Name: Examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence Microscopie à cellules vivantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Découvrez l'imagerie en cellules vivantes pour étudier la dynamique nucléaire de la levure de fission Schizosaccharomyces pombe pendant la mitose et la méiose. Cette méthode non toxique permet d'observer les processus cellulaires en temps réel.

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Les auteurs souhaitent remercier Natalia La Fourcade et Mon LaFerte d'avoir rendu la préparation de ce manuscrit plus agréable. Merci aux membres du laboratoire de Forsburg qui ont contribué à l'achèvement de ce travail avec leur perspicacité, leurs idées d'expériences et leur soutien moral. Ce projet a été soutenu par NIGMS R35 GM118109 à SLF.

<ol><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy%E2%80%93tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy–tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MD+%22DNA+Replication%22">DNA Replication</a>. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).</li>
<li>Lee, J. Y., Kitaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%E2%80%99s+guide+to+rigor+and+reproducibility+in+fluorescence+imaging+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).</li>
<li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+an+overview+of+key+differences+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859(2015).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress+in+early+S+phase+generates+apparent+micronuclei+and+chromosome+rearrangement+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).</li>
<li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li>
<li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li>
<li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+%28XPF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li>
<li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li>
<li>Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li>
<li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+methods+for+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSabatinos%2C+SA+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 470, Academic Press. 759-795 (2010).</li>
<li>Diffraction PSF 3D. , Available from:
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<li>Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide — IJ 1.46. , Available from:
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<li>De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+DNA+replication+checkpoint+to+MBF+cell%E2%80%90cycle+transcription+reveals+a+distinct+class+of+G1%2FS+genes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes.</a> The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).</li>
<li>Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+anaphase+promoting+complex+substrates+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (9), e45895(2012).</li>
<li>Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+Rec8+is+required+for+reductional+chromosome+segregation+at+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis.</a> Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).</li>
<li>Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+fission+yeast+UNC-13%2FMunc13+protein+Ync13+in+late+stages+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).</li>
<li>Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+global+Cdc42+guanine+nucleotide+exchange+factors+for+fission+yeast+cell+polarity+are+coordinated+by+microtubules+and+the+Tea1%E2%80%93Tea4%E2%80%93Pom1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580(2018).</li>
<li>Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li>
<li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).</li>
<li>Kraft, L. M., Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+mechanism+for+mitochondria-dependent+dynein+anchoring%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

