Isolement des cellules mononucléaires Lamina Propria du colon murine à l'aide de la collagène E

L’isolement dans l’analyse phénotypique des cellules immunitaires de l’intestin utilisant ce protocole se sont avérés applicables à la compréhension de GI et des désordres inflammatoires systémiques. Cette méthode isole un nombre important de cellules mononucléaires viables en minimisant la contamination des débris permettant un phénotypage immunitaire ultérieur par l’atomistrie de Fleur ou d’autres méthodes. Comme l’intestin est un site cible majeur de l’inflammation dans de nombreuses maladies, ce protocole peut être utile pour l’étude des populations immunitaires intestinales dans les modèles muraux de cancer, allergie, transplantation et auto-immunité.

Afin d’optimiser le rendement et l’efficacité de ce protocole, il est recommandé que les solutions et les matériaux clés soient préparés à l’avance, comme indiqué. Après avoir euthanasié la souris et fait une incision verticale en milieu de ligne, utilisez de fines ciseaux de dissection pour ouvrir le péritoine. À l’aide de forceps, déplacez les petites entrailles d’un côté et exposez le côlon descendant.

Tirez vers le haut légèrement sur le côlon descendant pour exposer au maximum la partie rectale du côlon. Ensuite, couper le rectum distal profondément dans le bassin et disséquer l’ensemble du côlon comme une seule unité du rectum distal au capuchon cécal. Tout d’abord, placez le côlon sur une serviette en papier humidifié et utilisez l’extrémité émoussée d’une paire de ciseaux ou de forceps pour appliquer une légère pression sur la paroi intestinale et extraire les selles solides.

Ensuite, placez le côlon dans une boîte de Pétri et utilisez une seringue de 10 millilitres avec une aiguille émoussée de 18 jauges remplie pour rincer l’intestin avec 10 millilitres de tampon refroidi du côlon. Placer le côlon dans une boîte de Pétri remplie de 5-10 millilitres de tampon du côlon réfrigéré et agiter manuellement pour laver le contenu du côlon restant. Répétez ce lavage 2-3 fois, à l’aide d’une nouvelle boîte de Pétri contenant tampon frais pour chaque lavage.

Après cela, transférer le côlon dans une nouvelle boîte de Pétri contenant tampon frais du côlon réfrigéré. Couper le côlon longitudinalment de son extrémité rectale plus musclée au côlon proximal, pour générer un seul morceau rectangulaire du côlon ouvert. Jeter le terre-plein central dans le plat et le remplacer par un tampon propre du côlon réfrigéré.

Placez le tissu rectangulaire du côlon sur une serviette en papier humidifié avec un tampon du côlon et coupez-le en le coupant horizontalement, puis en petits fragments. Utilisez des forceps fins pour recueillir les fragments du côlon dans un tube conique polypropylène de 50 millilitres contenant 20 millilitres de tampon du côlon réfrigéré. Ensuite, lavez les fragments en tourbillonnant vigoureusement le tube pendant 30 secondes.

Après le lavage, laisser les fragments de tissu s’installer au fond du tube avant de décanter ou aspirer sous vide le surnatant, En s’assurant d’éviter de perdre des fragments de tissu, répétez tout ce processus de lavage 3 fois en utilisant tampon du côlon frais pour chaque lavage. Pour commencer, ajouter 20 millilitres de tampon de digestion collagène au tube contenant les fragments de côlon lavés. Scellez le tube et placez-le dans un shaker orbital à 37 degrés Celsius avec un taux de rotation de 2 fois G pendant 60 minutes.

Assurez-vous que les fragments de tissu sont en mouvement constant pendant l’agitation. Tout d’abord, versez 5 millilitres de 66% de la densité à base de silice à base de médias de séparation dans chacun des 3 tubes distincts de polypropylène de 15 millilitres. Ensuite, utilisez une pipette sérologique de 25 millilitres pour recueillir seulement le supernatant de Collagenase Digestion 1.

Filtrer le supernatant à travers une passoire cellulaire en tissu de filtration pauvre de 40 microlitres placée dans un tube conique en polypropylène de 50 millilitres. Remplissez complètement le tube d’un tampon de côlon réfrigéré pour étancher le tampon de digestion de collagène. Faites ensuite tourner les cellules, aspirez le surnatant et gardez la pastille sur la glace.

Continuez à effectuer Collagenase Digestion 2 tel que décrit dans le protocole de texte. Une fois la digestion de collagène 2 terminée, rincer vigoureusement les fragments de tissu entre le tube et une seringue de 10 millilitres à travers une aiguille à extrémité émoussée de calibre 18. Répétez cette chasse d’eau pendant au moins 7-8 passages, en continuant jusqu’à ce qu’aucun fragment de tissu brut ou debri ne soit visible.

