouter 3 ml d'eau distillée dans la colonne pour laver la résine. Ajouter 5 ml du tampon de liaison pour réquiliber la résine.</li>
		<li>Arrêtez le flux avec une bite Hoffmann pincement. Ajouter 5 ml de la suspension filtrée de l'étape 6.5 pour faire la boue.</li>
		<li>Ajouter toute la boue à la suspension filtrée restante. Faire tourbillonner doucement le mélange pendant 30 min à 4 oC.</li>
		<li>Chargez le mélange sur la colonne. Retirez la suspension par le flux de gravité. Laver la résine IMAC avec 20 ml de tampon de liaison. REMARQUE: Ajustez le débit à environ 2 ml/min avec un coq Hoffmann pincement tout au long de l'IMAC suivant.</li>
		<li>Elute le GTF-SI recombinant avec 20 mL de tampon d'élution (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 8,0). REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. L'éluate doit être stockée à 4 oC. La résine IMAC peut être réutilisée. Consultez les instructions pour la résine IMAC.</li>
	</ol></li>
	<li>Remplacez le tampon d'élution par le tampon de stockage (tampon de phosphate de 50 mM, pH 6,5) et concentrez la solution RecombinantGTF-SI à environ 1 ml à l'aide d'une unité d'ultrafiltration centrifuge. Entreposez la solution GTF-SI recombinante à 4 oC. REMARQUE: Confirmer la purification GTF-SI étiquetée polyhistidine à l'aide de SDS-PAGE13 et de l'ouest de l'ouest en utilisant un anticorps monoclonal anti-polyhistidine conjugué au raifort. Ajout de CHAPS (concentration finale, 0,1 %) à l'éluence peut être nécessaire pour éviter l'adsorption non spécifique à l'unité, selon la protéine cible.</li>
</ol>7. Restauration fonctionnelle par Recombinant GTF-SI
<ol><li>Stries chaque souche S. mutansur une plaque d'agar BHI individuellement. Incuber les assiettes toute la nuit à 37 oC.</li>
	<li>À l'aide d'un cure-dent stérilisé, prendre une seule colonie pour inoculer 2 ml de bouillon de BHI. Incuber toute la nuit à 37 oC.</li>
	<li>Utilisez 20 l de la culture de la nuit de S. mutans etgtfC pour inoculer 2 ml de bouillon DE BHI contenant 1 % de saccharose sans antibiotiques dans un tube à essai en verre. Ajoutez le GTF-SI ou un volume équivalent du véhicule à la culture S. mutans etgtfC, et cultureles les cellules avec le tube placé en position inclinée pendant la nuit. REMARQUE: Stérilisez la solution GTF-SI à l'aide d'un filtre à seringues stériles et déterminez la concentration en protéines à l'aide d'un test de protéines d'acide bicinchoninique15 avant utilisation.</li>
	<li>Agiter les suspensions de culture avec un mélangeur de vortex pour 10 s. Décant les suspensions. Laver les tubes à essai avec une quantité suffisante d'eau distillée.</li>
	<li>Tainer les biofilms sur la paroi du tube avec 1 ml de 0,25% Coomassie bleu brillant (CBB).</li>
	<li>Décant la solution de coloration après 1 min. Laver les tubes à essai avec une quantité suffisante d'eau distillée. Séchez à l'air les tubes à essai.</li>
</ol>

<ol><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+3rd+Edition%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
<li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans%3A+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101(2016).</li>
<li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li>
<li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene%2C+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li>
<li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD%289%29+determinant+from+Enterococcus+faecalis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR%3A+The+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li>
<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La conception des amorces est l'étape la plus critique du protocole. Les séquences des amorces gtfC-reverse et spcr-avantont été automatiquement déterminées en fonction des séquences de la région d'extrémité de 3 degrés de gtfC et de la région de fin de 5 degrés de spcr. Chaque amorce comprend 24 bases complémentaires qui codent un lien GS et une séquence de codage His-tag dans leurs régions de 5'. La perturbation des séquences réglementaires indigènes situées dan...

