Name: In Vivo Immunofluorescence Localisation pour lévaluation de la biodistribution thérapeutique et diagnostique des anticorps dans la recherche sur le cancer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Apprenez la méthode IVIL pour évaluer la biodistribution d'anticorps thérapeutiques et diagnostiques dans des modèles murins de cancer. Cette technique permet de visualiser en temps réel la distribution des anticorps dans l'animal vivant.

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Nous remercions le Dr Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) pour les discussions et l'utilisation de l'équipement. Nous remercions le Dr Juergen K. Willmann pour son mentorat. Cette étude a été appuyée par la subvention du NIH R21EB022214 (KEW), la subvention de formation NIH R25CA118681 (KEW) et le NIH K99EB023279 (KEW). Le Stanford Neuroscience Microscopy Service a été soutenu par NIH NS069375.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité administratif institutionnel sur les soins aux animaux de laboratoire (APLAC) de l'Université Stanford.
1. Modèle de souris transgénique du développement du cancer du sein
<ol><li>Observez des souris du modèle désiré de cancer pour la croissance appropriée de tumeur par l'intermédiaire de la palpation ou de la mesure d'étrier avant de procéder. REMARQUE : Ici, le modèle murin transgénique du développement de cancer du sein (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT) a été employé. Ces animaux développent spontanément des carcinomes invasifs de sein entre 6 et 12 semaines d'âge dans chaque glande mammaire20. Les glandes mammaires normales ont été employées comme contrôles des transgene-négatifs, les compagnons de litière âge-assortis.</li>
</ol>2. Injection intraveineuse d'agents anticorps spécifiques et non spécifiques
<ol><li>Purififier les anticorps anti-souris B7-H3 et igG de contrôle de l'isotype de lapin sur une colonne de dessalement (p. ex., PD-10) pour enlever les conservateurs et les tampons de stockage suivant les instructions du fabricant. REMARQUE: Certains anticorps peuvent avoir besoin d'une purification plus poussée avec des perles de protéines-A agarose protocole basé21.</li>
	<li>Aliquot doses de 33 g de chaque anticorps conjugué dans des tubes de microcentrifuge individuels. REMARQUE : Le dosage de l'agent administré peut varier en fonction de l'application et correspond aux doses auxquelles le conjugué d'anticorps est couramment utilisé. La concentration des solutions d'anticorps est nécessaire si le volume est supérieur à 100 L pour la sécurité des animaux.</li>
	<li>Au moment désiré avant la collecte des tissus, ici 96 h, anesthésier l'animal porteur de tumeur avec 2% d'isoflurane coulant dans l'oxygène à 2 L/min, et placer sur une scène chauffée à 37 oC. Faites une pincée d'orteil pour s'assurer que le niveau approprié de l'anesthsia a été atteint avant la procédure.</li>
	<li>Pour se préparer à l'inoculation des veines de la queue des solutions d'anticorps, désinfectez la queue de l'animal en essuyant trois fois avec une lingette d'alcool. Dilater les veines de la queue en se réchauffant à l'auto-néavech à environ 30 s. Évitez de chauffer l'animal entier. Essuyez la queue une fois de plus avec une lingette d'alcool après avoir enlevé le coussin chauffant.</li>
	<li>À l'aide d'un cathéter de veine de queue de 27G, insérez l'aiguille de papillon dans l'une des deux veines latérales de queue et fixez soigneusement la queue avec l'aiguille insérée à la scène avec un morceau de ruban chirurgical. REMARQUE : Le reflux sanguin visible dans le cathéter indique l'emplacement approprié de l'aiguille dans la veine de la queue.</li>
	<li>Rincer le cathéter avec 25 l de phosphate stérile tamponné saline (PBS), puis injecter la solution d'anticorps dans le cathéter à l'aide de seringues à insuline. Rincer le cathéter une fois de plus avec 25 l de PBS stérile.</li>
	<li>Retirez l'aiguille de la queue et exercez une pression pour arrêter tout saignement.</li>
	<li>Éteignez l'anesthésie et observez l'animal jusqu'à ce qu'il soit complètement éveillé pour déceler tout signe de détresse.</li>
</ol>3. Collecte et préparation des tissus tumoraux cibles
<ol><li>Au moment souhaité, euthanasier humainement l'animal selon la procédure institutionnelle acceptable, ici, par inhalation progressive de 100% de CO2 à partir d'un réservoir de gaz comprimé avec un débit de déplacement de chambre de 10-30% volume/min. REMARQUE: Certaines applications de la technique IVIL nécessitent l'euthanasie par perfusion cardiaque avec PBS pour enlever les anticorps circulant librement19,22.</li>
	<li>Après confirmation de l'euthanasie humaine par cessation du mouvement respiratoire et cardiaque, manque de réponse de pincement d'orteil, et grisonnant des muqueuses, des tissus de tumeur d'accise utilisant des ciseaux chirurgicaux et des forceps comme suit :<ol>
<li>Posez la souris en position de supine et ne saisissant que la couche externe de la peau entre l'ensemble des glandes mammaires les plus proches de la queue (5e) avec des forceps, faire une petite incision avec une paire de ciseaux chirurgicaux.</li>
		<li>Introduisez les ciseaux fermés dans la coupe et ouvrez lentement la pointe pour séparer soigneusement la peau de la membrane abdominale sous-jacente la gardant intacte.</li>
