Caractérisation au niveau moléculaire à l'aide d'approches biochimiques robustes d'une nouvelle protéine Kinase

L’immunoprécipice est une technique très puissante pour isoler et purifier une protéine cible. Dans des conditions lisses, les protéines, les régulateurs ou les substrats peuvent être co-immunoprécipités. Un nouveau réseau d’interaction peut alors être découvert.

L’activité de la protéine immunoprécipitée peut également être évaluée. En particulier, l’activité d’une kinase peut être testée sur différents substrats par étiquetage P32-ATP. Néanmoins, l’activité des inhibiteurs ciblant une kinase impliquée dans une maladie peut être évaluée.

Ils peuvent constituer des composés de plomb pour développer de nouveaux médicaments. Cette méthode peut être étendue des mammifères à la levure ou aux bactéries. Cette technique n’est pas si difficile.

Pour les points clés: assurez-vous d’avoir un contrôle négatif pour être sûr que l’interaction détectée est spécifique, et choisissez soigneusement les conditions de lyse pour garder les interactions et l’activité. Les petits détails et les gestes sont importants pour assurer le succès de cette technique, et ils ne sont jamais décrits dans les matériaux et les méthodes d’articles. Fabienne Godin, technicienne de notre laboratoire, démontrera la procédure.

Une fois que les cellules sont préparées dans la salle de culture cellulaire dans l’armoire de biosécurité, utilisez une pipette de 10 millilitres pour retirer le média des plaques et le jeter dans une bouteille de déchets dédiée avec de l’eau de Javel. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de DMEM frais complété, et remettre les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Pour préparer le mélange de transfection, dans un tube de 15 millilitres, ajouter 450 microlitres de solution d’hydrochlorure tris millimolaire de 10 millimilliards au pH 7,5, complétée par un millimolaire EDTA et 50 microlitres de 2,5 solution molaires de chlorure de calcium.

Mélanger par inversion. Dans le tube, ajouter un volume correspondant à 10 microgrammes d’ADN plasmatique, amplifié par un kit midiprep ADN, et dilué avec le tampon d’élitution de ce kit, et dont la concentration a été déterminée. Inverser le tube pour mélanger.

Puis, avec une agitation douce sur un mélangeur vortex, ajouter lentement 500 microlitres de bes tamponné saline 2X concentré, goutte à goutte dans le tube. Déplacez-le très soigneusement, pour ne pas perturber la formation complexe entre l’ADN et le phosphate de calcium. Incuber pendant au moins 15 minutes, ou jusqu’à 45 minutes, à température ambiante.

Maintenant, transférez la plaque au transfect de l’incubateur à l’armoire de sécurité. Ajouter les complexes d’ADN préparés goutte à goutte sur les cellules sur toute la surface de la plaque. Incuber de 24 à 72 heures dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.

Pour prévenir la dégradation des protéines, préparez un tampon de lyse sur la glace, en tenant compte de quatre millilitres de tampon de lyse pour chaque plaque transfectée. Prenez la plaque avec des cellules transfectées de l’incubateur. Retirez le média et jetez-le dans une bouteille de déchets d’eau de Javel dédiée.

Pour laver les cellules, ajouter trois millilitres de PBS froid sur le côté de la plaque goutte par goutte, pour éviter de détacher les cellules transfectées. Et faites pivoter doucement la plaque pour étendre le tampon sur toute la surface. Inclinez la plaque pour enlever le PBS et jetez-la dans la bouteille de déchets.

Répétez le lavage une fois de plus. Placez la plaque sur la glace. À la fin, retirez soigneusement le reste du PBS.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse froide aux cellules lavées transfectées. Étalez-le sur toute la surface de la plaque. Incuber pendant 10 minutes sur la glace.

De temps en temps, étendre à nouveau le tampon sur toute la surface de la plaque. Après cela, utilisez une spatule cellulaire pour gratter les cellules de la surface et les recueillir dans un tube de microcentrifugeuse. Centrifugeuse pendant 10 minutes à 10 000 fois G et 4 degrés Celsius.

Recueillir le lysate supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse et de recueillir un aliquot de 50 microlitres de cette fraction à un autre nouveau tube de microcentrifugeuse. Cet aliquot sera utilisé pour vérifier si les protéines transfectées sont bien exprimées. Jeter la pastille à la poubelle.

Tout d’abord, resuspendez doucement la solution de stock de perles d’agarose couplées à l’anticorps approprié. Couper l’extrémité d’une pointe de 200 microlitres pour faire une ouverture d’un à deux millimètres. Fixez la pointe à une micropipette et dessinez 40 microlitres de la solution, permettant aux perles d’entrer dans la pointe.

