Name: Transfert de neutrophiles tumoraux manipulés dans des souris porteuses de tumeurs pour étudier leur potentiel angiogénique In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Découvrez le transfert adoptif de neutrophiles traités par inhibiteur NAMPT dans des souris porteuses de tumeurs B16F10. Cette méthode permet d'évaluer le potentiel anti-angiogénique des neutrophiles tumoraux et leurs applications en immunothérapie.

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Notre travail a été soutenu par des subventions de Deutsche Krebshilfe, Numéro de subvention: 111647, et German Research Council (DFG), Grant Number: JA 2461/2-1.

Toutes les procédures, y compris les sujets animaux, ont été approuvées par les autorités de régulation : LANUV (Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) et Regierungspr'sidium T'bingen, Allemagne. Toutes les manipulations doivent être effectuées dans des conditions stériles (sous le capot à débit laminaire) à l'aide de réactifs et d'instruments stériles (seringues, ciseaux, forceps, scalpels jetables, vaisselle Petri).
REMARQUE : Le schéma global du protocole est indiqué dans la figure 1.
1. Préparation de la lignée cellulaire du mélanome B16F10
<ol><li>Préparer les cellules mycoplasme-négatives cultivées à une monocouche confluente de 90 % (environ 10 x 106 cellules/T75 flacon) dans le moyen modifié de Dulbecco d'Iscove (IMDMc : IMDM - sérum bovin fœtal (FBS) de 1 % de pénicilline-streptomycine).</li>
	<li>Retirez le milieu et rincez les cellules avec du phosphate salin (PBS). Appliquer 6 ml d'une solution de détachement cellulaire contenant des enzymes protéolytiques et collagènes (voir le Tableau des matériaux)et incuber à 37 oC pendant 2 min.</li>
	<li>Frappez doucement le flacon pour mobiliser les cellules adhérentes restantes du fond. Recueillir la suspension cellulaire dans des tubes de 15 ml et la centrifugeuse à 300 x g pendant 7 min et 20 oC.</li>
	<li>Retirez le supernatant et suspendez le puits de granule en 1 ml de PBS. Ajouter 14 ml de PBS et centrifugeuse (300 x g et 20 oC pendant 7 min).</li>
	<li>Retirez le supernatant et suspendez la pastille dans 1 ml de PBS.</li>
	<li>Comptez les cellules, et les resuspendre à la concentration de 3 x 106/mL PBS (pour l'étape 2) ou 6 x 106/mL PBS (pour l'étape 6) pour l'injection. Maintenir les cellules sur la glace pendant un maximum de 30 min.</li>
</ol>2. Modèle allogénique de tumeur chez les souris
<ol><li>Utilisez 10 femelles Ifnar1-/- souris de 8 à 12 semaines qui sont conservées dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes (FPS). NOTE : Les souris femelles sont préférables dans un modèle sous-cutané de la croissance de tumeur, puisque les mâles sont plus agressifs et donc enclins aux infractions du site de tumeur, qui influence la croissance de tumeur.</li>
	<li>Raser la peau de la souris sur le flanc avec un rasage électrique, et désinfecter la peau avec des tissus mouillés avec 70% d'éthanol.</li>
	<li>Recueillir les cellules du mélanome B16F10 préparées à une concentration de 3 x 106/mL PBS (voir l'étape 1) dans une seringue de 1 ml et 0,4 x 19 mm aiguille. Injecter 100 ml de la suspension sous-cutané.<ol>
<li>Mélanger les cellules bien avant chaque injection. Utilisez des aiguilles d'au moins 0,4 mm de diamètre pour ne pas déranger les cellules tumorales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez jusqu'à 5 souris dans une cage, et contrôlez la taille de la tumeur (longueur, largeur et profondeur) avec un étrier pendant 14 jours. REMARQUE: Selon les règlements animaux, la taille de la tumeur ne doit pas dépasser 15 mm de diamètre, les souris avec des tumeurs plus grandes ou nécrotiques / ouvertes doivent être sacrifiés à l'avance.</li>
	<li>Au jour 14, sacrifiez les souris dans la chambre CO2.</li>
	<li>Désinfecter la peau avec 70% d'éthanol et enlever les tumeurs avec des ciseaux et des forceps dans un plat stérile Petri. Gardez les tumeurs dans un tube de 50 ml dans le milieu aigle modifié complet de Dulbecco (DMEMc : DMEM - 10 % FBS - 1 % pénicilline-streptomycine) sur la glace.</li>
</ol>3. Isolement TAN
<ol><li>Placez les tumeurs dans des plaques stériles de 6 puits, 5 tumeurs par puits. Couper les tumeurs en morceaux de 2-3 mm avec des ciseaux stériles.<ol>