		<li>Faire une incision verticale jusqu'à l'abdomen, en continuant à séparer la peau de la membrane interne. Entre les glandes mammaires 3rd et 4e, faire une coupe horizontale à travers l'abdomen pour permettre la rétraction de la peau et la visualisation des glandes mammaires. REMARQUE : Les tumeurs et les glandes mammaires sont situées superficiellement sous la peau.</li>
		<li>Saisir chaque tumeur ou glande normale avec des forceps, couper soigneusement la peau attachée à l'aide de ciseaux chirurgicaux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer les tissus excisés dans des moules de base jetables tissulaires, préétiquetés et remplis d'une température de coupe optimale (OCT) en castré e moyen et congeler les moules rapidement en les plaçant sur de la glace sèche. Afin d'étudier l'accouchement hors cible, exciser d'autres tissus ou organes d'intérêt(p. ex., le foie ou les poumons). REMARQUE : Pour mettre en pause le protocole à ce stade, entreposez les blocs de tissus congelés à -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient prêts à aller de l'avant.</li>
	<li>À l'aide d'un cryostat, sectiondes de blocs de tissus congelés d'une épaisseur de 10 m et placez les sections adjacentes sur des lames de verre d'adhérence préétiquetées. REMARQUE : Pour mettre en pause le protocole à ce stade, entreposez les diapositives à -80 oC jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à aller de l'avant.</li>
</ol>4. Protocole de coloration Ex vivo
REMARQUE : Pour la comparaison quantitative entre les images de microscopie de fluorescence, toutes les diapositives sont tachées en même temps avec les mêmes solutions préparées.
<ol><li>Rincer les lames de tissu congelés avec PBS à température ambiante pendant 5 min pour enlever l'OCT.</li>
	<li>Délimiter les sections de tissu avec un stylo de barrière hydrophobe pour réduire le volume des solutions nécessaires pendant la coloration. REMARQUE : Veillez à ne pas laisser le stylo courir sur les échantillons de tissus, car il peut soit enlever le tissu de la glissière ou empêcher la coloration appropriée sur la partie tissulaire affectée. Ne laissez pas les sections de tissu se déshydrater à tout moment.</li>
	<li>Fixer les sections de tissu avec une solution de paraformaldéhyde de 4% pendant 5 min.</li>
	<li>Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min.</li>
	<li>Perméabilize sections de tissu avec 0.5% Triton-X 100 dans PBS pendant 15 min.</li>
	<li>Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min.</li>
	<li>Bloquer les tissus avec 3% w / v albumine de sérum bovin (BSA) et 5% v / v sérum de chèvre, à la fois en PBS (solution de blocage) pour 1 h à température ambiante. REMARQUE : Associez le sérum de la solution de blocage à l'animal hôte de l'anticorps secondaire.</li>
	<li>Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min.</li>
	<li>Incuber des sections avec des anticorps primaires de tenue de dossiers comme désiré, peut-être un nucléaire commun (par exemple, DAPI), vasculaire (par exemple, CD31), ou marqueur cytoplasmique (par exemple, actine). Ici, rat anti-souris CD31 (marqueur vasculaire) à une dilution 1:100 a été utilisé selon les instructions du fabricant dans la solution de blocage pendant la nuit à 4 oC protégé contre la déshydratation sur un plateau de diapositives. REMARQUE : N'ajoutez pas d'anticorps primaires supplémentaires ou de conjugués d'anticorps. Le conjugaison qui a été injecté et a permis de s'accumuler dans les tissus in vivo agissent comme l'anticorps primaire.</li>
	<li>Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min trois fois, en changeant le PBS à chaque fois.</li>
	<li>Incuber des diapositives avec des anticorps secondaires pour étiqueter les anticorps primaires. Pour cette application, visualisez l'anticorps anti-B7-H3 à l'aide d'anticorps anti-lapin de chèvre conjugués AlexaFluor-546 (1:200 dilution, optimisé selon les instructions du fabricant) et CD31 avec un anticorps secondaire antirat de chèvre AlexaFluor-488 (1:200 dilution, optimisée selon les instructions du fabricant) dans la solution de blocage, protégée de la lumière et de la déshydratation sur un plateau coulissant, pendant 1 h à température ambiante. REMARQUE : Les anticorps secondaires proviennent du même animal hôte, mais correspondent à l'affinité des anticorps secondaires avec l'espèce hôte de l'anticorps primaire respectif. Les glissières sont protégées de la lumière à partir de ce point.</li>
	<li>Rincer les diapositives en PBS pendant 5 min trois fois, en changeant le PBS à chaque fois.</li>
	<li>Appliquer une goutte du milieu de montage dans le centre de la tranche de tissu et placer soigneusement un bordereau en évitant le piégeage des bulles d'air.</li>
	<li>Sceller les bords de la glissière avec du vernis à ongles transparent et laisser sécher. REMARQUE : Pour mettre en pause le protocole jusqu'à une semaine à ce stade, rangez les diapositives à -20 oC jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à aller de l'avant.</li>
</ol>5. Imagerie par microscopie confocale et analyse quantitative de l'image
REMARQUE : La préparation du microscope confocal et des paramètres d'imagerie dépendra du système confocal utilisé. Le microscope utilisé ici a été acheté commercialement (p. ex., système Zeiss LSM 510 Meta) et le logiciel d'acquisition associé a été utilisé (p. ex., Zen 2009). Cependant, beaucoup de ces étapes s'appliqueront à n'importe quel microscope confocal et assumeront la connaissance confocale de base de microscopie.