L'imagerie à cellules vivantes pendant la mitose et la méiose offre la possibilité d'examiner la dynamique nucléaire sans perturber considérablement la physiologie de la levure de fission lors de l'acquisition de données. Cependant, il faut faire preuve de prudence pour s'assurer que les cellules atteignent les densités désirées exemptes de stress environnementaux; et pour la méiose, que les cellules sont représentées pendant le temps de la différenciation terminale et pas trop tôt ou tard. L'encombrement cellulaire excessif, la famine, et les températures de croissance inappropriées sont des facteurs communs qui contribuent aux observations irréproductibles. En outre, pendant la construction de la souche, il est crucial de tester que les étiquettes fluorescentes n'interfèrent pas avec les fonctions des gènes cibles ni n'ont d'impact sur la condition physique globale des cellules. Le fait de ne pas inspecter de près les phénotypes des souches portant des marqueurs fluorescents peut entraîner des résultats incohérents et incomparables dans des génotypes similaires.
Bien que les coussinets d'agarose de microscope soient simples à assembler, ils peuvent également poser un obstacle à l'obtention de données d'imagerie précieuses. Créer des coussinets d'agarose est aussi simple que de placer trois lames de microscope parallèles les unes aux autres, de distribuer de l'agarose fondue sur la glissière du milieu et de mettre une glissière qui transverse le haut des autres diapositives. Il est toutefois utile d'assembler un appareil de curseur qui permet des modifications de largeur pour fabriquer des coussinets d'agarose résistants et spécifiques à la situation. Un simple curseur qui donne une flexibilité de largeur de garniture se compose d'une plate-forme (porte-tête de bouts de pipette ou du banc), de deux glissières de microscope, et de la bande de laboratoire agissant comme mécanisme d'ajustement de pad-largeur (figure 1A). L'épaisseur exacte du tampon dépendra des exigences de temps d'imagerie, de la marque agarose, de la température, du scellant de coverslip, du taux d'évaporation, etc. Ainsi, il est important de calibrer le système d'imagerie avant l'acquisition de donnéesafin d'augmenter la reproductibilité technique et d'améliorer la qualité de l'imagerie cellulaire 1,2,3. La surface de la garniture, la rigidité et la composition sont essentielles lors de l'acquisition prolongée d'images. Agarose a une faible fluorescence de fond, peut être facilement moulé, et à la concentration appropriée, résiste à la déformation structurelle due à l'évaporation. De plus, la combinaison de la levure de fission avec de l'agarose ne compromet pas la qualité de l'image et permet une observation étendue des cycles multiples de mitoses et de méiose. En outre, il est important d'éviter les bulles d'air pour la microscopie time-lapse. À l'intérieur des coussinets d'agarose et à l'intérieur de l'échantillon, les poches d'air se dilatent au fil du temps, ce qui provoque le déplacement des cellules et perturbe les plans focaux. Pourvu que les cellules soient efficacement dispersées par rotation de coverlet, les chercheurs peuvent suivre des processus mitotiques sur plusieurs générations et des événements méiotiques de la fusion nucléaire à la sporulation. La fabrication et le choix du bon coussin pour les expériences d'imagerie prend du temps à maîtriser, mais une fois atteint, peut contribuer à des observations au microscope très instructif.
Comme c'est le cas avec d'autres méthodes, la microscopie en cellule vive n'est pas exempte de limitations techniques. L'utilisation de protéines fluorescentes introduit des limites aux expériences qui limitent la portée de ce qui peut être étudié. Le blanchiment photo et la phototoxicité sont des problèmes typiques de l'acquisition prolongée d'images. Ils peuvent être contrecarrés en n'exposant pas les cellules à de courtes longueurs d'onde trop longues ou trop fréquentes. Pour les expériences impliquant GFP, CFP, YFP, mRFP, et DsRed, protéines fluorescentes typiques utilisées dans l'imagerie à cellules vivantes de levure de fission, il est courant d'employer 5-15% de lumière d'excitation et 100-500 ms temps d'exposition pour des expériences de routine. Ces paramètres changent, cependant, en fonction des exigences spécifiques de l'expérience du chercheur. En outre, les z-stacks composés de 9-13 sections avec 0,5 m d'espacement à l'aide d'un objectif 60x est suffisant pour résoudre l'épaisseur d'une cellule de levure de fission. En outre, il est important de confirmer que les marqueurs fluorescents ne perturbent pas la régulation ou la fonction appropriée des protéines cibles ou ne génèrent pas de faux phénotypes. Ainsi, il est conseillé de construire des souches contenant différentes étiquettes fluorescentes et d'affinité pour le même gène cible pour corroborer les observations par différents moyens. En outre, il incombe aux chercheurs de s'assurer que les paramètres expérimentaux peuvent être reproduits à travers les expériences et que les données recueillies sont aptes à l'analyse en aval1,3. Aucune technologie ne peut remplacer la pratique éprouvée consistant à valider méticuleusement les systèmes expérimentaux par une observation attentive et un examen rigoureux de la linéarité dans la détection des signaux fluorescents.
Enfin, il est crucial d'analyser les données de microscopie dans des formats qui ne modifient pas les images brutes. Fidji fournit d'excellents outils de documentation pour suivre les mesures des données brutes et permet aux chercheurs d'examiner différents paramètres cellulaires en une seule session. Ces caractéristiques, ainsi que sa richesse de tutoriels en ligne et une vaste couverture documentaire, font de Fidji un outil important pour mesurer, analyser et présenter des données d'imagerie cellulaire en direct qui décrivent la dynamique nucléaire de la levure de fission dans la mitose et la méiose.