L'analyse de la fonction d'un gène implique généralement la comparaison des traits phénotypiques des souches de type sauvage aux souches dans lesquelles le gène d'intérêt a été perturbé. Une fois que la souche perturbée par le gène est produite, l'ajout exogène du produit génique permet une restauration fonctionnelle.
La méthode la plus courante pour obtenir les produits géniques purifiés requis pour les essais de restauration ultérieures est en effectuant l'expression hétérologue dans Escherichia coli1. Cependant, l'expression des protéines membranaires ou des protéines de masse moléculaire élevée est souvent difficile à l'aide de ce système1. Dans ces cas, la protéine cible est habituellement isolée des cellules qui synthétisent la protéine par une série complexe d'étapes, qui peuvent mener à la perte du produit génique. Pour surmonter ces problèmes, une procédure simple a été développée pour la purification des produits géniques à la suite d'une méthode de perturbation génétique2, pcR à base de méthode d'épissage de l'ADN3 (désigné en deux étapes de fusion PCR), et l'électroporation pour la génétique transformation dans Streptococcus mutans. L'ajout d'une étiquette de polyhistidine (His-tag) au c-terminus du produit génique facilite sa purification par chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC).
Pour isoler la souche His-tag-expressing, l'ADN génomique entier du gène d'intérêt (dans cette souche son-étiquette-exprimant gène-perturbé) est remplacé par un gène de marqueur antibiorésistant. La procédure pour générer la souche His-tag-exprimant est presque identique à celle pour générer une souche gène-perturbée comme décrit précédemment4,5. Par conséquent, les méthodes de perturbation génétique et d'isolement des produits géniques devraient être effectuées en série d'expériences pour l'analyse fonctionnelle.
Dans le présent travail, une séquence de codage de polyhistidine est attachée à l'extrémité 3 du gène gtfC (GenBank locus tag SMU 1005), codant la glucosyltransferase-SI (GTF-SI) en S. mutans6. Ensuite, des études d'expression chez une espèce streptococcique ont été réalisées. Il est difficile d'atteindre l'expression hétérologue de la gtfC par E. coli, probablement en raison de la masse moléculaire élevée de GTF-SI. Cette souche est nommée S. mutans His-gtfC. Une illustration schématique représentant l'organisation de la cassette de gène de résistance à la gtfC et à la spectinomycine (spcr)7 loci dans le type sauvage S. mutans (S. mutans WT) et ses dérivés est montrée dans Figure 1. Le GTF-SI est une protéine sécrétrice qui contribue au développement du biofilm dentaire cariogénique6. Sous la présence du saccharose, un biofilm adhérent est observé sur une surface de verre lisse dans la souche WT S. mutans, mais pas dans la souche S. mutans gtfC-perturbée (S. mutans 'gtfC)2,5 . La formation de biofilms est restaurée dans S. mutans -gtfC après l'ajout exogène du GTF-SI recombinant. La souche, S. mutans His-gtfC, est ensuite utilisé pour produire le GTF-SI recombinant.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Nippon Genetics</td><td>NE-AG02</td><td>Pour électrophorèse sur gel d’agarose</td></tr><tr><td>Anaeropack Mitsubishi</td><td>Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>Système de culture anaérobie</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-His-Tag</td><td>MBL</td><td>D291-7</td> Kit de dosage des protéines BCA <td>conjuguées HRP</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td>Mesure de la concentration</td></tr> <tr><td>en protéinesBouillon d’infusion cerveau-cœur</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Milieu de culture bactérienne</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>Pour la coloration du biofilm</td></tr><tr><td>Unité d’ultrafiltration centrifuge</td><td>Sartorius</td><td>VS2032</td><td>Remplacement du tampon et concentration des protéines</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Kubota</td><td>7780II</td><td></td></tr><tr><td>Colonne chromatographique</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>Pour IMAC</td></tr><tr><td>Pince à membrane de dialyse</td> Fisher <td>brand</td><td>21-153-100</td><td></td></tr><tr><td>Tube de dialyse</td><td>As One</td><td>2-316-06</td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>Séquençage de l’ADN ADN polymérase haute fidélité</td></tr><tr><td></td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrat ECL Bio-Rad</td><td></td><td>170-5060</td><td>Pour western blot</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M pH 8,0)</td><td>Wako</td><td>311-90075</td><td>Tris-EDTA Préparation du tampon</td></tr><tr><td>Cuvette d’électroporation</td><td>Bio-Rad</td><td>1652086</td><td>0,2 cm d’écart</td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’EtBr</td><td>Nippon Gene</td><td>315-90051</td><td>Pour électrophorèse sur gel d’agarose</td></tr><tr><td>Coupe-bande de gel</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Gel kit d’extraction</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>Extraction d’ADN à partir de gel d’agarose</td></tr><tr><td>Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>29083461</td><td>Pour SDS-PAGE et western blot</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Wako</td><td>095-00015</td><td>Tampon de liaison et préparation du tampon d’élution</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Nippon Medical & Chemical Instruments</td><td>EZ-022</td><td>Réglage de la température : 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Nippon Medical & Chemical Instruments</td><td>LH-100-RDS Réglage de la</td><td>température : 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Filtre à membrane</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td>0.2 &micro ; m de diamètre</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Kubota</td><td>3740</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>Préparation du tampon de liaison et du tampon d’élution</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot ; 2H2O</td><td>Wako</td><td>192-02815</td><td>Préparation du tampon de liaison et du tampon d’élution</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td>Préparation du tampon de liaison et du tampon d’élution</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Wako</td><td>015-06737</td><td>Précipitation de sulfate d’ammonium</td></tr><tr><td>Résine</td> chargée <td>de nickel Bio-Rad</td><td>1560133</td><td>Pour IMAC</td></tr><tr><td>Amorces PCR Eurofins</td><td>Genomics</td><td>Commande</td><td></td>sur mesure</tr><tr><td>Étalon de protéines</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0381</td><td>Pour SDS-PAGE et western</td></tr><tr><td>blot Appareil de filtration par solvant</td><td>As One</td><td>FH-1G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycine</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antibiotiques ; utilisation à 100 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>Filtre stérile pour seringue</td><td>Merckmillipore</td><td>SLGV004SL</td><td>0,22 & micro ; m diamètre</td></tr><tr><td>Streptococus mutans &#916 ; gtfC</td><td>Stock en laboratoire.</td><td></td><td>gtfC remplacé par spcr</td></tr><tr><td>Streptococus mutans UA159</td><td>Souche mère en laboratoire.</td><td></td><td>S. mutans ATCC 700610, Souche de type sauvage</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>Pour le développement du biofilm</td></tr><tr><td>TAE (50 &times ; )</td><td>Nippon Gene</td><td>313-90035</td><td>Pour électrophorèse sur gel d’agarose</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8,0)</td><td>Wako</td><td>314-90065</td><td>Préparation du tampon Tris-EDTA</td></tr></tbody></table>