<ol><li>Une fois que le système a été activé et réchauffé, sélectionnez l'objectif souhaité; ici, un objectif 20x (ouverture numérique de 0,8) a été utilisé.</li>
	<li>Chargez une glissière de contrôle positive, cale zona vers le bas, pour permettre de définir l'optimisation pour le signal le plus lumineux. Imagerie dans le canal rouge, concentrer le système sur l'échantillon en mode d'imagerie en direct.</li>
	<li>Pour chaque canal laser utilisé, optimisez l'intensité laser, le gain maître et la taille du sténopé comme suit :<ol>
<li>Passez au mode continu pour l'imagerie.</li>
		<li>Optimisez l'intensité laser (qui contrôle la puissance laser) et Gain (Master) (qui contrôle la tension pour le tube photomultiplicateur) des barres de glissière tout en surveillant l'histogramme de la table De recherche (LUT). Ajustez ces deux paramètres jusqu'à ce que la plage dynamique de l'histogramme soit remplie sans saturer les pixels. REMARQUE : Si l'intensité laser est trop élevée, il y aura un photoblanchiment. Si le Gain (Master) est trop haut, l'image deviendra bruyante. Idéalement, le Gain (Master) sera au milieu de sa gamme.</li>
		<li>Définir le trou d'épingle à 1 unité aérée (AU), qui donne la plus haute résolution et la plus fine z-tranche.</li>
		<li>Faites glisser la barre de compensation numérique pour minimiser le plancher de bruit sur l'histogramme LUT pour un vrai fond noir. REMARQUE : Une fois que les paramètres de microscopie sont optimisés pour chaque canal laser et objectif, gardez-les constants tout au long de la séance d'imagerie et pour l'imagerie de toutes les diapositives, afin de permettre la comparaison quantitative entre les diapositives.</li>
	</ol></li>
	<li>Sous l'onglet Mode d'acquisition, sous La moyenne,sélectionnez le Nombre et la Profondeur Bitsouhaités. Cliquez sur le bouton Optimal pour définir la taille optimale des pixels.</li>
	<li>Utilisez le bouton d'acquisition Snap pour collecter une image de haute qualité. Ici, des champs de vision aléatoires ont été sélectionnés à l'intérieur de la tumeur, mais d'autres domaines d'intérêt peuvent s'appliquer à différentes applications (navires, marges tumorales, profondeur de pénétration, etc.)</li>
	<li>Enregistrer les fichiers d'images dans le format utilisé par le logiciel confocal (ici, ".lsm") pour le traitement hors ligne et la quantification. REMARQUE : Si toutes les diapositives ne sont pas représentées au cours de la même session, enregistrez les paramètres et rechargez-les lors des visites ultérieures, bien que la réimagerie de la même diapositive ne soit pas recommandée en raison du photoblanchiment.</li>
	<li>Effectuer les mesures quantitatives de l'intensité de la fluorescence. Open Fiji (Fiji Is Just ImageJ software)19,23 et charger un fichier d'image .lsm en faisant glisser sur la barre d'état.</li>
	<li>Divisez les données du canal couleur. Aller à l'image 'gt; Stacks 'gt; Split Channels.</li>
	<li>Prétraiter les images de fluorescence au besoin, c'est-à-savoir, soustraire le signal d'arrière-plan (Processus 'gt; Soustract Background)ou réduire le bruit via une méthode de filtrage.</li>
	<li>Segmenter le canal de couleur correspondant à la protéine de référence (vasculaire, nucléaire, tache cellulaire) en fixant un seuil sur l'intensité du signal (Image 'gt; Ajuster 'gt; Seuil). REMARQUE : Le seuil manuel introduit la subjectivité dans l'analyse d'image, par conséquent, à l'aide d'un algorithme de seuil automatisé ou en faisant référence aux histogrammes d'image, ce qui rend les résultats de l'analyse d'image moins biaisés.</li>
	<li>Utilisez ce seuil pour créer un masque binaire (Processus 'gt; Binaire 'gt; Convertir en Masque).</li>
	<li>Mesurer et étiqueter les ROI dans le masque (Analyser les particules 'gt; Check Add to Manager 'gt; OK).</li>
	<li>Appliquer ROIs sur le canal de couleur correspondant à l'anticorps d'intérêt (Cliquez sur l'image du canal, Analyser 'gt; Outils 'gt; GESTIONNAIRE de roi-roi 'gt; Mesure). Cela appliquera le masque ROIs à l'image de l'anticorps et fournira des mesures d'image pour les sections d'étiquette dans la fenêtre Résultats. Enregistrer la fenêtre de résultats (Fichier 'gt; Enregistrer).</li>
	<li>Calculer la statistique d'intérêt souhaitée, comme l'intensité moyenne de fluorescence telle que décrite ici24.</li>
	<li>Effectuez toutes les étapes de traitement de manière identique à chaque image dans un ensemble de diapositives. Créez une macro pour le faire automatiquement pour les lots d'images23.</li>
	<li>Pour l'affichage de l'image seulement après des mesures quantitatives, appliquer des ajustements d'image qualitativepour optimiser la visualisation des modèles de biodistribution en ajustant le minimum, le maximum, la luminosité et le contraste aux mêmes niveaux sur toutes les diapositives(Image 'gt; Ajuster Luminosité/contraste).</li>
	<li>Convertir le type d'image (Image 'gt; Type 'gt; RGB Color) et enregistrer des fichiers dans un type d'image sans perte tels que .tiff (Fichier 'gt; Enregistrer comme 'gt; Tiff ...) pour une utilisation dans les présentations et les publications.</li>
</ol>