La microscopie à cellules vivantes permet aux chercheurs d'examiner la dynamique nucléaire sans tuer les cellules de levure de fission et élimine le besoin de fixatifs et de taches létales. Il est possible d'observer la stabilité, le mouvement, la localisation et le moment des protéines étiquetées fluorescentes qui sont impliquées dans des événements importants tels que la réplication, la recombinaison et la ségrégation chromosomiques, en plus de la membrane et du cytosquelettique Mouvements. En maintenant la viabilité cellulaire et la détection du signal non toxique, il y a une intrusion physiologique minimale. Lorsqu'elle est effectuée correctement, cette méthode de microscopie peut réduire les effets de confusion qui découlent de la manipulation technique prolongée ou de la réactivité chimique fausse. En outre, au cours d'une expérience, les chercheurs peuvent faire des observations pertinentes des états nutritionnels et de stress de levure de fission, de l'efficacité proliférante, et du statut apoptotique qui indiquent des paramètres d'imagerie inappropriés ou la physiologie anormale de cellules1 ,2,3.
La mitose et la méiose sont caractérisées par la division nucléaire et cellulaire. Dans la méiose, contrairement à la mitose, le contenu génétique est réduit de moitié à mesure que les cellules parentes donnent naissance à des cellules filles4. Parce que l'imagerie cellulaire vivante fournit une dimension temporelle en plus de la relation spatiale, un grand nombre de cellules peuvent être examinées en temps réel. La microscopie à cellules vivantes a permis aux chercheurs d'examiner la dynamique de la division nucléaire à l'aide d'étiquettes fluorescentes pour les histones5, sous-unités de cohésine6, microtubules7, centrores8, kinétochores9, composants de le corps de poteaux de fuseau (SPB)10, et ceux du complexe de passager de chromosome (CPC)11. En dehors de l'appareil de ségrégation chromosomique, l'imagerie cellulaire vivante a également capturé le comportement des protéines nécessaires, mais pas directement impliqués dans la ségrégation chromosomique. La fonction de ces protéines a été montrée pour influencer la réplication, la recombinaison de chromosome, le mouvement nucléaire, et l'attachement de chromosome aux microtubules12,13,14. Ces observations ont contribué à une meilleure compréhension des événements cellulaires dont les composants fonctionnels n'étaient pas propices à l'examen biochimique ou génétique. Avec de nouveaux progrès dans la technologie de microscopie, les limitations telles que la mauvaise résolution, le photoblanchiment, la phototoxicité, et la stabilité de foyer diminueront, facilitant ainsi de meilleures observations en temps réel de la dynamique nucléaire mitotique et méiotique1, 2,3. La méiose est particulièrement difficile car il s'agit d'une voie de différenciation terminale qui nécessite une attention particulière à la synchronisation.
Le but de ce protocole est de présenter une méthode relativement simple pour examiner la dynamique nucléaire en temps réel de levure de fission dans la mitose et la méiose. Pour ce faire, il est nécessaire d'utiliser des cellules qui n'ont pas été exposées au stress environnemental, de préparer des coussinets d'agarose qui peuvent résister à une imagerie prolongée et de monter des cellules à des densités qui facilitent la visualisation de la dynamique unicellulaire. En outre, ce protocole utilise des cellules transportant des protéines étiquetées fluorescentes qui servent de marqueurs utiles pour la cinétique nucléaire (Hht1-mRFP ou Hht1-GFP), la ségrégation chromosomique (Sad1-DsRed), la dynamique du cytosquelette (Atb2-mRFP), transcriptionnel l'activation dans G1/S (Tos4-GFP), et la stabilité de cohésion dans la méiose (Rec8-GFP). Cette méthode introduit également d'autres marqueursnucléaires et cytosliques (tableau I) qui peuvent être utilisés dans différentes combinaisons pour répondre à des questions sur des processus cellulaires spécifiques. En outre, des outils fidjiens de base sont mis en vedette pour aider les chercheurs à traiter les images en cellule vivante et à analyser différents types de données. La force de cette approche provient de l'utilisation d'observations en temps réel de la dynamique des protéines, le calendrier et la stabilité pour décrire les processus qui font partie intégrante de l'exécution appropriée de la mitose et la méiose.