<li>Digest avec 1 mL de dispase/collagenase D/DNase I solution (0.2 mg/0.2 mg/100 mg dans 1 ml de DMEMc) par tumeur. Incuber à 37 oC, 5 % de CO2 dans un incubateur humide et mélanger avec une seringue de 10 ml sans aiguille toutes les 15 min 3 fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour enlever les fibres non digérées, maillez les cellules à travers des filtres de 100 m en tubes de 15 ml (un puits par filtre par tube). Ajouter le PBS à 15 ml, les tubes centrifugeants à 460 x g, 4 oC pendant 5 min, et retirer le supernatant.</li>
	<li>Lyse érythrocytes avec un tampon de lyse (NH4Cl 150 mM, KHCO3 10 mm, EDTA 0,1 mm, pH 7,3, 20 oC) en ajoutant 1 ml dans chaque tube. Bien mélanger et combiner la solution de tous les tubes en un seul. Arrêtez la réaction après 2 minutes avec 11 ml de dMEMc glacé (4 oC).</li>
	<li>Centrifugeuse à 460 x g, 4 oC pendant 5 min, et retirer le supernatant. Resuspendre la pastille avec 15 ml de PBS froid. Centrifugeuse à 460 x g, 4 oC pendant 5 min, et retirer le supernatant.</li>
	<li>Resuspendre la pastille dans 1 ml de PBS. Ajouter 3 ml d'anticorps à bloc Fc (CD16/CD32, stock 0,5 mg/mL), et couver sur la glace pendant 15 min.</li>
	<li>Ajouter les anticorps : 10 ml de Ly6G-PE (stock 0,2 mg/ml) et 10 ml de CD11b-APC (stock 0,2 mg/ml). Ajouter 20 ml de colorant de viabilité 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI, stock 5 mg/mL) et incuber sur la glace dans l'obscurité pendant 30 min. REMARQUE : Une autre combinaison de colorants de viabilité et de conjugues fluorescentes d'anticorps peut être utilisée.</li>
	<li>Ajouter le PBS jusqu'à 15 ml, la centrifugeuse à 460 x g, 4 oC pendant 5 min, et retirer le supernatant.</li>
	<li>Resuspendre la pastille dans DMEMc à la concentration d'environ 10 x 106/mL, et garder sur la glace.</li>
	<li>Trier les neutrophiles CD11bet Ly6Ghi alive (DAPI-négatif) avec un trieur de cellules activé par la fluorescence (stratégie de gating voir Figure 2). REMARQUE : Gardez le tube avec la suspension cellulaire et le tube avec DMEMc pour les cellules triées à 4 oC. Utilisez les réglages de tri optimaux suivants : une buse de 70 mm, un taux de seuil de 22 000 événements/seconde maximum et un débit de 1 à 3.</li>
	<li>Vérifiez la pureté des neutrophiles triés à l'aide d'un cytomètre pour une pureté recommandée de 'gt;95%.</li>
	<li>Centrifugeles triés neutrophiles à 460 x g, 4 oC pendant 5 min, et retirer le supernatant. Resuspendre les cellules triées dans DMEMc à la concentration de 1 x 106/mL. REMARQUE : Le nombre prévu de neutrophiles dans une tumeur de 14 jours de B16F10 (10 millimètres diamètre) est approximativement 3 x 104 cellules.</li>
</ol>4. Inhibition de NAMPT dans les TAN in vitro
<ol><li>Préparer le bouillon FK866 (inhibiteur nAMPT) dans le diméthylsulfoxide (DMSO) à une concentration finale de 100 mM.</li>
	<li>Neutrophiles triés (étape 3.11) en 2 puits d'une plaque de 96 puits en U-bas (1,5 x 105 neutrophiles/puits). Ajouter FK866 dans le puits d'intervention (concentration finale de 100 nM), et une quantité égale de DMEMc avec DMSO dans le puits de contrôle. Incuber pendant 2 h à 37 oC, 5 % de CO2 dans un incubateur humide.</li>
	<li>Centrifugeuse à 460 x g, 4 oC pendant 5 min, et retirer le supernatant. Resuspendre dans 200 ml de PBS dans chaque puits. Répéter 2 fois.</li>
	<li>Centrifugeuse à 460 x g, 4 oC pendant 5 min, et retirer le supernatant. Resuspendre dans le milieu commercial de croissance endothéliale de cellules (complété avec le supplément de croissance endothelial de cellules de 4 l/mL, 0.1 ng/mL recombinant le facteur épidermique humain, 1 ng/mL facteur de croissance de base de fibroblast humain, 90 'g/mL heparin et 1 'g/mL hydrocortisone) à une concentration finale de 0,2 x 106 cellules/mL (en 0,75 ml) (pour l'étape 5) ou en PBS à la concentration finale de 0,6 x 106 cellules/mL (en 0,25 ml) (pour l'étape 6).</li>
</ol>5. Estimation des propriétés angiogéniques des TAN à l'aide de l'ananneau aortique
<ol><li>Disséquer l'aorte thoracique d'une souris mâle C57BL/6J (WT). Nettoyer et couper en anneaux de largeur de 0,5 mm. Placer tous les anneaux dans un puits d'une plaque de 24 puits avec 1 ml de milieu de croissance endothéliale complété. Incuber toute la nuit à 37 oC, 5 % de CO2 dans un incubateur humide. REMARQUE: L'utilisation de jeunes souris mâles (moins de 8 semaines) pour la dissection de l'aorte est préférable, car ils donnent une réponse angiogénique plus robuste15.</li>
	<li>Remplissez les puits de la plaque à fond plat de 96 puits avec 50 l de matrice de membrane de sous-sol solubilisée, laissez le gel reposer pendant 30 min dans un incubateur humide de 37 oC et 5 % de CO2 pour permettre à la matrice de polymériser. Préparer au moins 3 puits par condition.</li>