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<li>Scalia, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Masking+During+Fixation+and+Embedding%2C+Dissected%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).</li>
<li>Robertson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+labeled+tomato+lectin+for+imaging+vasculature+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures.</a> Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).</li>
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<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li>
<li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Fluorescence+Immunohistochemistry%3A+Localization+of+Fluorescently+Labeled+Cetuximab+in+Squamous+Cell+Carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
<li>Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+resistance+to+immune+checkpoint+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors.</a> British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).</li>
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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Cette méthode comporte plusieurs étapes critiques et nécessite des modifications potentielles pour assurer une mise en œuvre réussie. Tout d'abord, la posologie et le moment de l'injection intraveineuse d'anticorps/anticorps conjugués doivent être adaptés à l'application spécifique. En général, des doses doivent être utilisées qui sont compatibles avec la façon dont le conjugaison d'anticorps sera généralement utilisé, c'est-à-dire, des doses assorties de l'anticorps thérapeutique ou de l'agent de contraste à base d'anti...

Les anticorps monoclonaux (mAb) sont de grandes glycoprotéines (environ 150 kDa) de la superfamille d'immunoglobuline qui sont sécrétées par les cellules B et ont une fonction primaire dans le système immunitaire pour identifier et inhiber la fonction biologique de, ou marquer pour pathogènes bactériens ou viraux, et peuvent reconnaître l'expression protéique anormale sur les cellules cancéreuses1. Les anticorps peuvent avoir une affinité extrêmement élevée avec leurs épitopes spécifiques jusqu'aux concentrations femtomolaires, ce qui en fait des outils très prometteurs en biomédecine2. Avec le développement de la technologie hybridome par Milstein et Kohler (prix Nobel en 1984), la production de mAbs est devenu possible3. Plus tard, mAbs humains ont été générés en utilisant la technologie d'affichage de phage ou souches transgéniques de souris et ont révolutionné leur utilisation comme outils de recherche et thérapeutiquesnouvelles 4,5.
Le cancer est un problème de santé mondial et une cause majeure de décès, créant la nécessité de nouvelles approches pour la prévention, la détection et la thérapie6. Jusqu'ici, les mAbs ont permis l'extraction du rôle des gènes et de leurs protéines dans la tumorigénèse et une fois dirigécontre des biomarqueurs de cancer, peut permettre la détection et la caractérisation de tumeur pour la stratification patiente. Pour la thérapie de cancer, les mAbs bispécifiques, les conjugués anticorps-médicaments, et de plus petits fragments d'anticorps sont développés comme thérapeutiques, et pour l'administration ciblée de drogue pour augmenter l'efficacité thérapeutique7. En outre, les anticorps servent pour le ciblage de biomarqueurs des agents de contraste pour des modalités d'imagerie moléculaire telles que la chirurgie fluorescence-guidée, l'imagerie photoacoustique (PA), l'imagerie moléculaire d'ultrason (US), et l'émission médicalement employée de positron tomographie (PET) ou tomographie calculée par émission de photons (SPECT)8. Enfin, les anticorps peuvent également être utilisés comme agents théranostiques permettant la stratification des patients et la surveillance de la réponse pour les thérapies ciblées9. Par conséquent, les nouveaux mAbs commencent à jouer un rôle critique dans la détection, le diagnostic et le traitement du cancer.
En dépit des progrès critiques dans le développement et la production des mAbs nouveaux et fortement spécifiques, les applications diagnostiques et thérapeutiques peuvent être rendues inefficaces en raison de la complexité de l'environnement de tumeur. Les interactions entre anticorps dépendent du type d'épitopée, c'est-à-dire qu'il soit linéaire ou conformationnel10. En plus de la reconnaissance des antigènes, les anticorps doivent surmonter les barrières naturelles telles que les parois des vaisseaux, les membranes basales et le stroma tumoral pour atteindre les cellules cibles exprimant l'antigène. Les anticorps interagissent avec le tissu non seulement à travers le domaine de liaison d'antigène à fragment variable (Fab), mais aussi à travers le fragment cristallin constant (Fc) qui conduit à des interactions hors site11. Le ciblage est également compliqué par l'expression hétérogène des marqueurs de tumeur tout au long du volume de tumeur et de l'hétérogénéité dans la vascularisation de tumeur et le système lymphatique12,13. En outre, le microenvironnement de tumeur est composé des fibroblastes cancer-associés qui soutiennent des cellules de tumeur, des cellules immunitaires de tumeur qui suppriment des réactions immunitaires antitumorales, et de l'endothélium de tumeur qui soutient le transport de l'oxygène et des éléments nutritifs, tous des qui interfèrent avec la pénétration, la distribution et la disponibilité de thérapies ou de diagnostics à base d'anticorps. Dans l'ensemble, ces considérations peuvent limiter l'efficacité thérapeutique ou diagnostique, réduire la réponse au traitement, et peut entraîner une résistance tumorale.
Par conséquent, pour le développement de thérapies et de diagnostics efficaces à base d'anticorps, il est crucial d'évaluer la biodistribution et l'interaction de la conjugaison à base d'anticorps dans le microenvironnement tumoral. Actuellement, dans les études précliniques, l'expression de marqueur dans les modèles de recherche de tumeur est analysée ex vivo par la coloration d'immunofluorescence (IF) des sections de tumeur14. La coloration standard de SI est exécutée avec les anticorps marqueurs-spécifiques primaires qui sont alors accentués par les anticorps fluorescents secondaires sur des tranches de tissu de tumeur ex vivo qui ont été isolées de l'animal. Cette technique met en évidence l'emplacement statique du marqueur au moment de la fixation du tissu et ne donne pas un aperçu de la façon dont les traitements ou les diagnostics à base d'anticorps pourraient se répartir ou interagir dans des conditions physiologiques. L'imagerie moléculaire par PET, SPECT, US, et PA peut fournir des informations sur la distribution d'agent de contraste conjugué par anticorps dans les modèles précliniques vivants8,15. Comme ces modalités d'imagerie ne sont pas invasives, des études longitudinales peuvent être effectuées et des données sensibles au temps peuvent être recueillies avec un nombre minimal d'animaux par groupe. Cependant, ces approches d'imagerie moléculaire non invasives ne sont pas assez sensibles et n'ont pas une résolution suffisante pour la localisation de la distribution des anticorps au niveau cellulaire. En outre, les caractéristiques physiques et biologiques de l'anticorps primaire peuvent être radicalement modifiées par la conjugaison d'un agent de contraste16.
Afin de prendre en considération les conditions physiologiques et pathologiques in vivo de la façon dont les thérapies et les diagnostics à base d'anticorps interagissent dans l'environnement tumoral et d'obtenir une distribution cellulaire et même sous-cellulaire à haute résolution profils des anticorps non conjugués, nous proposons une approche de IF, réputée localisation d'immunofluorescence in vivo (IVIL), dans laquelle l'anticorps antigène-spécifique est injecté par voie intraveineuse in vivo. Le thérapeutique ou le diagnostic à base d'anticorps, agissant comme un anticorps primaire, circule dans les vaisseaux sanguins fonctionnels et se lie à sa protéine cible dans le cadre tumoral très précis et vivant. Après l'isolement des tumeurs in vivo-étiquetées avec l'anticorps primaire, un anticorps secondaire est employé pour localiser les conjugués accumulés et retenus d'anticorps. Cette approche est similaire à une approche d'histologie DE LA SI précédemment décrite injectant des anticorps étiquetés fluorescents17. Bien qu'ici, l'utilisation d'anticorps non conjugués évite un changement potentiel dans les caractéristiques de biodistribution induites par la modification des anticorps. En outre, l'application ex vivo d'anticorps secondaires fluorescents évite une perte possible du signal de fluorescence pendant la collecte et le traitement des tissus et fournit l'amplification de l'intensité du signal de fluorescence. Notre approche d'étiquetage reflète la biodistribution in vivo de médicaments à base d'anticorps et d'agents ciblés et peut fournir des informations importantes pour le développement de nouveaux agents diagnostiques et thérapeutiques.
Ici, nous décrivons deux applications de la méthode IVIL appliquées dans des études précédentes portant sur la biodistribution et l'accessibilité des agents de contraste à base d'anticorps pour les approches d'imagerie moléculaire pour la détection du cancer du sein. Tout d'abord, la biodistribution d'un colorant infrarouge proche de l'anticorps (anticorps-B7-H3 liés au colorant de fluorescence infrarouge proche, vert endocyanine, B7-H3-ICG) et l'agent de contrôle de l'isotype (Iso-ICG) pour la fluorescence et la photoacoustique moléculaire l'imagerie est explorée18. La méthode de cette application est décrite dans le protocole. Ensuite, les résultats de biodistribution d'un anticorps conformationnellement sensible à la netrin-1, généralement non détectable avec l'imagerie FI traditionnelle, utilisé avec l'imagerie moléculaire par ultrasons, est quantifié et présenté dans les résultats représentatifs19. À la fin de ce document de protocole, les lecteurs devraient se sentir à l'aise d'adopter la méthode IVIL pour leurs propres applications de recherche basées sur les anticorps.