purification d'une protéine de masse moléculaire élevée chez streptococcus mutans

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

L'élucidation de la fonction d'un gène implique généralement la comparaison des traits phénotypiques des souches et souches de type sauvage dans lesquelles le gène d'intérêt a été perturbé. La perte de fonction à la suite d'une perturbation génétique est ensuite rétablie par l'ajout exogène du produit du gène perturbé. Cela aide à déterminer la fonction du gène. Une méthode précédemment décrite consiste à générer une souche de Streptococcus mutans perturbée par le gène gtfC. Ici, une méthode peu exigeante est décrite pour purifier le produit de gène de gtfC de la souche nouvellement produite de S. mutans suivant la perturbation de gène. Il s'agit de l'ajout d'une séquence de codage de polyhistidine à l'extrémité 3 du gène d'intérêt, ce qui permet une simple purification du produit génique à l'aide d'une chromatographie d'affinité métallique immobilisée. Aucune réaction enzymatique autre que PCR n'est requise pour la modification génétique de cette méthode. La restauration du produit génique par ajout exogène après la rupture des gènes est une méthode efficace pour déterminer la fonction génique, qui peut également être adaptée à différentes espèces.

La figure 3 montre la taille de chaque amplicon du premier PCR (Figure 3A) et du deuxième PCR (Figure 3B). La taille de chaque amplicon correspondait à la taille prévue, tel que décrit dans le tableau 1. La figure 4A montre des colonies de S. mutans transformées avec le deuxième produit PCR et plaquées sur les plaques d'agar BHI contenant de la ...

Décrit ici est une méthode simple pour la purification d'un produit génique dans Streptococcus mutans. Cette technique peut être avantageuse dans la purification des protéines, en particulier les protéines membranaires et les protéines de masse moléculaire élevée, et peut être utilisée avec diverses autres espèces bactériennes.