	<li>Intégrez les anneaux dans la matrice de membrane solubilisée de sous-sol en plaçant un anneau aortique sur le dessus de la couche de matrice pleine, 1 anneau dans le centre de chaque puits. Ajouter 50 ll de matrice membranaire de sous-sol solubilisée pour couvrir chaque anneau.<ol>
<li>Placez la plaque dans un incubateur humide de 37 oC et 5 % de CO2 pendant 30 min pour permettre la polymérisation de la deuxième couche de matrice.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 150 mL/puits de milieu de croissance endothéliale complété et 2x104Ifnar1-/- TANs (contrôle et FK866-traité) (étape 4.4).</li>
	<li>Incuber la plaque pendant 14 jours à 37 oC, 5 % de CO2 dans un incubateur humide.</li>
	<li>Image à l'aide d'un microscope standard de contraste de phase et estimer la ramification endothéliale. L'évaluation quantitative des paramètres morphométriques et spatiaux des navires, y compris l'indice de ramification, peut être effectuée automatiquement à l'aide du programme de traitement d'image conçu pour les images scientifiques. REMARQUE : Les résultats des représentants sont représentés dans la figure 3.</li>
</ol>6. Transfert adoptif des neutrophiles traités dans le modèle allogénique de tumeur
<ol><li>Préparer les cellules du mélanome B16F10 (étape 1.6) en PBS à une concentration de 6 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Préparer 2 types de neutrophiles : les neutrophiles traités par FK866 et contrôler les neutrophiles non traités (étape 4.4) en PBS à une concentration de 6 x 105 cellules/mL. Mélanger les neutrophiles avec les cellules du mélanome B16F10 (le rapport final neutrophile/cellules tumorales 1:10) pour avoir 2 types de mélanges cellulaires.</li>
	<li>Prenez 10 souris Femelles WT 8-12 semaines, 5 dans chaque groupe. Raser la peau sur le flanc à l'etoile avec un rasage électrique et désinfecter avec 70 % d'éthanol.</li>
	<li>Injecter 100 l de la suspension cellulaire (étape 6.2) sous-cutanée avec une seringue à insuline et une aiguille de 0,4 mm de diamètre, aux deux groupes de souris. Placer 1-5 souris du même groupe dans une cage.</li>
	<li>Au jour 2, préparez 2 types de neutrophiles : les neutrophiles traités par FK866 et contrôlez les neutrophiles non traités (étape 4.4) en PBS à une concentration de 6 x 105 cellules/mL. Injecter 100 ll de suspension cellulaire (étape 6.4) i.v. dans la veine de la queue avec une seringue à insuline et une aiguille de 0,4 mm de diamètre, aux deux groupes de souris. Remettre les souris dans la cage.</li>
</ol>7. Mesure de croissance de tumeur, examen histologique
<ol><li>Surveillez la croissance tumorale tous les deux jours. Évaluer la taille de la tumeur avec des étriers et calculer le volume tumoral avec la formule V-4/3 '(hw2)/8 (h-hauteur, w -largeur, profondeur).</li>
	<li>Sacrifier les souris au jour 14 dans la chambre CO 2. Enlever les tumeurs et mesurer les poids tumoraux.</li>
	<li>Congeler les tumeurs dans un composé optimal de température de coupe dans l'azote liquide, et les stocker à -80 oC.</li>
	<li>Décongeler les échantillons à -20 oC et préparer des sections de 5 mm à l'aide d'un cryotome. Laisser sécher les cryocuts pendant 30 min à 20 oC. Fixer les sections en acétone froide de -20 oC pendant 2 min et les laisser sécher pendant 30 min à 20 oC.</li>
	<li>Bloc avec des anticorps De-bloc Fc (CD16/CD32, stock 0.5 mg/mL 1:500) en PBS pendant 1 h à 20 oC.</li>
	<li>Tache avec le lapin anti souris Laminin gamma anticorps (1:1500 en PBS, 200 'L) pour 1 h à 20 oC. Laver avec PBS trois fois.</li>
	<li>Tache avec anticorps anti-lapin de chèvre secondaire (stock 0.5 mg/mL, 1:400 en PBS,), anti-souris SMA (1:500 en PBS) et 2 L de DAPI (stock 5 mg/mL, 1:100 en PBS) dans un volume final de 200 'L de solution d'anticorps. Incuber pendant 1 h à 20 oC dans l'obscurité. Laver avec PBS trois fois.</li>
	<li>Sécher les toboggans pendant 20 minutes à 20 oC dans l'obscurité. Monter avec un support de montage anhydre pour la microscopie et couvrir d'un bordereau. Laisser sécher 1 h à 37 oC.</li>
	<li>Effectuer un examen microscopique. Quantifier la vascularisation en comptant le nombre total (en option) des navires Laminin et le nombre (zone) des navires développés s'ensontifiant. REMARQUE : Pour effectuer une analyse d'image, prenez toutes les images dans les mêmes conditions (lumière, contraste, grossissement). Dans ce cas, les paramètres de traitement sont fixes, et le traitement d'image devient complètement automatique. Les résultats représentatifs sont représentés dans la figure 4 et la figure 5.</li>
</ol>