<table><tbody><tr><td>Animal Model</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td></td><td>002374 Femelles, 4-6 semaines</td></tr><tr><td>Animal Handling Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G</td><td>Catheter VisualSonics</td><td>Veuillez appeler pour commander Vevo</td><td>MicroMarker Tail Vein Vein Crelief Crelief Calone.</td></tr><tr><td>Lingettes imbibées d’alcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246073</td><td></td></tr><tr><td>Éponges de gaze (4 » x 4 » 16 plis)</td><td>Cardinal Health</td><td>2913</td><td></td></tr><tr><td>Lampe chauffante</td><td>Morganville Scientific</td><td>&nbsp ; HL0100</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein Santé animale</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0490117</td><td></td></tr><tr><td>Ruban chirurgical</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Collection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Base Molds</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-556</td><td></td></tr><tr><td>Température de coupe optimale (OCT) Moyenne</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Pince chirurgicale London</td><td>Outils de science fine</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>Outils de science fine</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td><forts>Anticorps</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-488 chèvre anti-rat IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-546 chèvre anti-lapin IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11010</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-594 chèvre anti-humain IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11014</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle des isotypes IgG humains</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-97043</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-nétrine-1 humanisé&nbsp ;</td><td>Netris Pharma</td><td></td><td>contact@netrispharma.com</td></tr><tr><td>Lapin anti-Souris CD276 (B7-H3)</td><td>Abcam</td><td>ab134161</td><td>EPNCIR122 Clone</td></tr><tr><td>Rat anti-Souris CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>MEC 13.3 Clone</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles Polonais</td><td></td><td></td><td>N’importe quelle pharmacie locale</td></tr><tr><td>Indocyanine Green - NHS</td><td>Intrace Medical</td><td>ICG-NHS ester</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TA-006-FM</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>normal Fisher Scientific</td><td>ICN19135680</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate stérile Saline tamponnée (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesion Lames de verre</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>Couvercles en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544G</td><td></td></tr><tr><td>Stylo barrière hydrophobe</td><td>Ted Pella</td><td>22311</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Plateau de coloration de lames</td><td>VWR</td><td>87000-136</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>LOCI, UW-Madison.</td><td>Version 4.0</td><td>https://fiji.sc/</td></tr></tbody></table>

in vivo immunofluorescence localisation pour l'évaluation de la biodistribution thérapeutique et diagnostique des anticorps dans la recherche sur le cancer