Purification d'une protéine de masse moléculaire élevée chez Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie telles que la façon dont un produit génétique difficile à exprimer dans E.Coli purifie. Les principaux avantages de cette technique sont qu’aucune réaction enzymatique, autre que pcr, n’est le porteur, et des applications communes pour la purification de protéine peuvent être employées. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la purification des protéines chez les mutagés streptocoques, elle peut également être une connaissance d’autres espèces de microbiotes.Le Dr Mamiko Yamashita, un étudiant diplômé de notre laboratoire, démontrera la procédure. Après la conception de l’amorce et l’extraction de l’ADN génomique à partir de streptocoques mutans, effectuer le premier PCR en utilisant le streptocoque mutans de type sauvage et GFC perturbé le génome streptococcus mutans que les modèles PCR. Amplifiez les régions abritant la partie aval du gène gtfC et celles abritant le gène de résistance à la spectinomycine à l’aide de l’amorce préparée gtfC-forward et inverse et de l’amorce spc r-forward et inverse.Ensuite, électrophorese chaque produit PCR sur 1% gel agarose. Utilisez un coupe-gel pour exciser les fragments d’ADN désirés d’environ 1000 paires de base et de 2000 paires de base du gel en tubes de microcentrifugeuse. Ajouter 500 microlitres de tampon solubilisant dans chaque tube et les incuber pendant 10 minutes à 56 degrés Celsius pour dissoudre les tranches de gel.Purifier les fragments à l’aide d’une méthode d’extraction de gel à base de silice à base de membrane. Effectuez un deuxième PCR en utilisant les produits du premier PCR comme modèles PCR avec les amorces imbriquées vers l’avant et imbriquées. Lorsque le deuxième produit PCR ne peut pas être confirmé par électrophoresis, la paire d’une autre amorce imbriquée doit être conçue.électrophorese cinq microlitres du mélange de PCR sur le gel d’agarose. Confirmez la généra tion de l’amplicon approprié d’environ 3000 paires de base par image de coloration de gel de bromure d’éthidium et procédez selon le manuscrit. Maintenant, mélangez cinq microlitres du deuxième produit concentré de PCR à l’aloquot de 50 microlitres des cellules muettes froides et compétentes de type sauvage de streptococcus mutan, congelées précédemment.Ajouter le mélange dans une cuvette d’électroporation et placer la cuvette dans la chambre de cuvette de l’appareil d’électroporation. Donnez une seule impulsion électrique de 1,8 kilovolts, 600 ohms et 10 microfarades pendant 2,5 millisecondes aux cellules. Ajouter 500 microlitres de bouillon d’infusion cerveau-coeur dans la cuvette.Étendre immédiatement 10 à 100 microlitres de la suspension sur des plaques d’auger d’infusion cerveau-coeur contenant de la spectinomycine. Incuber les plaques pendant deux à six jours à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les colonies aient suffisamment grandi pour être ramassées. Après la génération de streptocoques mutans polyhistidine séquence de codage incorporé souche et l’inoculation pendant la nuit sans spectinomycine selon le manuscrit, centrifuger la suspension de la culture bactérienne pendant 20 minutes à 10.000 fois g à quatre degrés Celsius.Transférez le supernatant de culture dans un bécher en verre de trois litres. Pour concentrer les protéines de la culture supernatant, placez le supernatant de deux litres sur un agitateur magnétique et commencez à remuer vigoureusement. Ajouter 1 122 grammes de sulfate d’ammonium et laisser le précipité se former en remuant vigoureusement à quatre degrés Celsius sur une période de quatre heures ou pendant la nuit. prochain.centrifugeuse le sulfate d’ammonium a précipité la solution à 15 000 fois g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Décanter le surnatant. À l’aide d’une spatule, recueillir le précipité et le transférer dans un bécher