Name: Quantification de lathérosclérose chez les souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Apprenez à quantifier l'athérosclérose chez la souris en mesurant les lésions dans la racine aortique, l'arc aortique et l'artère brachio-céphalique. Cette méthode standardisée améliore la précision et la reproductibilité des analyses.

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Nous remercions tous les anciens membres de l'unité expérimentale de recherche cardiovasculaire de Gâran K Hansson qui a contribué à l'élaboration de ce protocole au cours du dernier quart de siècle. Nous sommes particulièrement reconnaissants pour les contributions d'Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anna-Karin Robertson et Inger Bodin. Ces travaux ont été soutenus par la subvention du projet 06816 et le soutien de Linné 349-2007-8703 du Conseil suédois de la recherche, et par des subventions de la Fondation suédoise Heart-Lung, du Conseil du comté de Stockholm, de la Fondation du professeur Nanna Svartz, de Loo et de Hans Osterman. Foundation for Medical Research, Karolinska Institutet's Research Foundation et Foundation for Geriatric Diseases à l'Institut Karolinska.

<ol><li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li>
<li>Gistera, A., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The immunology of atherosclerosis.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).</li>
<li>Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+atherosclerosis%2C+and+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease.</a> New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).</li>
<li>Williams, K. J., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response-to-retention+hypothesis+of+early+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).</li>
<li>Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+LDL+-+trigger+of+atherosclerosis+and+inflammation+in+the+arterial+intima%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima.</a> Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).</li>
<li>Ruuth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+low-density+lipoprotein+particles+to+aggregate+depends+on+particle+lipidome%2C+is+modifiable%2C+and+associates+with+future+cardiovascular+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths.</a> European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).</li>
<li>Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+VCAM-1+and+ICAM-1+at+atherosclerosis-prone+sites+on+the+endothelium+in+the+ApoE-deficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).</li>
<li>Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+site+on+macrophages+that+mediates+uptake+and+degradation+of+acetylated+low+density+lipoprotein%2C+producing+massive+cholesterol+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).</li>
<li>Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+susceptibility+to+atherosclerosis+among+inbred+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice.</a> Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).</li>
<li>Russell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+history+of+mouse+inbred+strains%3A+contributions+of+Clarence+Cook+Little%5BTitle%5D)+AND+%22Origins+of+Inbred+Mice%2C+Morse%2C+HC%2C+eds.+%28Academic+Press%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little.</a> Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).</li>
<li>Waterston, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).</li>
<li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-driven+immunometabolic+responses+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).</li>
<li>Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of atherosclerosis.</a> Current Protocols in Immunology. Chapter 15, Unit 15.24.11-23 (2012).</li>
<li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71 (2), 343-353 (1992).</li>
<li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258 (5081), 468-471 (1992).</li>
<li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).</li>
<li>Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+xanthomatosis+and+atherosclerosis+in+cholesterol-fed+low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).</li>
<li>Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-based+therapies+for+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">T cell-based therapies for atherosclerosis.</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).</li>
<li>Skalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subendothelial+retention+of+atherogenic+lipoproteins+in+early+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis.</a> Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).</li>
<li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+low+density+lipoprotein+receptor-binding+site+in+apolipoprotein+B100+and+the+modulation+of+its+binding+activity+by+the+carboxyl+terminus+in+familial+defective+apo-B100%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).</li>
<li>Sanan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice+expressing+human+apolipoprotein+B-100+develop+complex+atherosclerotic+lesions+on+a+chow+diet%3A+no+accentuation+by+apolipoprotein%28a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).</li>
<li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+against+T-cell+epitopes+of+native+ApoB100+reduces+vascular+inflammation+and+disease+in+a+humanized+mouse+model+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis.</a> Journal of Internal Medicine. , (2017).</li>
<li>Johnson, J. L., Jackson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+plaque+rupture+in+the+apolipoprotein+E+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse.</a> Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).</li>
<li>Calara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+plaque+rupture+and+secondary+thrombosis+in+apolipoprotein+E-deficient+and+LDL+receptor-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice.</a> The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).</li>
<li>Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction+mediated+by+endothelin+receptor+signaling+in+hypercholesterolemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).</li>
<li>Daugherty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendation+on+Design%2C+Execution%2C+and+Reporting+of+Animal+Atherosclerosis+Studies%3A+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).</li>
<li>Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+atherosclerotic+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice.</a> Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).</li>
<li>Purcell-Huynh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+high+levels+of+human+apolipoprotein+B+develop+severe+atherosclerotic+lesions+in+response+to+a+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet.</a> Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).</li>
<li>Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+treatment+reduces+atherosclerosis+in+apo+E+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).</li>
<li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+Lymphocytes+in+Mouse+Atherosclerotic+Plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).</li>
<li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+signaling+in+T+cells+promotes+stabilization+of+atherosclerotic+plaques+through+an+interleukin-17-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway.</a> Science Translational Medicine. 5 (196), 196ra100 (2013).</li>