<table><tbody><tr><td>Objectif Plan Apochromat 60x</td><td>Olympus</td><td>AMEP4694</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A-8751</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>7558B</td><td>IB4917-10 kg</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>Belly Dancer rotator</td><td>Stovall</td><td>Brevet US #4.702.610</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma</td><td>B-4501</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma</td><td>B-6768-5kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot ; 2H2</td><td>0,Sigma</td><td>C3306-500G</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Sigma</td><td>C-0759</td><td></td></tr><tr><td>Convolve Plug-in logiciel 3D</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap HQ Caméra CCD</td><td>Roper</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Housse</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot ; 5H20,END</td><td></td> <td>CX-2185-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence à déconvolution DeltaVision</td><td>GE Healthcare/Applied Precision</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Diffraction PSF Plug-in logiciel 3D</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen</td><td>Sunrise</td><td>2023 ; 1kg</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&middot ; 6H2O</td><td>END</td><td>FX9259-04</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>Barnstead</td><td>Thermo Lyne</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H8125-100g</td><td></td></tr><tr><td>Huygens logiciel de déconvolution</td><td>SVI</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Imaris logiciel de déconvolution</td><td>Bitplane</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Shell lab</td><td>#3015</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Iterative Deconvolve plug-in logiciel</td><td>3D OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckvadt</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Lanoline</td><td>Sigma</td><td>L7387-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma</td><td>L8912-100g</td><td></td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Sigma</td><td>L5626-500g</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de malt (ME)</td><td>MP</td><td>4103-032</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot ; 6H20</td><td>AMRESCO</td><td>0288-500G</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4,</td><td>Mallinckvadt</td><td>6192-02</td><td></td></tr><tr><td>Acide molybdique</td><td>Sigma</td><td>M-0878</td><td></td></tr><tr><td>Na2S04 </td><td>Mallinckvadt</td><td>8024-03</td><td></td></tr><tr><td>Acide nicotinique,Sigma</td><td></td> <td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>Acide pantothénique</td><td>Sigma</td><td>P-5161</td><td></td></tr><tr><td>Cire de paraffine</td><td>Fisher</td><td>s80119WX</td><td></td></tr><tr><td>Pombe glutamate medium (PMG)</td><td>Sunrise</td><td>2060-250</td><td></td></tr><tr><td>softWorx v3.3 logiciel de traitement d’image</td><td>GE Healthcare</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sporulation Medium poudre</td><td>Sunrise</td><td>1821-500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse à température contrôlée</td><td>Beckman</td><td>Allwgra 6KR xentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>AMRESCO</td><td>0847-500g</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Equaline</td><td>F79658</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure plus suppléments (YES)</td><td>Sunrise</td><td>2011-1kg</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot ; 7H2O</td><td>J.T.Baker</td><td>4382-04</td><td></td></tr></tbody></table>

examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence microscopie à cellules vivantes

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

L'imagerie cellulaire vivante est une technique de microscopie utilisée pour examiner la dynamique cellulaire et protéique dans les cellules vivantes. Cette méthode d'imagerie n'est pas toxique, n'interfère généralement pas avec la physiologie cellulaire et nécessite une manipulation expérimentale minimale. Les faibles niveaux d'interférence technique permettent aux chercheurs d'étudier les cellules à travers de multiples cycles de mitose et d'observer la méiose du début à la fin. À l'aide d'étiquettes fluorescentes comme la protéine fluorescente verte (GFP) et la protéine fluorescente rouge (DP), les chercheurs peuvent analyser différents facteurs dont les fonctions sont importantes pour des processus comme la transcription, la réplication de l'ADN, la cohésion et la ségrégation. Couplé e à l'analyse des données à l'aide de Fidji (version gratuite et optimisée de l'ImageJ), l'imagerie cellulaire vivante offre diverses façons d'évaluer le mouvement des protéines, la localisation, la stabilité et le calendrier, ainsi que la dynamique nucléaire et la ségrégation chromosomique. Cependant, comme c'est le cas avec d'autres méthodes de microscopie, l'imagerie cellulaire vivante est limitée par les propriétés intrinsèques de la lumière, qui mettent une limite à la puissance de résolution à des grossissements élevés, et est également sensible à la photoblanchiment ou la phototoxicité à haute longueur d'onde Fréquences. Cependant, avec un certain soin, les investigateurs peuvent contourner ces limitations physiques en choisissant soigneusement les bonnes conditions, les contraintes, et les marqueurs fluorescents pour permettre la visualisation appropriée des événements mitotiques et méiotiques.

