Name: Points forts de la collection JoVE Methods : interactions protéine-protéine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: Découvrez les méthodes JoVE pour étudier les interactions protéine-protéine. Cette collection présente des techniques essentielles pour analyser les complexes protéiques et leurs fonctions biologiques.

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Les auteurs remercient le CRSNG RGPIN-2018-04994, le Programme d’innovation Campus Alberta (RCP-12-002C) et les subventions de l’Alberta Prion Research Institute/Alberta Innovates Bio Solutions (201600018) accordées à M.O.

<ol><li>Jin, L., Wang, W., Fang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein-protein+interaction+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Targeting protein-protein interaction by small molecules.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 435-456 (2014).</li>
<li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+cellular+protein-protein+interactions%3A+Technological+strategies+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. 38 (1), 79-111 (2019).</li>
<li>Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Cyclin-dependent+Kinase+1+Specific+Phosphorylation+Sites+by+an+In+Vitro+Kinase+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57836(2018).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+Assay+Using+Endogenous+Nuclear+Proteins+from+Cells+Cultured+Under+Hypoxic+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57836(2018).</li>
<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration-free+Vitro+of+Protein+Homo-oligomerization+Using+Commercial+Instrumentation+and+Free%2C+Open+Source+Brightness+Analysis+Software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Calibration-free Vitro of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58157(2018).</li>
<li>Luzarowski, M., Wojciechowska, I., Skirycz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2+in+1%3A+One-step+Affinity+Purification+for+the+Parallel+Analysis+of+Protein-Protein+and+Protein-Metabolite+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57720(2018).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Heterodimerization+of+Protein+Isoforms+Using+an+Situ+Ligation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an Situ Ligation Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57755(2018).</li>
<li>Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar, J., Overduin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Interactions+of+Globular+and+Filamentous+Proteins+by+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+%28NMR%29+and+Microscale+Thermophoresis+%28MST%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST).</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58537(2018).</li>
<li>Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Macromolecules+in+Solution+using+Small+Angle+X-Ray+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58538(2018).</li>
<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li>
<li>Lundberg, E., Borner, G. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomics%3A+a+powerful+discovery+tool+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomics: a powerful discovery tool for cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les interactions protéine-protéine (IPP) sont fondamentales pour la génération d’effets biologiques. Nombre d’entre eux sont intimement liés à la maladie, et il est de plus en plus reconnu qu’ils offrent des cibles importantes pour l’action médicamenteuse1. De nombreuses techniques sont disponibles pour étudier ces interactions protéiques, dont certaines sont discutées dans cette collection ou dans d’autres articles de JoVE. Chaque technique a ses propres avantages et limites2 ; cependant, il n’existe pas de technique parfaite pour tous les IPP en raison de la grande diversité de ces interactions qui se produisent dans différents compartiments subcellulaires, avec une large gamme d’affinités (picomolaire à millimolaire), et peuvent n’être que transitoires par nature.
Les dosages de kinases in vitro sont une approche indirecte pour l’étude des IPP qui peut être utilisée pour analyser comment les kinases remplissent leur rôle fonctionnel de transfert d’un groupe phosphate de l’ATP à un substrat. Cui et al.3 utilisent cette technique, couplée à la digestion tryptique et à la spectrométrie de masse, pour identifier les sites de phosphorylation spécifiques de la kinase-1 dépendante des cyclines sur un fragment de la protéine centromère humaine F (CENP-F). Pour la vérification fonctionnelle de nouveaux sites de phosphorylation, les auteurs utilisent un test de liaison, combinant CENP-F contenant une mutation phosphomimétique et la α de la karyophérine, un récepteur de transport nucléaire, fournissant ainsi une validation croisée.
La co-immunoprécipitation est une méthode largement utilisée pour étudier les IPP dans laquelle un anticorps est utilisé pour capturer une cible spécifique ainsi que toute autre molécule protéique qui lui est associée. Zheng et ses collègues4 appliquent cette technique pour étudier les facteurs induits par l’hypoxie (HIF) qui fonctionnent comme des hétérodimères composés d’une sous-unité α régulée par l’oxygène et d’une sous-unité β exprimée de manière constitutive, également connue sous le nom d’ARNT3. Une note intéressante à propos de leur protocole est que les cellules sont induites et récoltées dans des conditions hypoxiques, et que les protéines endogènes des fractions nucléaires sont ensuite co-immunoprécipitées. Comme le notent les auteurs, l’une des limites de la méthode est qu’elle ne peut pas déterminer si les IPP sont directs ou indirects.