Pipette les perles de haut en bas à plusieurs reprises pour saturer la pointe pour assurer le volume correct de perles et transférer les perles dans un tube de microcentrifugeuse. Ajouter 500 microlitres de tampon TNET, mélanger par inversion, et centrifugeuse pendant deux minutes à 1000 fois G et quatre degrés Celsius. Retirez soigneusement le supernatant et ajoutez 500 microlitres de tampon TNET.

Incuber sur une roue rotative pendant au moins une heure à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez le tube pendant deux minutes à 1000 fois G et quatre degrés Celsius et lavez les perles deux fois avec 500 microlitres de tampon de lyse en inversant et en centrifugant. Après le lavage, transférer la fraction totale précédemment recueillie dans le tube et incuber sur une roue rotative à quatre degrés Celsius pendant deux à quatre heures.

Maintenant, centrifugeuse le tube contenant les perles immunoprécipitées pendant deux minutes à 1000 fois G et quatre degrés Celsius. Lavez les perles cinq fois avec 500 microlitres de tampon de lyse en inversant et en centrifugant. Lors du lavage des perles, prendre soin de ne pas aller trop près des perles tout en enlevant supernatant.

Sinon, les perles seront aspirées et à la fin de l’expérience, il ne restera plus de perles. Pour l’élitution, première centrifugeuse pendant deux minutes à 1000 fois G et quatre degrés Celsius. Utilisez une micropipette d’un millilitre pour enlever soigneusement le surnatant.

Puis, avec une seringue Hamilton équipée d’une aiguille cimentée, enlever les dernières gouttes du surnatant pour éviter l’aspiration des perles. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de tampon Laemmli 4X. Homogénéiser en tapant doucement sur le tube.

Incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Puis, centrifugeuse pendant cinq minutes à 10 000 fois G et température ambiante. À l’aide d’une seringue Hamilton, transférer l’élituate supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.

Conserver à moins 80 degrés Celsius. Les cellules HEK-293 ont été transfectées avec LIMK 2-1 non marqué ou l’un des isoformes marqués ha de LIMK 2. LIMK 2-1 est bien exprimé dans les différentes conditions.

Anti LIMK 2-1 anticorps ne reconnaît pas LIMK 2a et LIMK 2b isoformes, et il est spécifique, que son signal diminue lorsque les cellules sont transfectées avec LIMK2 petit ARN interférant, par rapport à contrôler le petit ARN interférant. Dans diverses lignées cellulaires humaines, le LIMK 2-1 semblait s’exprimer dans HEK-293 et HeLa, mais pas dans C6. Des expériences de coimmunoprecipitation ont été utilisées pour évaluer l’interaction de LIMK2-1 avec le ROCK kinase en amont. Chacune des différentes protéines codées par les vecteurs transfectés a été bien exprimée.

Les trois isoformes de LIMK2, aussi bien que larp6, ont été efficacement immunoprécipités. Dans les exaltats, le ROCK a été détecté et donc coimmunoprécié avec les trois isoformes de LIMK2, mais pas avec le larp6. L’interaction détectée est alors spécifique.

Coimmunoprecipitated LIMK 2-1 a été testé pour son activité de kinase par l’étiquetage gamma P32 ATP. LIMK 2-1 n’a pas phosphorylate cofilin, alors qu’il a fait la protéine de base de myéline de phosphorylate, ou MBP. LIMK 2-1 est efficacement immunoprécipité dans ce test.

Il est essentiel d’avoir un contrôle négatif tout en effectuant l’immunoprécipice pour s’assurer que l’interaction est spécifique. La composition d’un tampon de lyse doit être soigneusement mise en place pour préserver l’interaction et l’activité. Lors de l’immunoprécipice, l’activité de kinase peut être évaluée pour compter différents substrats.

La mutation peut être facilement introduite et peut démêler le rôle des résidus spécifiques. Des études fonctionnelles peuvent également être réalisées pour comprendre le rôle physiologique des nouvelles interactions mises en évidence. Les cellules doivent être cultivés dans une salle de culture dédiée au sein d’un cabinet de biosécurité.

P32 ATP doit être manipulé avec une prudence spécifique. Bouclier pour se protéger des radiations, compteur Geiger, collecte spécifique des déchets, badges personnels du sein et des doigts pour détecter l’exposition radioactive et les pointes de filtre.