en verre de 200 millilitres.Resuspendez les granulés en 35 millilitres de tampon de liaison. Ensuite, transférez chacun environ 25 millilitres de suspension dans un tube de dialyse à cellulose régénéré. Placez le tube de dialyse en 2,5 litres du tampon de liaison en remuant sur un agitateur à quatre degrés Celsius pour dialyser la suspension.Remplacez la solution de dialyse après deux heures et continuez la dialyse pendant la nuit. Ensuite, transférez la suspension dialysée du tube aux tubes de centrifugeuse et placez les tubes dans la centrifugeuse à 20 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Avec l’équipement de filtration de section, versez le supernatant sur un filtre de membrane de 0,2 micromètre pour filtrer.Transférer le filtrate dans un flacon de 75 millilitres. Pour fractionner le gtfSI marqué en polyhistidine de la suspension filtrée, préparez d’abord une chromatographie d’affinité métallique immobilisée. Après avoir équilibré la résine selon le manuscrit, fermez la bite hoffman pincée.Ajouter cinq millilitres de la suspension filtrée dans la colonne pour faire un lisier. Ensuite, transférez toute la boue à la suspension filtrée restante et faites tourbillonner doucement le mélange pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Chargez le mélange dans la colonne.Ouvrez la bite hoffman pincement pour enlever la suspension par le flux de gravité. Lavez la résine IMAC avec 20 millilitres de tampon de liaison, puis, elute 20 millilitres de tampon d’élitution pour obtenir le gtfSI recombinant. Après cela, charger l’allongement dans un tube centrifuge ultra filtration et centrifugeuse la solution à 2000 fois g pendant une à cinq minutes pour concentrer la solution.Videz le contenant de filtrate et ajoutez 15 millilitres de tampon de stockage dans le tube. Centrifugez l’échantillon à nouveau et répétez le processus deux fois supplémentaires. La solution gtfSI recombinante est finalement concentrée à environ un millilitre.Transférer le concentré dans un tube de microcentrifugeuse et le conserver à quatre degrés Celsius. Continuez avec le protocole de restauration fonctionnelle de repos. Dans ce protocole, l’électrophorèse de gel d’agarose montre que la taille de chaque amplicon du premier PCR et du deuxième PCR a correspondu à la taille prévue.Les colonies de streptocoques mutans ont été transformées avec le deuxième produit PCR et plaquées sur les plaques d’auger d’infusion cerveau-coeur contenant de la spectinomycine. Les produits Colony PCR fonctionnent sur le gel agarose montre que chaque amplicon était de la taille prévue. La protéine purifiée avec la chromatographie immobilisée d’affinité de métal a été observée en tant que bande simple par SDS-PAGE.La tache occidentale, effectuée à l’aide de l’anticorps antihistidine, a confirmé que la bande observée était la protéine prévue de 160 kilodaltons marquée par la polyhistidine. La capacité de formation de biofilm dérivée du saccharose n’a été vue qu’avec le streptocoque mutans de type sauvage et le streptocoque mutans His-gtfC, qui a formé un biofilm adhérent sur la paroi du tube en présence de 1% de saccharose. Ceci n’a pas été observé dans streptococcus mutans delta gtfC.Cependant, l’ajout de 25 microgrammes du gtfSI recombinant a restauré la capacité de formation de biofilm adhérente dans le delta gtfC de delta de streptococcus mutans. Puisque le succès de cette méthode dépend de la deuxième amplification pcr, le deuxième produit PCR doit être confirmé par électrophoresis. Déjà, la protéine de type histidine obtenue par cette méthode se convoque également à des acides fonctionnels, tels que les interactions protéines-protéines.Après son développement, cette technique, combinée à la perturbation génétique, a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la microbiologie pour explorer la fonction génétique.

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