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des outils importants dans la détection, le diagnostic et le traitement du cancer. Ils sont utilisés pour démêler le rôle des protéines dans la tumorigénèse, peuvent être dirigés vers les biomarqueurs du cancer permettant la détection et la caractérisation des tumeurs, et peuvent être utilisés pour la thérapie contre le cancer comme mAbs ou des conjugués anticorps-médicaments pour activer les cellules effectrices immunitaires, pour inhiber voies de signalisation, ou tuer directement les cellules porteuses de l'antigène spécifique. En dépit des progrès cliniques dans le développement et la production des mAbs nouveaux et fortement spécifiques, les applications diagnostiques et thérapeutiques peuvent être altérées par la complexité et l'hétérogénéité du microenvironnement de tumeur. Ainsi, pour le développement de thérapies et de diagnostics efficaces à base d'anticorps, il est crucial d'évaluer la biodistribution et l'interaction du conjugué à base d'anticorps avec le microenvironnement tumoral vivant. Ici, nous décrivons In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) comme une nouvelle approche pour étudier les interactions des thérapies et des diagnostics basés sur les anticorps dans les conditions physiologiques et pathologiques in vivo. Dans cette technique, un anticorps thérapeutique ou diagnostique d'antigène-spécifique est injecté par voie intraveineuse in vivo et localisé ex vivo avec un anticorps secondaire dans les tumeurs isolées. IVIL reflète donc la biodistribution in vivo de médicaments à base d'anticorps et d'agents de ciblage. Deux applications IVIL sont décrites évaluant la biodistribution et l'accessibilité des agents de contraste basés sur les anticorps pour l'imagerie moléculaire du cancer du sein. Ce protocole permettra aux futurs utilisateurs d'adapter la méthode IVIL pour leurs propres applications de recherche basées sur les anticorps.

La méthode IVIL a été utilisée ici pour examiner la biodistribution in vivo et l'interaction tissulaire de B7-H3-ICG et Iso-ICG, en permettant aux agents, après injection intraveineuse dans un animal vivant, d'interagir avec le tissu cible pendant 96 h, puis une fois que les tissus sont d'agir comme les principaux anticorps pendant l'immunostaining ex vivo. La méthode IVIL a également été comparée à la coloration standard ex vivo IF des tissus pour le marqueur B7-H3. Les glandes mammaires...

La méthode de localisation de l'immunofluorescence in vivo (IVIL) peut être utilisée pour examiner la biodistribution in vivo d'anticorps et d'anticorps conjugués à des fins oncologiques chez des organismes vivants à l'aide d'une combinaison de ciblage tumoral in vivo et d'immunostaining ex vivo Méthodes.

In Vivo Immunofluorescence Localisation pour l'évaluation de la biodistribution thérapeutique et diagnostique des anticorps dans la recherche sur le cancer