Nolan et al.5 présentent un protocole pour la mesure du nombre de molécules et de leur luminosité dans les images de microscopie à fluorescence 'Number and Brightness' (N&B), qui peut être appliqué à la détection de l’homo-oligomérisation des protéines. La technique peut être utilisée à la fois in vitro et in vivo et a été appliquée pour quantifier avec précision l’état oligomérique des FKBP12F36V marqués par mVenus avant et après l’ajout d’un médicament dimérisant. Les auteurs discutent des mérites de la technique par rapport aux technologies connexes et soulignent l’importance de corriger le blanchiment et les fluctuations d’intensité à long terme. Les microscopes confocaux équipés de détecteurs numériques facilitent la quantification, mais le N&B est également possible avec des détecteurs analogiques.
La purification par affinité des complexes multiprotéiques, ainsi que l’identification de leurs composants, a été une technique largement utilisée pour comprendre les fonctions de ces protéines complexes. Dans le protocole de Luzarowski et al.6, cette technique est poussée plus loin en caractérisant simultanément les IPP et les interactions protéine-métabolite (PMI) dans les cellules végétales transgéniques d’Arabidopsis. Les nucléosides diphosphate kinases marqués sont purifiés par affinité par la procédure de purification d’affinité en tandem (TAP), les protéines capturées et les petites molécules étant ensuite identifiées par spectrométrie de masse. L’originalité de ce protocole est sa capacité à identifier à la fois les ligands hydrophobes et hydrophiles ; il s’agit d’un protocole d’extraction trois-en-un qui permet d’étudier à la fois les IPP et les PMI et d’appliquer une purification d’affinité à la plantation de cellules.
Le test de ligature de proximité a l’avantage d’être utilisé pour détecter les interactions entre les protéines endogènes dans les cellules et les tissus. Karchugina et Chernoff7 utilisent la technique pour montrer la présence d’hétérodimères des kinases MST1 et MST2 dans les cellules de Schwann humaines (CSH) et les cellules rénales embryonnaires humaines (HEK-293). Leur article contient plusieurs conseils précieux sur la façon d’exécuter la technique avec succès. Des anticorps primaires appropriés élevés chez différentes espèces contre chaque protéine en interaction sont nécessaires, et comme la spécificité et la sensibilité des anticorps sont essentielles, les concentrations d’anticorps doivent être finement ajustées. Les auteurs ont trouvé que les lames de chambre en verre étaient pratiques pour analyser plusieurs lignées cellulaires et combinaisons d’anticorps, mais ont noté qu’il était impératif de retirer tout l’insert en silicone entre les puits pour éviter les différences de distance confocale pendant la microscopie. De plus, divers contrôles positifs et négatifs sont utilisés pour valider les résultats.
La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est un test sensible qui peut être utilisé pour fournir une résolution au niveau atomique et des informations quantitatives sur les interactions protéiques et les interactions protéine-ligand. Winkelaar et ses collègues8 utilisent cette technique pour étudier l’interaction de deux protéines (la vimentine et l’envoplakine) présentes dans les desmosomes, des structures cellulaires impliquées dans l’adhésion de cellule à cellule que l’on trouve généralement dans les tissus qui subissent un stress mécanique intense. Les auteurs utilisent un domaine de vimentine marqué 15N et acquièrent un spectre 2D en utilisant la corrélation quantique unique hétéronucléaire (HSQC). En présence d’un domaine de l’envoplakine, un élargissement important des raies et une disparition du pic sont observés, ce qui correspond à une interaction protéique. Les auteurs sondent en outre la base de l’interaction en utilisant la mutagénèse et la thermophorèse à l’échelle microscopique (MST) pour fournir des informations quantitatives.
La diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) est une technique qui peut être utilisée pour fournir des informations sur la taille et les conformations d’une macromolécule en solution et générer une enveloppe moléculaire de complexes de grandes dimensions, multidomaines ou protéiques à faible résolution. Dans le protocole de Mrozowich et al.9, la technique est utilisée pour générer une structure à basse résolution du nidogène-1 et de la laminine γ-1 en complexe. La technique peut intéresser les chercheurs qui étudient les IPP dans de grandes protéines avec plusieurs domaines globulaires qui sont trop grands pour la spectroscopie RMN et sont difficiles à cristalliser pour la cristallographie aux rayons X.
On estime qu’il y a environ 650 000 interactions dans l’interactome humain10, ce qui est suffisant pour occuper les chercheurs sur le terrain pendant un certain temps encore. Un développement récent, rendu possible par les progrès de la microscopie, de la spectrométrie de masse et de l’apprentissage automatique, est la protéomique spatiale qui pourrait fournir un excellent aperçu dans ce domaine à l’avenir11. Cet ensemble de méthodes d’IPP aidera les chercheurs à relever cet important défi tout en évitant les pièges potentiels.

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JoVE Methods Collection Highlights: Protein-Protein Interactions

Points forts de la collection JoVE Methods : interactions protéine-protéine

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Découvrez les méthodes JoVE pour étudier les interactions protéine-protéine. Cette collection présente des techniques essentielles pour analyser les complexes protéiques et leurs fonctions biologiques.

Points forts de la collection JoVE Methods : interactions protéine-protéine

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