<ol><li>Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+responsive+to+endogenous+IFN-beta+regulate+tumor+angiogenesis+and+growth+in+a+mouse+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).</li>
<li>Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+apoptosis+of+tumor+associated+neutrophils+in+the+absence+of+endogenous+IFN-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β.</a> International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).</li>
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<li>Skokowa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAMPT+is+essential+for+the+G-CSF-induced+myeloid+differentiation+via+a+NAD%28%2B%29-sirtuin-1-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway.</a> Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).</li>
<li>Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAD+Metabolism+in+Cancer+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">NAD Metabolism in Cancer Therapeutics.</a> Frontiers in Oncology. 8, 622(2018).</li>
<li>Audrito, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nicotinamide+phosphoribosyltransferase+%28NAMPT%29+promotes+M2+macrophage+polarization+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 125, 111-123 (2015).</li>
<li>Brentano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-B+cell+colony-enhancing+factor%2Fvisfatin%2C+a+new+marker+of+inflammation+in+rheumatoid+arthritis+with+proinflammatory+and+matrix+degrading+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities.</a> Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).</li>
<li>Jablonska, J., Wu, C. -F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR2-mediated+tumor+associated+neutrophilrecruitment+is+regulated+by+IFN-beta%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta.</a> International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).</li>
<li>Andzinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+induce+anti-tumor+polarization+of+tumor+associated+neutrophils+in+mice+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human.</a> International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).</li>
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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Malgré les progrès dans le traitement chirurgical et pharmacologique du cancer, la thérapie réussie demeure un défi. Puisque les cellules immunitaires sont connues pour jouer un rôle important dans la régulation de la croissance de tumeur, de nouvelles méthodes inhibant la tumorigenicité de telles cellules devraient être établies. Ici nous démontrons une approche nouvelle pour supprimer la croissance de tumeur par l'intermédiaire du transfert adoptif des neutrophiles tumeur-associés anti-angiogenic tumeur-associés. Le ci...

