Quantification de l'athérosclérose chez les souris

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde. Les modèles muraux sont des outils utiles pour étudier cette maladie et notre protocole peut être utilisé pour quantifier l’athérosclérose chez la souris. En utilisant ce protocole, la taille de lésion peut être mesurée dans trois emplacements vasculaires.

La racine aortique, l’arc aortique et l’artère brachiocéphale. La quantification de l’athérosclérose chez la souris peut être une tâche fastidieuse. Nous avons fourni des étapes détaillées qui, nous l’espérons, peuvent accélérer le processus.

Certaines de ces étapes sont difficiles à décrire par écrit. Nous espérons que cette vidéo vous aidera à obtenir une analyse robuste de la taille des lésions athéroclérotiques. Après la récolte d’un cœur de souris selon les protocoles standard, placez le cœur sur un lit de liège, côté ventral vers le haut sous un microscope disséquant et utilisez une aiguille pour fixer le cœur au liège à travers l’apex.

Tenant la base du coeur avec des forceps anatomiques, utilisez un scalpel tenu à un angle de 20 degrés caudally dans le plan sagittal, et 20 degrés cranially dans le plan transversal, pour couper les deux tiers apical du coeur. Intégrir la racine aortique et la base du cœur dans le composé optimal de température de coupe, ou OCT, et presser doucement le cœur avec les forceps pour remplir la racine aortique avec du composé et pour enlever les bulles d’air. Transférer le spécimen au fond d’un cryomold rempli d’OCT avec la racine aortique perpendiculaire à la surface inférieure et congeler le composé sur de la glace sèche.

Rangez ensuite l’échantillon de tissu dans un sac de congélation à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit cryosection. Pour préparer un lit d’épinglant pour l’analyse en face, pliez un segment de film de cire de paraffine huit fois pour faire une surface plate de 25 par 25 mm et envelopper le ruban isolant électrique noir autour du film pour faire un fond foncé pour l’aorte. Placez une étiquette sur le côté arrière du lit d’épinglant et utilisez un crayon de plomb pour enregistrer le numéro d’identification de la souris.

Transférer l’arc aortique dans le lit d’épinglant et ajouter une goutte de PBS au tissu. À l’aide d’un microscope stéréo, nettoyez l’aorte du tissu adipeux périadventitial restant et utilisez des ciseaux Vannas et des forceps Dumont pour éplucher doucement tout le tissu adipeux environnant sans manipuler ni endommager l’aorte. Ensuite, introduisez les ciseaux Vannas dans le lumen aortique pour exposer la surface intimale.

Commencez à couper la courbure extérieure de l’arc ascendant dans la direction distale, en continuant à ouvrir les branches, y compris l’artère brachiocéphale et en épargnant la partie dorsale de la région thoracique descendante. Pour afficher la surface intimale, coupez la courbure inférieure et pliez l’aorte. À l’aide d’un porte-aiguilles Castroviejo micro, fixer l’arc ouvert vers le lit d’épinglant avec l’extrémité émoussée des broches d’insectes minuten sans étirer le spécimen, en pliant doucement les broches loin de l’échantillon que le tissu est maintenu en place.

Rangez ensuite l’arc épinglé face cachée dans une boîte de Pétri de PBS à quatre degrés Celsius. Pour la coloration Soudan IV, rincer le spécimen pendant cinq minutes dans une boîte de Pétri de 70% d’éthanol avec l’arc orienté vers le bas, avant de transférer le spécimen dans un plat de Soudan IV solution de travail pendant sept minutes. À la fin de l’incubation, rincer l’échantillon à l’aide de deux lavages de trois minutes dans 80 % d’éthanol pour acher la surface intimale normale, suivi d’un rinçage final en PBS avant de retourner le tissu dans sa boîte pétri d’origine.

Puis acquérir des micrographes sous un microscope stéréo connecté à un appareil photo numérique à un grossissement 10X, obtenir des images de l’arc épinglé immergé dans PBS, en utilisant de petits poids métalliques pour tenir le lit d’épinglant au fond de la boîte petri. Pour obtenir des cryosections de la racine aortique intégrée, réglez la température du cryostat à moins 20 degrés Celsius et l’épaisseur de la section à 10 micromètres. Monter le bloc OCT contenant la racine aortique sur le porte-spécimen avec le tissu ventriculaire orienté vers l’extérieur.

Sécurisez le positionnement avec un oct supplémentaire si nécessaire. La racine aortique doit maintenant être positionnée perpendiculairement à la lame du couteau. Recueillir les sections de contrôle initiales contenant du tissu musculaire cardiaque sur des diapositives de microscope ordinaires, en vérifiant la progression à travers le tissu tous les 200 micromètres sous un microscope léger.

Lorsque la première cuspide aortique apparaît, inclinez le spécimen vers le point zéro cuspide pour aligner le plan de section avec les deux autres cuspides et compter chaque section de 10 micromètres qui est coupée à partir du point zéro. Commencez à collecter des sections pour analyse à partir de 90 micromètres et à partir de la diapositive prévue, jusqu’à ce que 800 micromètres à partir du point zéro a été atteint. Le calcul de la fraction de lésion de la surface totale du vaisseau de la racine aortique rend les données moins sensibles aux différences d’angle possibles pendant la sectionnement.

En outre, il pourrait être illustratif de calculer la zone sous la courbe ou la taille de lésion d’atheroto par souris et de présenter les données dans une parcelle de point pour visualiser davantage les variations individuelles au sein des groupes. L’accumulation de lipides lésionnels peut être quantifiée par la couleur seuil de l’huile rouge O zones positives de la zone de lésion totale. Les artères coronaires droites et gauches divergent habituellement de l’aorte autour de 250 micromètres du sinus aortique qui coïncide souvent avec les tailles de lésion les plus proéminentes.

La suppression du fond sombre dans les images représentatives des arcs aortiques en face peut améliorer l’affichage visuel. La taille de lésion est typiquement normalement distribuée dans les groupes, permettant l’analyse statistique utilisant le t-test de l’étudiant entre les groupes. Nous vous recommandons de pratiquer avec du matériel d’essai jusqu’à ce que vous avez obtenu des compétences suffisantes pour le traitement de vos échantillons expérimentaux.

Si la taille de lésion est différente entre les groupes, vous devriez déterminer le mécanisme, car une analyse de composition de lésion est habituellement la prochaine étape à poursuivre.