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Ce protocole pour la localisation in vivo d’immunofluorescence, ou IVIL, évalue la biodistribution in vivo des anticorps diagnostiques et thérapeutiques ou des agents anticorps-basés pour la recherche, la détection, et le traitement de cancer. Contrairement à la coloration immunofluorescente conventionnelle où l’expression cellulaire des antigènes est révélée ex vivo, la méthode IVIL élucide la façon dont les anticorps et les agents à base d’anticorps se répartir chez l’animal vivant. Cette vidéo aidera à comprendre le flux de travail global de la méthode IVIL.Il montre des détails importants pour la reproduction réussie du protocole pour d’autres applications et anticorps. Observez les souris du modèle de cancer désiré pour la croissance appropriée de tumeur par l’intermédiaire de la palpation ou de la mesure d’étrier avant de procéder. Purifiez les anticorps anti-souris B7-H3 et lapin IgG sur une colonne de désaltage afin d’éliminer les agents de conservation et les tampons de stockage selon les instructions du fabricant.Aliquot dosages de 33 microgrammes de chaque anticorps conjuguer dans les tubes de microcentrifugeuse individuels. Après l’anesthésie décrite dans le protocole de texte, préparez-vous à l’inoculation de veine de queue des solutions d’anticorps. Désinfecter la queue de l’animal en essuyant trois fois avec un lingette d’alcool.Dilater les veines de la queue en chauffant avec un coussin chauffant pendant environ 30 secondes. Évitez de chauffer tout l’animal. À l’aide d’un cathéter de veine de queue de calibre 27, insérez l’aiguille du papillon dans l’une des deux veines latérales de la queue.Visualisez le flux sanguin dans le cathéter pour vous assurer que l’aiguille est bien placée afin que les solutions entrent pleinement dans l’animal plutôt que d’être capturées dans la queue. Utilisez un morceau de ruban chirurgical pour fixer soigneusement la queue avec l’aiguille insérée à la scène. Rincer le cathéter avec 25 microlitres de solution saline stérile tamponnée de phosphate.Ensuite, injectez la solution d’anticorps dans le cathéter à l’aide de seringues à insuline. Rincer le cathéter une fois de plus avec 25 microlitres de PBS stérile. Retirez l’aiguille de la queue et appliquez de la pression pour arrêter tout saignement.Effectuez l’euthanasie humaine de la souris comme décrit dans le protocole de texte, et mentez la souris dans la position de supination. Utilisez des ciseaux chirurgicaux et des forceps pour exciser les tissus tumoraux. Utilisez des forceps pour saisir seulement la couche externe de la peau entre l’ensemble des glandes mammaires les plus proches de la queue, et faire une petite incision avec une paire de ciseaux chirurgicaux.Introduisez les ciseaux fermés dans la coupe, et ouvrez lentement la pointe pour séparer soigneusement la peau de la membrane abdominale sous-jacente de la paroi abdominale, la gardant intacte. Faire une incision verticale jusqu’à l’abdomen, en continuant à séparer la peau de la membrane interne. Entre la troisième et la quatrième glande mammaire, faire une coupe horizontale à travers l’abdomen pour permettre la rétractation de la peau et la visualisation des glandes mammaires.Saisir chaque tumeur ou glande normale avec des forceps, couper soigneusement la peau attachée à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Placez les tissus excisés dans des moules de base jetables en tissu qui sont préétiquetés et remplis d’un milieu d’intégration optimal de la température de coupe. Congeler rapidement les moules par placement sur la glace sèche.Afin d’étudier la livraison hors cible, exciser d’autres tissus ou organes d’intérêt. À l’aide d’un cryostat, sectionne les blocs de tissu congelés à 10 microns d’épaisseur et placez les sections adjacentes sur des toboggans en verre d’adhérence préétiquetés. Rincer les diapositives de tissu congelées avec pbs température ambiante pendant cinq minutes pour enlever le milieu d’intégration.Délimiter les sections tissulaires à l’aide d’un stylo barrière hydrophobe pour réduire le volume de solutions nécessaires lors de la coloration. Fixer les sections tissulaires avec 4% de solution de paraformaldéhyde pendant cinq minutes. Après avoir rinçant les diapositives dans PBS pendant cinq minutes, perméabiliser les sections tissulaires avec 0,5%Triton X-100 en PBS pendant 15 minutes.Rincez les diapositives à nouveau dans PBS pendant cinq minutes. Bloquer les tissus avec PBS contenant 3% de poids par volume albumine de sérum bovin et 5% de volume par volume sérum de chèvre pendant une heure à température ambiante. Après avoir rinçant les glissières dans PBS pendant cinq minutes, incuber les sections avec des anticorps primaires de tenue de dossiers tels qu’un marqueur nucléaire, vasculaire ou cytoplasmique commun.Ici, rat anti-souris CD31 est utilisé à une dilution d’un à 100 dans la solution de blocage. Les toboggans avec anticorps primaires sont laissés pendant la nuit à quatre degrés Celsius, à l’abri de la déshydratation sur un plateau de diapositives. Après l’incubation, rincer les glissières dans PBS pendant cinq minutes trois fois.Changez le PBS à chaque fois. Incuber les diapositives avec des anticorps secondaires pour étiqueter les anticorps primaires. Pour cette application, visualisez l’anticorps anti-B7-H3 à l’aide d’anticorps anti-lapin de chèvre conjugué Alexa Fluor 546, et visualisez le CD31 avec l’anticorps secondaire anti-rat Alexa Fluor 488 dans la solution de blocage.Protégez les glissières de la lumière et de la déshydratation sur un bac à glissière pendant une heure à température ambiante. Après le rinçage des diapositives dans PBS comme avant, appliquer une goutte du milieu de montage dans le centre de la tranche de tissu. Placez soigneusement un coverslip, en évitant le piégeage des bulles d’air.Sceller les bords du coverslip avec du vernis à ongles clair, et laisser sécher. Procéder à l’imagerie par microscopie confocale et à l’analyse quantitative de l’image telle que décrite dans le protocole de texte. Les micrographes confocal représentatifs montrent la comparaison de la localisation conjuguée d’anticorps-ICG de B7-H3 spécifique et de la localisation conjuguée d’anticorps-ICG de contrôle non spécifique d’isotype dans les glandes mammaires murines contenant les tissus normaux ou carcinomes.Glandes mammaires murines normales d’un animal injecté par voie intraveineuse avec Iso-ICG ou B7-H3-ICG et contre-tachées de CD31 ne montrent aucune coloration des conjugués anticorps. Les tissus normaux se sont montrés pour n’avoir aucune expression de B7-H3 par la coloration standard d’immunofluorescence d’ex vivo. Dans les tumeurs mammaires invasives, B7-H3-ICG se lie fortement à la vascularisation, le premier point de contact in vivo, puis est capable d’extravaser de la vascularisation pour tacher hétérogènement l’épithélium tumoral.Iso-ICG montre l’accumulation non spécifique dans les tissus de tumeur. La coloration immunofluorescente ex vivo standard montre l’expression uniforme du marqueur B7-H3 sur les cellules épithéliales et endothéliales. Les micrographes confocal représentatifs montrent la méthode in vivo de localisation d’immunofluorescence pour détecter l’expression netrin-1 ou l’expression de contrôle d’isotype dans le carcinome murin et les glandes mammaires normales.La localisation in vivo d’immunofluorescence confirme le signal épithélial pour netrin-1 dans les tumeurs de MMTV-PyMT mais pas dans les glandes mammaires normales. En outre, il y a un signal netrin-1 fort sur des cellules endothéliales dans des tumeurs de sein, comme indiqué par le signal jaune colocalisé. Le signal est significativement plus faible dans les glandes mammaires normales.La méthode IVIL devra être optimisée en termes de dosage des anticorps, de synchronisation de la collecte des tissus et de dilution secondaire des anticorps pour une mise en œuvre réussie. L’IVIL permet de cibler les épitopes conformationnels qui ne peuvent pas être détectés à l’aide de taches d’immunofluorescence standard, ce qui nécessite un traitement tissulaire. En outre, des organes sains des souris tumeur-roulements peuvent être rassemblés pour évaluer la livraison hors cible des anticorps thérapeutiques.Avec l’utilisation accrue de thérapeutiques à base d’anticorps et d’agents de contraste dans la recherche et la gestion du cancer, la méthode IVIL est très applicable à la recherche et au développement pharmaceutiques. Les chercheurs dans les thérapies de cancer, l’imagerie moléculaire, l’inflammation, et d’autres secteurs peuvent constater que la méthode d’IVIL fournit l’information utile.

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Diffuse la tomographie par fluorescence offre une approche relativement peu coûteux et potentiellement à haut tout au long de...