Les interférons de type I (IFN) jouent un rôle important dans la stimulation des réponses de l'hôte aux néoplasias, car l'absence de signalisation IFN de type I entraîne une croissance tumorale significativement élevée1. Un des mécanismes impliqués dans ce processus est la régulation de l'activité tumorigène des neutrophiles tumeur-associés, qui estcontrôlé par le récepteur de facteur 3 de colonie-stimulant (CSF3R) en aval signalant 2. Le facteur de stimulation de la colonie 3 (CSF3), ou facteur stimulant la colonie de granulocytes, a été montré pour activer la signalisation impliquant le phosphoribosyltransferase de nicotinamide (NAMPT)3,4. NAMPT est une enzyme limitant le taux pour la synthèse de dinuccléotide d'adénine de nicotinamide, qui améliore la glycolyse et régule la réparation d'ADN, l'expression de gène, et la réponse de stress favorisant la survie et la proliférationdecellules cancéreuses 5. Le NAMPT est surexprimé dans plusieurs types de cancer, y compris colorectal, ovaire, sein, gastrique, cancer de la prostate et gliomes6. NAMPT est essentiel non seulement pour les cellules tumorales, mais aussi pour une grande variété d'autres types de cellules qui sont présents dans les tumeurs, telles que les cellules myéloïdes - il conduit leur différenciation4, inhibe l'apoptose et stimuler l'expression de cytokines multiples ou enzymes dégradantes dans les macrophages7.
Les neutrophiles tumeur-associés représentent les modulateurs importants de la croissance de tumeur. Les fonctions TAN dépendent fortement de la disponibilité de type I IFN, car ces cytokines première activité antitumorale des neutrophiles. Au contraire, l'absence d'IFN soutient l'activation tumorigène de ces cellules, en particulier leurs propriétés pro-angiogéniques. En accord avec cela, les souris déficientes en IFN développent des tumeurs significativement plus grandes et mieux vascularisées, qui sont fortement infiltrées avec des neutrophiles pro-tumoral/pro-angiogéniques1,2,8, 9,10. Fait important, ces TAN pro-angiogéniques montrent une activité élevée de NAMPT, suggérant son rôle essentiel dans la polarisation pro-tumorale des neutrophiles.
L'épuisement des neutrophiles utilisant l'anticorps ly6G ou l'inhibition de leur migration (anticorps CXCR2) a comme conséquence l'angiogenèse diminuée de tumeur, la croissance, et la métastasie1,8. Néanmoins, les anticorps monoclonaux générés sont immunogènes, et leur administration est associée à une gamme d'effets secondaires représentant un danger pour la vie11. Le traitement avec de petites molécules, telles que l'inhibiteur de NAMPT FK866, qui modulent la tumoriogenicity de neutrophile, pourrait aider à éviter de telles complications. Malheureusement, l'inhibition systémique pharmacologique de NAMPT, à côté de son effet thérapeutique sur la croissance de tumeur, mène aux effets secondaires graves comprenant la toxicité gastro-intestinale et la thrombocytopenia. Par conséquent, l'application systémique des inhibiteurs nAMPT n'est pas faisable12,13,14.
Pour cette raison, nous suggérons ici un protocole où l'activité NAMPT est bloquée directement dans les NAN isolés. De tels neutrophiles antitumorales sont alors adoptifs transférés dans un hôte tumeur-portant. Ce protocole permettra d'éviter les effets secondaires toxiques systémiques des composés, tandis que son effet sur les cellules cibles sera maintenu.