Ici, nous présentons l'imagerie à cellules vivantes qui est une méthode de microscopie non toxique qui permet aux chercheurs d'étudier le comportement des protéines et la dynamique nucléaire dans les cellules vivantes de levure de fission pendant la mitose et la méiose.

Examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence Microscopie à cellules vivantes

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

La microscopie cellulaire vivante permet aux chercheurs d’étudier la dynamique nucléaire de la levure de fission dans la mitose et la méiose en temps réel. La force de cette méthode provient de l’étude des processus nucléaires dans les cellules vivantes dans des conditions physiologiques normales qui élimine le besoin de fixatifs toxiques et de taches. Cette technique répond aux questions liées au timing, à la stabilité et à la mobilité des protéines qui peuvent ne pas être utiles à la manipulation génétique ou biomécanique.Il est essentiel de prêter une attention particulière à la santé et la forme physique des cellules de levure de fission avant l’imagerie. Examinez toujours la morphologie et les caractéristiques de croissance pour assurer la cohérence des résultats entre les expériences. Ce protocole montre la façon relativement simple de préparer des diapositives au microscope qui, lorsqu’elles sont maîtrisées correctement, peuvent améliorer la cohérence et la reproductibilité de l’imagerie cellulaire vivante prolongée.Pour commencer à ramasser la matière cellulaire de la plaque de réveil cryogénique, stries-la sur les plaques OUI, et les incuber à 25 degrés Celsius ou 32 degrés Celsius selon le génotype de levure pour réveiller les souches de levure de fission de la conservation cryogénique. Ensuite, utilisez une boucle stérile pour ramasser les cellules des colonies individuelles dans les souches de levure de fission éveillées et les inoculer dans des tubes à essai contenant trois millilitres de milieu liquide YES. Placez les tubes dans un shaker à 150 à 220 rpm pour croître à 25 ou 32 degrés Celsius pendant la nuit jusqu’à la phase de journal tardif avec une lecture de densité optique désirée de 0,7 à 1,0.Transférer 10 microlitres de la culture sur une lame de microscope. Mettez un coverslip dessus et placez-le sous un microscope pour vérifier la morphologie cellulaire appropriée et l’état nutritionnel. Pour mettre en place une toboggan au microscope pour l’analyse de la mitose ou de la méiose, ajoutez d’abord deux grammes d’agarose dans le flacon de 500 millilitres contenant 100 millilitres de milieu minimal plus suppléments pour la mitose ou le milieu de sporulation liquide pour la méiose.Réchauffer la solution d’agarose dans un four à micro-ondes à 60% de puissance par incréments de 10 secondes ou placer le bécher dans un bain d’eau de 55 degrés Celsius pendant 10 minutes. Faites tourbillonner la solution pour assurer une fonte efficace. Installez deux glissières de microscope sur un support de pointe pipette avec la glissière supérieure reposant sur deux piles de ruban de laboratoire aux deux extrémités comme support faisant une forme croisée.Réglez la distance entre les deux glissières à plus de deux millimètres afin de former un tampon épais dans les étapes suivantes pour une imagerie prolongée. Après avoir refroidi l’agarose fondue pendant une minute à température ambiante, retirez la lame supérieure et utilisez une pointe de pipette à alésage large pour distribuer de 50 à 100 microlitres sur la glissière inférieure pour faire une place. Avant que l’agarose se refroidisse placer la diapositive supérieure sur le dessus pour générer une garniture de propagation d’environ un et 1/2 à deux centimètres de diamètre.L’imagerie cellulaire vivante optimale est essentielle pour les étapes ultérieures de traitement des données. Assurez-vous d’éliminer les babioles d’air dans l’agarose fondue et de créer un tampon mince pour les périodes d’imagerie de plus de quatre heures. Pour examiner les événements mitotiques cultiver des cellules à partir de cultures