Computed Tomography-guidée tomographie diffuse Time-Domain Fluorescence chez les petits animaux pour la localisation de biomarqueurs du cancer

Nanoparticules virales végétales (VNPs) sont prometteurs plates-formes pour des applications dans le domaine biomédical. Ici, nous décrivons les procédures pour les installations VNP propagation, la purification, la caractérisation et la bioconjugaison. Enfin, nous montrons l'application de VNPs prise d'origine tumorale et d'imagerie en utilisant un modèle de xénogreffe de souris et l'imagerie de fluorescence.

Les nanoparticules virales pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des tumeurs

Cette vidéo présente une technique permettant d’étudier la localisation in vivo d’anticorps spécifiques à une tumeur dans un modèle de xénogreffe de tumeur chez la souris. Lors de l’injection sous-cutanée de cellules cancéreuses dans des souris pour la formation de tumeurs, des anticorps marqués par fluorescence sont injectés qui se lient à des récepteurs spécifiques de la tumeur, permettant une évaluation in vivo de la localisation des anticorps par imagerie.

Technique d’évaluation de la localisation in vivo d’anticorps spécifiques à une tumeur

Cette vidéo présente une technique de localisation par immunofluorescence in vivo (IVIL) pour étudier la biodistribution des anticorps ciblant les tumeurs dans un modèle murin de cancer du sein. Lors de l’injection intraveineuse d’un anticorps spécifique de la tumeur chez la souris, la tumeur est isolée chirurgicalement et la localisation de l’anticorps dans le tissu tumoral est confirmée par immunomarquage ex vivo.

Méthode de localisation par immunofluorescence in vivo pour étudier la biodistribution des anticorps

La vidéo présente une méthode d’imagerie par fluorescence pour la localisation in vivo d’anticorps dans un modèle de xénogreffe de tumeur de souris. Il s’agit de l’injection de cellules tumorales chez une souris pour générer des xénogreffes solides sous la peau. L’injection ultérieure d’anticorps fluorescents confirme la localisation spécifique grâce à des signaux de fluorescence améliorés dans la xénogreffe tumorale.

Imagerie de fluorescence in vivo pour localiser les anticorps dans un modèle de xénogreffe de tumeur chez la souris

Cette vidéo présente une technique impliquant un radio-immunoconjugué pour l’imagerie in vivo d’une tumeur dans un modèle murin. Lors de l’injection du radio-immunoconjugué, les anticorps du conjugué se lient à un antigène membranaire spécifique sur les cellules cancéreuses. Le radiotraceur du conjugué émet des positrons qui interagissent avec les électrons voisins pour produire de l’énergie, qui est détectée par un scanner de tomographie par émission de positons (TEP) pour créer une image de...

Une technique d’imagerie TEP in vivo pour détecter des tumeurs dans un modèle murin à l’aide d’anticorps radiomarqués

Cette vidéo montre une méthode de suivi du trafic de lymphocytes T induits par des anticorps bispécifiques vers des tumeurs dans un modèle murin. Les lymphocytes T effecteurs transduits par la luciférase sont injectés dans une souris avec une xénogreffe de cellules tumorales sous-cutanées. Des anticorps bispécifiques sont ensuite introduits, se liant aux lymphocytes T et aux cellules tumorales. La localisation des lymphocytes T est suivie à l’aide de l’imagerie bioluminescente, l’amplitude du...

Une technique in vivo pour suivre le trafic de lymphocytes T induits par des anticorps bispécifiques vers les tumeurs

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour effectuer la validation ex vivo d’expériences d’imagerie de xénogreffes de fluorescence dans le proche infrarouge in vivo chez la souris à l’aide de nanocorps marqués au fluorophore et d’anticorps conventionnels.

Validation des Nanobodies et Anticorps Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Expériences tumeur xénogreffe NIRF-imagerie dans des souris en utilisant<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cytométrie en flux et microscopie

Spécifique à la cible sondes représentent un outil innovant pour l’analyse des mécanismes moléculaires, comme expression de la protéine dans divers types de maladie (p. ex., inflammation, infection et tumorigenèse). Dans cette étude, les auteurs décrivent une évaluation quantitative de tomographie tridimensionnelle d’infiltration de macrophages intestinaux dans un modèle murin de colite en utilisant la tomographie de F4/80-spécifique induite par fluorescence.

Tomographie médiée par fluorescence pour la détection et la Quantification de l’Inflammation intestinale Murine axés sur les macrophages

Les auteurs décrivent un protocole précliniques in vivo suivi des métastases cancéreuses. Il est issu d’un reporter de radionucléide-fluorescence combinant le sodium iodure symport, détecté par non invasive [18F] tétrafluoroborate-PET et une protéine fluorescente simplifiée ex vivo de confirmation. La méthode est applicable pour précliniques in vivo la cellule de suivi au-delà de biologie tumorale.

Gène rapporteur de radionucléide-fluorescence Imaging pour suivre la Progression tumorale dans les modèles de rongeurs tumeur

Ici nous présentons un protocole pour étudier la localisation in vivo des anticorps dans les modèles de xénogreffe de tumeur de souris.

Analyse de la distribution des tumeurs et des tissus de l’anticorps thérapeutique spécifique à l’antigène cible

Apprenez la méthode IVIL pour évaluer la biodistribution d'anticorps thérapeutiques et diagnostiques dans des modèles murins de cancer. Cette technique permet de visualiser en temps réel la distribution des anticorps dans l'animal vivant.

In Vivo Immunofluorescence Localisation pour lévaluation de la biodistribution thérapeutique et diagnostique des anticorps dans la recherche sur le cancer (Vidéo) | JoVE Journal

In Vivo Immunofluorescence Localisation pour l'évaluation de la biodistribution thérapeutique et diagnostique des anticorps dans la recherche sur le cancer

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