<table><tbody><tr><td>Tubes de 15 ml</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml ; mbrecht, Allemagne</td><td>62 554 502</td><td></td></tr><tr><td>tubes de 50 ml</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>pointes stériles de 5 ml / 10 ml / 25 ml pour la pipette automatique</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td>6006180 / 607180 / 760180</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire à fond plat 6 puits</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml ; mbrecht, Allemagne</td><td>833 920</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire à fond plat à 96 puits</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire à fond en U à 96 puits</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Allemagne</td><td>65018</td><td></td></tr><tr><td>AMG EVOS fl Microscope inversé numérique</td><td>AMG, Bothel, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-souris CD11b</td><td>BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis</td><td>553312</td><td>clone M1/70, conjugué APC, 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-souris Ly6G</td><td>BioLegend, Californie, États-Unis</td><td>127608</td><td>clone 1A8, conjugué au PE, 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>BD FACS AriaII</td><td>BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis</td><td></td><td>trieur de cellules</td></tr><tr><td>Caliper</td><td>Vogel Germany, Kevelaer, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Casy</td><td>compteur de cellules Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Trics 50&micro ; m / 100 et micro ; m filtres stériles</td><td>Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Allemagne</td><td>04-004-2327 / 04-004-2328</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Rotina 420 R</td><td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Allemagne</td><td>4706</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dilactate)</td><td>BioLegend, Californie, États-Unis</td><td>422801</td><td>Stock : 5mg/ml</td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>D4818-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis</td><td>41966-029</td><td>DMEM complet : DMEM + 10 % FBS + 1 % de pénicilline-streptomycine</td></tr><tr><td>DMSO (diméthylsufoxide)</td><td>WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Allemagne</td><td>WAK-DMSO-10</td><td>CryoSure-DMSO</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance des cellules endothéliales</td><td>PromoCell, Heidelberg, Allemagne</td><td>c-22010</td><td></td></tr><tr><td>FBS (sérum de veau fœtal)</td><td>Biochrom, Berlin, Allemagne</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Fc-block (anti-souris CD16/32)</td><td>BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis</td><td>553142</td><td>clone 2.4G2, Stock : 0.5mg/mL</td></tr><tr><td>Chlorhydrate FK 866</td><td>Axon Medchem, Groningue, Pays-Bas</td><td>Axon 1546</td><td>Stock : 100 mM</td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Lapin IgG H& L</td><td>Abcam, Cambridge, Royaume-Uni</td><td>ab97075</td><td>Cy3-conjugué, Stock : 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Incubateur CO2 Heracell 240i</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis</td><td></td><td></td>51026334</tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis</td><td>12440-053</td><td>IMDM complet : IMDM + 10 % FBS + 1 % pénicilline-streptomycine</td></tr><tr><td>Isis GT420 rasoir</td><td>B. Braun Asculap, Suhl, Allemagne</td><td>90200714</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix membrane basale</td><td>Corning Life Sciences, Amsterdam, Pays-Bas</td><td>7205011</td><td></td></tr><tr><td>Microtome Cryostat Microm HM 505 N</td><td>Microm International GmbH, Walldorf, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-actine monoclonale, & alpha ;-Muscle lisse</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>F3777</td><td>FITC-conjugué, aucune information sur la concentration du stock</td></tr><tr><td>Aiguilles 0,4 mm x 16 mm</td><td>BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>Neomount</td><td>Merck, Darmstadt, Allemagne</td><td>HX67590916</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, États-Unis</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipette automatique</td><td>Hirschmann Laborger&auml ; te, Eberstadt, Allemagne</td><td>9907200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant avec DAPI</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>lapin anti souris Laminine gamma 1 chaîne</td><td>Immundiagnostik, Bensheim, Allemagne</td><td>AP1001.1</td><td>Aucune information sur la concentration du stock</td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis</td><td>A1105-01</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel d’élimination stérile (n° 15)</td><td>MedWare, Naples, États-Unis</td><td>120920</td><td></td></tr><tr><td>Seringues 1 ml</td><td>BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>303172 Seringues 10 ml</td><td>BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>Fioles stériles de culture cellulaire T75</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml ; mbrecht, Allemagne</td><td>833,911,302</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek, Torrance, États-Unis</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver.Z1 Microscope inversé avec coupe optique ApoTome</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transfert de neutrophiles tumoraux manipulés dans des souris porteuses de tumeurs pour étudier leur potentiel angiogénique in vivo