Ensuite, passez la suspension de désagrégation tissulaire à travers une passoire de cellules en tissu de filtration pauvre de 40 micromètres placée dans un tube propre en polypropylène de 50 millilitres. Remplissez le tube jusqu’à la jante avec un tampon du côlon réfrigéré pour étancher la digestion et la centrifugeuse à 800 fois G à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Jetez le supernatant par aspiration sous vide et tirez la pastille re-suspendue de Collagenase Digestion 1 à son tube correspondant.

Après cela, suspendre à nouveau chaque granulé dans 24 millilitres de 44% de la densité à base de silice des médias de séparation par côlon. Utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour superposer lentement 8 millilitres de ce média sur chacun des 3 tubes contenant des supports de séparation de densité à base de silice à 66 %. Équilibrez soigneusement les tubes dans des seaux de centrifugeuse à l’aide d’une balance ou d’un équilibre.

Centrifugeuse à 859 fois G à 20 degrés Celsius pendant 20 minutes sans la pause. Laissez les rongeurs s’immobiliser complètement avant d’enlever les tubes, en prenant soin de ne pas perturber les cellules à l’interface de gradient. Tout d’abord, visualisez l’interface de gradient près de la marque de 5 millilitres, où une bande blanche de 1 à 2 millilitres d’épaisseur est présente.

Aspirez sous vide et jetez les 7 millilitres les plus hauts du gradient pour faciliter l’accès pipette à l’interface. À l’aide d’une aspiration manuelle continue et d’un mouvement régulier du poignet rotatif, recueillir la couche d’interface des cellules. Recueillir jusqu’à ce que l’interface entre les deux gradients soit claire et réfractile et transférer l’interface vers un nouveau tube conique en polypropylène de 50 millilitres.

Ensuite, ajoutez FACS Buffer à cette baignoire jusqu’à ce que la suspension totale atteigne 50 millilitres. Centrifugeuse à 800 fois G à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Ensuite, aspirez le supernatant par aspiration sous vide et suspendez la pastille en 1 millilitre de tampon FACS.

La procédure décrite dans cette vidéo peut être utilisée pour isoler les cellules mononucléaires du côlon ou, avec des modifications, de l’intestin grêle. De plus, la cytométrie et l’analyse des données sont effectuées pour comparer les fractions des lymphocytes apoptotiques et nécrotiques/morts lors de l’utilisation de Collagène E ou D pour l’isolement, avec notre traitement sans DNAse 1. Après l’annexe 5 et la coloration bleue morte vivante fixable sur des suspensions de cellules simples après chaque isolement, la collagène E sans DNAse a montré un pourcentage sensiblement plus élevé de cellules vivantes après isolement par rapport à Collagène D sans DNAse.

Même par rapport à l’un ou l’autre collagène avec DNAse. En outre, nous avons identifié des cellules nécrotiques à un pourcentage médian de 41,0% dans le groupe E de Collagène contre 90,0% dans le groupe de Collagène D. 75,9% dans le groupe Collagenase E DNAse et 80,3% dans le groupe Collagenase DNAse.

La cytométrie multi perimétrique de flux est alors appliquée au MNC isolé des souris destinataires de valve-C cd45.2 le jour 7 après réception de BMT ou des modèles allogéniques ou syngénéiques de BMT. Les nombres absolus moyen de lymphocytes T positifs CD4 et CD8 positifs du donneur extraits du côlon du receveur de BMT sont calculés et comparés. Il peut donc être important d’identifier et/ou de quantifier les populations rares de cellules immunitaires dans ces modèles muraux.

Des sous-ensembles rares, y compris les cellules de régulation T positives FOX-P3 dérivées du donneur, sont évalués dans les modèles syngénéiques et allogéniques de BMT. En utilisant cette méthode, même les sous-ensembles rares, tels que les donneurs dérivés de T colonique s’infiltrant colon de souris receveurs, après BMT, peuvent être analysés. Il convient de noter que la collagène E est active à 37 degrés Celsius.

Ainsi, toutes les solutions de collagène doivent être préchauffées pour une activité adéquate de collagène et soigneusement trempées pour mettre fin à l’activité. Ce protocole permet un grand nombre de cellules mononucléaires qui peuvent être utilisées pour la caractérisation ultérieure par une cytométrie Fleur, techniques de biologie moléculaire, microscopie, culture et site de, entre autres. Ce protocole a fourni une évaluation fiable de l’inflammation dans le côlon des souris expérimentales contre contrôlées dans un modèle de greffe de moelle.

Facilitant ainsi la découverte de nouveaux mécanismes immunitaires réglementaires de tolérance à la transplantation. Collagène de Clostridium Istoliticum est un reagent qui doit être manipulé avec des techniques de sécurité de laboratoire. Il pose un danger pour la santé lorsqu’il est inhalé et peut causer une irritation de la peau et des yeux.