de démarrage soit dans emm liquide ou PMG plus suppléments pendant la nuit.Transférer un millilitre de la culture dans une cuvette et mesurer sur le spectrophotomètre à une longueur d’onde de 595 nanomètres. La croissance cellulaire est considérée comme une phase médiane lorsque la densité optique atteint 0,4. Puis centrifugeuse d’un millilitre de la suspension cellulaire à 1375 fois g pendant une minute.Retirez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans un milieu minimal plus des suppléments à un volume final de 100 microlitres. Pour l’image des événements méiotiques cultiver des cellules à partir de cultures de démarrage dans un milieu minimal plus suppléments pendant la nuit. La croissance cellulaire est considérée comme une phase de journal tardif lorsque la densité optique à 595 nanomètres se situe entre 0,7 et un.Ensuite, à partir des cultures de grumes tardives obtenir 500 microlitres de chaque souche de type compagnon, H négatif et H positif, et se combiner pour faire une suspension cellulaire d’un millilitre. Centrifuger les cellules à 1375 fois g pendant une minute. Retirer le supernatant et resuspendre la pastille en un millilitre d’extrait de maltose liquide.Répétez le lavage à l’extrait de maltose trois fois de plus pour assurer un élimination efficace des nutriments. Après le dernier lavage à l’extrait de maltose, resuspendez les cellules en un millilitre d’extrait de maltose et transférez le mélange dans un flacon de 50 millilitres contenant neuf millilitres d’extrait de maltose. Incuber de 12 à 16 heures à 22 à 25 degrés Celsius à une vitesse de rotation minimale comprise entre 50 et 100 rpm.L’apparition de nombreux touffes rondes de levure de fission résultant de l’auto-flocculation abondante indique un accouplement efficace. Ensuite, prélivez un échantillon d’un millilitre de la culture de l’accouplement et de la centrifugeuse à 1 375 fois g pendant une minute. Enlevez 750 microlitres du supernatant et réutilisez les cellules dans le surnatant restant.Vortex vigoureusement pendant cinq secondes pour perturber les touffes. Distribuez 20 microlitres d’une suspension de cellule mitotic ou méiotique sur un pad d’agarose de 2%. Retirez tout excès de milieu en inversant la lame et en la mettant sur le dessus de l’essuie-tout sans peluche pendant deux à trois secondes.Retournez la lame et placez doucement un couvercle en verre sur le dessus de la garniture, en veillant à ne pas générer de bulles d’air. Pour créer une monocouche cellulaire faire pivoter le coverslip dans le sens des aiguilles d’une montre avec l’index pour un tour complet pour les cellules de mitose ou deux tours complets pour les cellules de méiose. Assurez-vous que la matière cellulaire se disperse à travers la garniture d’agarose permettant une meilleure séparation des cellules simples ou des asci.À l’aide d’un petit bâton en bois, distribuez le scellant en hydrocarbures fondu le long des bords du coverslip pour sceller chaque coussin agarose. Une fois que la garniture d’agarose est scellée placez-la sur l’étape de microscope. Allumez la chambre de température et réglez-la à la température désirée.Placez une assiette avec une serviette en papier humide dans la chambre pour contrôler l’humidité du système de microscope. Laissez-le équilibrer pendant 10 à 15 minutes aux conditions d’imagerie appropriées. Cela permet à toutes les bulles d’air restantes de se dissiper et tout changement d’agarose de dernière minute se produit.Utilisez l’objectif 40X pour trouver les champs de vision appropriés à l’image. Passez à l’objectif 60X pour commencer l’acquisition de données. Dans le logiciel qui contrôle la fonction microscope choisir les ensembles de filtre microscope qui correspondent le mieux aux fluorophores en observation.Ajustez les longueurs d’onde d’excitation pour correspondre aux fluorophores utilisés, utilisez la puissance d’excitation la plus faible qui produit un signal cohérent et utilisez des temps d’exposition de quatre à huit heures pour générer des données d’imagerie