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

La contribution des neutrophiles à la régulation de la tumorigénèse reçoit une attention accrue. Ces cellules sont hétérogènes, et selon le milieu tumoral peut posséder une capacité pro- ou anti-tumorale. Une des cytokines importantes régulant des fonctions de neutrophile dans un contexte de tumeur sont des interférons de type I. En présence d'interférons, les neutrophiles gagnent des propriétés antitumorales, y compris la cytotoxicité ou la stimulation du système immunitaire. Inversement, l'absence d'un signal d'interféron a comme conséquence l'activité pro-tumorale pro en avant, caractérisée avec la stimulation forte de l'angiogenèse de tumeur. Récemment, nous pourrions démontrer que les propriétés pro-angiogéniques des neutrophiles dépendent de l'activation de la voie de signalisation de phosphoribosyltransferase de nicotinamide (NAMPT) dans ces cellules. L'inhibition de cette voie dans les neutrophiles tumeur-associés mène à leur phénotype anti-angiogenic puissant. Ici, nous démontrons notre modèle nouvellement établi permettant l'évaluation in vivo du potentiel tumorigenic des neutrophiles tumoraux-associés manipulés (TANs). Peu de temps après, les neutrophiles tumeur-associés pro-angiogenic peuvent être isolés des souris interféron-déficientes de tumeur-portantes et repolarized dans le phénotype anti-angiogenic en bloquant la signalisation de NAMPT. L'activité angiogénique de ces cellules peut être ensuite évaluée à l'aide d'un analyse de l'anneau aortique. Les TAN anti-angiogéniques peuvent être transférés dans les destinataires sauvages de type tumeur-portant s'ils portent et la croissance de tumeur devrait être surveillée pendant 14 jours. Au jour 14 souris sont sacrifiées, tumeurs enlevées et coupées avec leur vascularisation évaluée. Dans l'ensemble, notre protocole fournit un nouvel outil pour évaluer in vivo la capacité angiogénique des cellules primaires, telles que les neutrophiles tumeur-associés, sans avoir besoin d'employer des modèles artificiels de ligne de cellules de neutrophile. Vc

Utilisant la procédure décrite ici, Ifnar1-/- les neutrophiles ont été isolés des tumeurs et traités avec l'inhibiteur de NAMPT FK866 pendant 2 h. Ifnar1 non traité -/- les neutrophiles ont été employés comme contrôle. L'effectivité du traitement a été évaluée à l'aide de l'antoire aortique, qui reflète les étapes clés impliquées dans l'angiogenèse (dégradation de la matrice, migration, prolifération, réorganisation). Nous pourrions démontrer que ...

Ici, nous montrons le potentiel thérapeutique des neutrophiles tumeur-associés anti-angiogenic après leur transfert dans les souris tumeur-portantes. Ce protocole peut être utilisé pour manipuler l'activité neutrophile ex vivo et pour ensuite évaluer leur fonctionnalité in vivo dans le développement de tumeurs. Il s'agit d'un modèle approprié pour l'étude des immunothérapies potentielles à base de neutrophiles.

Transfert de neutrophiles tumoraux manipulés dans des souris porteuses de tumeurs pour étudier leur potentiel angiogénique In Vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Notre protocole fournit un nouvel outil pour évaluer le potentiel angiogénique des neutrophiles primaires tumeur-associés in vivo sans avoir besoin d’employer les modèles artificiels de ligne de cellules de neutrophile. L’inhibition directe de la phosphoribosyltransferase nicotinamide, bientôt NAMPT, dans les neutrophiles tumeur-associés avec leur transfert adoptif suivant dans les animaux tumeur-roulement permet la manipulation des neutrophiles sans effets secondaires toxiques systémiques. Nous démontrerons le potentiel thérapeutique des neutrophiles tumeur-associés anti-angiogenic manipulés après transfert dans les hôtes tumeur-roulements pour l’étude des immunothérapies neutrophile-basées potentielles dans différents modèles de cancer.Pour mettre en place un modèle allogénique de souris tumorale, rasez la peau de 10 souris femelles alpha interféron alpha et bêta-récepteurs de 1 mois avec un rasoir électrique et désinfectez la peau avec 70% d’éthanol, puis chargez trois fois 10 aux six cellules de mélanome B16F10 par millilitre de PBS dans une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de 0,4 par 19 millimètres et injectez 100 microlitres de la suspension sous-cutanée sur un

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Cette vidéo montre un test permettant de générer des neutrophiles associés aux tumeurs (TAN) anti-angiogéniques. Lors de la prise d’une tumeur de mélanome murin contenant des TAN pro-angiogéniques, les cellules uniques sont isolées à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et traitées avec un inhibiteur de la nicotinamide phosphoribosyl transférase (NAMPT) pour réduire la capacité à stimuler l’angiogenèse.

Génération de neutrophiles associés aux tumeurs anti-angiogéniques

Le cancer est une maladie complexe qui est influencé par les tissus entourant la tumeur ainsi que locale pro- et anti-inflammatoires des médiateurs. Par conséquent, les modèles d'injection orthotropes, plutôt que sous-cutanées modèles peuvent être utiles pour étudier la progression du cancer d'une manière qui imite mieux de pathologie humaine.

Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

Les neutrophiles jouent un rôle important non seulement dans la défense de l’hôte contre les micro-organismes envahisseurs, mais sont également impliqués dans la surveillance immunitaire des cellules tumorales. Ici, nous décrivons des techniques liées à l’isolement de neutrophiles ayant des propriétés antitumorales et des méthodes de surveillance de la fonction antitumorale des neutrophiles in vitro et in vivo.

Isolement et caractérisation de neutrophiles avec des propriétés anti-tumorales

Un modèle de tumeur primaire du cancer du sein orthotopique et l'ablation chirurgicale de la tumeur primitive pour prolonger la vie de la souris pour générer des métastases spontanées sont décrites. La croissance et la progression tumorale sont surveillés et quantifiés par imagerie par fluorescence luciférase.

Un modèle de souris orthotopique du sein spontané Cancer Métastase

Nous décrivons ici le modèle et l’approche pour étudier les fonctions des macrophages alvéolaires pulmonaires dans les métastases cancéreuses. Pour démontrer le rôle de ces cellules dans les métastases, le modèle syngénique (4T1) du cancer du sein en conjonction avec la déplétion du macrophage alvéolaire avec des liposomes clodronates a été utilisé.

L&#39;étude du rôle des macrophages alvéolaires dans le cancer du sein métastase

Ce manuscrit fournit une description de la méthodologie utilisée pour établir des modèles murins de transduction-transplantation. Un compte rendu détaillé est donné des erreurs techniques à éviter lors de la réalisation de greffes de moelle osseuse. Il faut bien comprendre l’importance d’un titre viral élevé, de la transfection/transduction et de l’irradiation.

Transduction-Transplantation Modèle de souris de syndrome myéloprolifératif

Ce protocole décrit l’imagerie intravitale des souris transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents spécifiques des cellules. Intravitale imagerie fournit une méthode non invasive pour les observations à haute résolution dans les animaux vivants à l’aide de windows implantables permettant la visualisation microscopique des processus est possible. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier les processus longitudinales.

La microscopie intravitale du système vasculaire associées à la tumeur en utilisant Advanced dorsale pli fenêtre Chambers sur des souris transgéniques fluorescents

Nous décrivons deux méthodes pour évaluer la perméabilité vasculaire transitoire liée au microenvironnement de tumeur de la fonction de porte de métastasie (TMEM) et de l'intravasation de cellules cancéreuses utilisant l'injection intraveineuse du poids moléculaire élevé (155 kDa) dextran chez les souris. Les méthodes incluent l'imagerie intravitale chez les animaux vivants et l'analyse des tissus fixes à l'aide de l'immunofluorescence.

Évaluation du microenvironnement tumoral de la perméabilité vasculaire médiée par la voie de la metastasie associée à la dissémination des cellules cancéreuses à l'aide de l'imagerie intravitale et de l'analyse des tissus fixes

Ici, nous présentons un protocole de transplantation tumorale pour la caractérisation des lymphocytes infiltrés tumoraux inhérents à la tumeur et dérivés de la périphérie dans un modèle tumoral murin. Le traçage spécifique de l’afflux de cellules immunitaires dérivées du receveur avec cytométrie en flux révèle la dynamique des changements phénotypiques et fonctionnels de ces cellules au cours des réponses immunitaires antitumorales.

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Cet article décrit un flux de travail de techniques utilisées pour tester de nouveaux médiateurs candidats de métastases de mélanome et leur(s) mécanisme(s) d’action.

Une plateforme de découverte robuste pour l’identification de nouveaux médiateurs de métastases de mélanome

Le manuscrit décrit une méthodologie pour l’établissement ainsi que le suivi longitudinal de la croissance des métastases pulmonaires spontanées à partir de tumeurs mammaires injectées orthotopiquement, susceptible d’intervention à tous les stades de la cascade métastatique.

In vivo Imagerie pour mesurer les métastases pulmonaires spontanées de cellules tumorales mammaires injectées orthotopiquement

Découvrez le transfert adoptif de neutrophiles traités par inhibiteur NAMPT dans des souris porteuses de tumeurs B16F10. Cette méthode permet d'évaluer le potentiel anti-angiogénique des neutrophiles tumoraux et leurs applications en immunothérapie.

Transfert de neutrophiles tumoraux manipulés dans des souris porteuses de tumeurs pour étudier leur potentiel angiogénique In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal

Transfert de neutrophiles tumoraux manipulés dans des souris porteuses de tumeurs pour étudier leur potentiel angiogénique In Vivo

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