Cartographie du site de démarrage de la transcription à l'aide d'un transporteur-CAGE super-faible

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la régulation des gènes, car elle permet la découverte de promoteurs et d’exhausteurs de base en utilisant de faibles quantités de matériel de départ. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une cartographie impartiale et à l’échelle du génome de la résolution du nucléotide unique des sites de démarrage transcriptionnels de l’ARN polymésase II en utilisant seulement 10 nanogrammes d’ARN total. CAGE s’avère être inestimable pour découvrir les sites de démarrage de transcription associés à la maladie qui peuvent être utilisés comme marqueurs diagnostiques.

SLIC-CAGE étend ces découvertes à l’échelle des échantillons tels que les biopsies tissulaires. SLIC-CAGE est idéal pour l’analyse approfondie et à haute résolution des types de cellules fragiles, y compris les premiers stades embryonnaires de développement ou les tissus embryonnaires d’un large éventail d’organismes modèles. Puisqu’il y a de nombreuses étapes dans ce protocole, il est crucial de réduire au minimum la perte d’échantillon dans chaque étape en prenant soin de récupérer autant de matériel que possible lors du transfert entre les tubes.

Commencez par préparer le mix PCR pour chaque modèle. Combinez tampon, dNTP, amorce avant unique, modèle plasmide avec le gène porteur synthétique, et polymése de fusion selon les directions manuscrites. Mélanger les reagents par pipetting.

Ajouter 90 microlitres du mélange PCR à 10 microlitres de chaque amorce inversée et mélanger. Reportez-vous au manuscrit pour les conditions de thermocyclisme. Effectuez une transcription inversée ou RT sur l’ARN d’intérêt.

Combinez un microlitre d’amorce de transcription inverse, 10 nanogrammes d’ARN et 4 990 nanogrammes de mélange porteur dans un volume total de 10 microlitres. Mélanger en pipetant de haut en bas. Chauffer le mélange à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis le placer immédiatement sur la glace.

Préparer le mélange RT selon les instructions manuscrites et ajouter 28 microlitres du mélange à 10 microlitres d’ARN. Mélanger le contenu du tube par pipetting jusqu’à homogénéité. Exécutez RT dans un thermocycler.

Une fois la transcription inversée terminée, purifiez le produit avec des perles magnétiques SPRI sans DNase et RNase. Ajouter les perles au mélange RT à un rapport de volume de 1,8 pour un et bien mélanger par pipetting. Laisser reposer le mélange à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, placez les perles sur un support magnétique et laissez-les se séparer pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et ajoutez 200 microlitres d’éthanol fraîchement préparé à 70 % aux perles. Ne mélangez pas les perles ou ne les retirez pas du support magnétique et retirez l’éthanol immédiatement après l’ajout.

Gardez le tube sur le support magnétique et retirez toutes les traces d’éthanol en poussant les gouttelettes restantes à l’intérieur d’une pipette P10. Ajouter immédiatement 42 microlitres d’eau, et pipette de haut en bas 60 fois à l’échantillon épuute, en prenant soin de ne pas causer de mousse. Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes sans couvercle, puis séparer les perles sur le support magnétique.

Ensuite, transférez le supernatant dans un nouvel ensemble de tubes, en prenant soin de récupérer tous les supernatants, mais évitez le report de perles. Après le traitement RNase I, mélanger 45 microlitres d’échantillon avec 105 microlitres de perles de streptavidine préparées et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant l’incubation, pipette l’échantillon toutes les 10 minutes pour mélanger.

Ensuite, séparez les perles sur le support magnétique et retirez le surnatant. Laver les perles avec les tampons A, B et C.À partir du tampon A, réutiliser les perles dans 150 microlitres de tampon. Séparez-vous sur le support magnétique pendant deux à trois minutes, puis retirez le surnatant.

Préchauffer les tampons B et C à 37 degrés Celsius et répéter les étapes de lavage. Pour enlever complètement tous les ARN non plafonnés, il est crucial de bien laver les perles de streptavidine et les parois du tube et d’enlever complètement le tampon de lavage avant d’ajouter le prochain. Pour libérer l’ADNC, resuspendez les perles dans 35 microlitres de 1X RNase I tampon et incuber à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Après l’incubation, placez immédiatement les perles sur la glace pendant deux minutes. Séparez les perles sur un support magnétique et transférez le supernatant dans un nouvel ensemble de tubes. Resuspendez les perles en 30 microlitres de tampon 1X RNase I, puis séparez-les sur un support magnétique.

Combinez le supernatant avec le supernatant précédemment recueilli pour un volume total d’environ 65 microlitres. Effectuez qPCR pour déterminer le nombre de cycles PCR pour l’amplification de la bibliothèque cible. Préparez les mélanges de maître qPCR pour amplifier des bibliothèques entières d’ADN du transporteur.

Définissez les conditions de thermocyclisme selon les directives manuscrites et amplifiez l’échantillon préparé. Le protocole SLIC-CAGE permet d’obtenir des bibliothèques prêtes au séquençage à partir de nanogrammes de matériel d’ARN de démarrage. La longueur du fragment dans la bibliothèque finale varie entre 200 et 2000 paires de base.

Les fragments plus courts sont des artefacts PCR et peuvent causer des problèmes de séquençage en bas de la ligne. Des tours supplémentaires de sélection de taille peuvent être effectués pour les supprimer. Par rapport à NanoCAGE, SLIC-CAGE présente des performances significativement meilleures lors de l’identification du site de démarrage de transcription, ce qui est évident à partir des courbes caractéristiques de fonctionnement du récepteur des deux techniques effectuées sur diverses quantités d’ARN total S.cerevisiae.

Lors de l’exécution de ce protocole, il est important de garder à l’esprit que la perte d’échantillon peut conduire à des bibliothèques de faible complexité. Pour l’empêcher, des pointes et des tubes de pipette à faible liaison doivent être utilisés. Sans SLIC-CAGE, l’analyse des promoteurs de différents types de cellules a jusqu’à présent été inaccessible.

Cela comprend l’analyse des stades embryonnaires du développement ou du tissu embryonnaire à partir d’un large éventail d’organismes modèles.