acceptables mais quantifiables et reproductibles. Cumulez au moins six points de temps d’acquisition toutes les heures. Dans le logiciel de collecte d’images sélectionnez au moins un canal de fluorescence à partir duquel acquérir des données et utiliser un stock Z composé de 13 sections avec espacement de 0,5 micromètre.Dans le logiciel Fidji télécharger une image décontvolée en sélectionnant la fonction Bio-Formats Importateur sous le menu plug-ins. Dans la fenêtre pop-up import options, sélectionnez Hyperstack, mode Couleur par défaut, vérifiez l’échelle automatique et appuyez sur le bouton OK. Assurez-vous que la fenêtre affichée a le nombre correct de canaux de fluorescence et les délais en faisant défiler latéralement sur les barres respectives en bas.Enregistrer sous forme de fichier Tiff qui ne comprime pas les données. Ensuite, sous le menu Analyser, utilisez l’option Mesures définies pour choisir différents paramètres. Par exemple : Zone, valeur grise min max, densité intégrée, valeur grise moyenne, médiane, position de pile, périmètre et étiquette d’affichage.Sélectionnez Couleur et cliquez sur l’outil Canaux. Dans la fenêtre pop-up channels, vérifiez le canal couleur pour lequel l’intensité ou la zone sera mesurée. Sélectionnez l’image, puis tapez et cliquez sur 32 bits.Choisissez les fonctionnalités Adjust et Threshold sous le menu Image. Vérifiez la case fond sombre, sélectionnez la méthode Par défaut et choisissez Rouge pour superposer les signaux d’intérêt. Utilisez l’outil baguette magique pour mettre en évidence chaque structure d’intérêt et appuyez sur la lettre T sur le clavier pour ajouter le retour sur investissement sélectionné à la fenêtre pop-up roi manager.Ensuite, ouvrez le dossier roi zippé pour charger le gestionnaire roi et cliquez sur chaque identificateur roi dans le panneau latéral gauche. Sélectionnez Mesurer dans le menu Analyser et répétez cette commande sur chaque identificateur roi pour quantifier les objets d’intérêt dans toutes les tranches de la pile d’images. Enregistrez les résultats en tant que fichier CSV pour l’analyse statistique.Dans cette étude si les cellules meurent de faim en raison de la limitation des nutriments ou de la prolifération, elles montreront des vacuoles excédentaires et une diminution de la taille des cellules. Les cellules logarithmiques montrent la réplication active de l’ADN et la division cellulaire, ainsi que l’expression pannucléaire de Tos4-GFP et la séparation des foyers Sad1-DsRed. Le défaut de s’accoupler, comme c’est le cas lorsque les cellules ne sont pas suffisamment affamées d’azote, les empêchera d’entrer dans la méiose.Une paire de cellules de fission subissant la karyogamie sont montrées. La flocculation robuste de la suspension cellulaire d’accouplement augmente l’interaction cellule-cellule et indique ainsi l’accouplement réussi et l’induction méiotique efficace. Les asci zygotiques prennent de multiples formes, y compris les formes zig-zag et bananes.Dans la mitose pendant que les cellules passent de la métaphyse à la télophase, le premier changement implique une contraction de la taille nucléaire dans la métaphyse, tandis que le second montre la division de noyau pendant l’anaphase. En plus de partager une certaine dynamique de ségrégation avec les cellules mitotiques, les cellules méiotiques présentent une oscillation nucléaire lors de la recombinaison homologue et une réduction supplémentaire des nucléosides à la fin de l’anaphase II.It est la responsabilité des chercheurs de s’assurer que les paramètres de l’expérience peuvent être reproduits entre les expériences, et que les données recueillies sont aptes à l’analyse en aval. L’imagerie cellulaire vivante a permis aux chercheurs d’examiner en détail les mécanismes de la division nucléaire dans la mitose et la méiose.À mesure que les étiquettes fluorescentes et les capacités du microscope amélioreront le nombre et le type de processus que nous pouvons observer augmenteront.

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