<li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Density+Lipoprotein-Reactive+T+Cells+Regulate+Plasma+Cholesterol+Levels+and+Development+of+Atherosclerosis+in+Humanized+Hypercholesterolemic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice.</a> Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).</li>
<li>Daugherty, A., Whitman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantification of atherosclerosis in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).</li>
<li>Baglione, J., Smith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+for+mouse+atherosclerosis+in+the+aortic+root%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root.</a> Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).</li>
<li>Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gamma-irradiation+and+bone+marrow+transplantation+on+atherosclerosis+in+LDL+receptor-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).</li>
<li>Naghavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+vulnerable+plaque+to+vulnerable+patient%3A+a+call+for+new+definitions+and+risk+assessment+strategies%3A+Part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I.</a> Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).</li>
<li>Seijkens, T. T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CD40-Induced+TRAF6+Signaling+in+Macrophages+Reduces+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les maladies cardiovasculaires sont le principal tueur dans le monde et de nouvelles mesures préventives sont nécessaires2. Les modèles de souris de la maladie fournissent une plate-forme complète pour l'étude de la pathophysiologie et des traitements expérimentaux13. Une quantification fiable de la taille des lésions est essentielle à cette approche. Cependant, les méthodes de quantification diffèrent d'un laboratoire à l'autre. La normalisation et l'optimisation sont un processus continu depuis les années 198013,27,33,34. Les racines aortiques sont apparues comme le site le plus populaire pour quantifier l'athérosclérose expérimentale. Des coupes transversales de plaques permettent de comparer le volume de la plaque entre les groupes. En préparations face sont favorisés pour la quantification des lésions dans les segments plus grands de l'aorte. La méthode en face visualise la quantité de plaque et permet la quantification de la couverture de la plaque, mais ne tiennent pas compte de l'épaisseur de la plaque. La pertinence biologique des différences observées est étayée par des résultats cohérents à différents endroits dans l'arbre vasculaire. L'évaluation du développement de l'athérosclérose à différents endroits traite des effets spécifiques possibles au site. L'effet des cellules hématopoïétiques transplantées sur le développement d'athérosclérose peut être évalué dans le Ldlr hypercholestérolémique -/- chimères. Cependant, l'irradiation de corps entier affecte le processus d'athérosclérose avec des effets spécifiques de site. Des lésions atherosclérotiques plus proéminentes sont développées dans la racine aortique, tandis que le développement réduit de lésion est observé dans les arcs aortiques35.
Il est important de noter que non seulement la taille des lésions doit être abordée dans les études sur l'athérosclérose expérimentale. La composition des lésions est également un paramètre clé. Plusieurs dispositifs de plaque ont été associés aux manifestations de la maladie chez l'homme36. La section en série de la racine aortique laisse plusieurs sections disponibles pour une analyse minutieuse de la composition de la plaque. La rupture de plaque chez l'homme est caractérisée par un chapeau fibreux mince avec peu de cellules lisses de muscle, le contenu clairsemé de collagène et des signes d'inflammation dans les plaques36. Bien que la rupture de plaque soit un événement rare dans les modèles de souris de l'athérosclérose, les marqueurs pour la stabilité de plaque sont instructifs pour évaluer. Les approches translationnelles pourraient confirmer les résultats mécanistes des modèles de souris et découvrir des caractéristiques importantes de la maladie humaine31. L'état inflammatoire des plaques atherosclérotiques pourrait être déterminé par la coloration immunohistochemistry de VCAM-1, de classe II de MHC, de macrophages, et de lymphocytes30. Certains protocoles utilisent des sections longitudinales dans le plan coronal de l'arc aortique ou de l'artère brachiocéphale pour mesurer la taille et la composition des lésions athérosclérotiques37. Cependant, cette méthode alternative ne laisse que peu de sections à analyser, ce qui limite ses applications.
Une première étape critique dans ce protocole est la capacité de récolter les aortes efficacement. La coordination œil-main sous le microscope nécessite de la pratique et est cruciale à la fois pour la microdissection et l'épinglage ultérieur de l'arc aortique. La prochaine étape critique de ce protocole est la collecte de sections série à partir de la racine aortique. Quatre-vingts sections consécutives doivent être collectées pour chaque souris, ce qui nécessite à la fois de la concentration et de la patience. La compétence méthodologique pourrait accélérer considérablement les processus décrits. Néanmoins, la quantification de la lésion athérosclérotique est toujours une tâche longue. Les nouvelles technologies, la manipulation automatisée et l'imagerie des petits animaux pourraient faciliter la quantification de l'athérosclérose expérimentale à l'avenir. La progression de l'athérosclérose est lente et la plupart des protocoles expérimentaux dans les modèles de souris prennent plus de quatre mois pour compléter13. Par conséquent, les aortes doivent être collectées de manière optimisée aux points de terminaison d'étude. Ce protocole fournit un guide complet pour récolter efficacement les aortes et le traitement proposé prépare les aortes pour une utilisation polyvalente, y compris la quantification des lésions dans la racine aortique, l'arc aortique et l'artère brachiocéphalique. Espérons que le protocole peut réduire la variabilité expérimentale, améliorer la fiabilité des résultats, et conduire à des résultats qui ouvriront la voie à de nouveaux traitements contre l'athérosclérose.

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde, les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux représentant un décès sur quatre1. La plupart des cas sont provoqués par l'athérosclérose, une maladie caractérisée par une accumulation lente de plaques chargées de lipides avec des signes d'inflammation chronique dans les artères de grande et moyenne taille2. La maladie reste habituellement inaperçue pendant plusieurs décennies jusqu'à ce qu'une rupture ou une érosion de la plaque provoque une thrombose artérielle qui mène aux dommages ischémiques de tissu.
Une artère normale se compose d'une couche d'intima avec des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses peu distribuées, une couche média avec des cellules musculaires lisses et des lamelles élastiques, et une couche adventitielle environnante avec le tissu conjonctif lâche3. Une rétention intimale de LDL compense le développement de l'athérosclérose4. L'accumulation et la modification des lipoprotéines conduisent à l'agrégation et au piégeage dans l'intima artérielle5. Une réponse inflammatoire est évoquée par les lipoprotéines piégées et modifiées6. Les cellules endothéliales commencent à exprimer des molécules d'adhérence, telles que VCAM-1 aux emplacements dans l'arbre artériel avec le flux sanguin turbulent, menant au recrutement des monocytes circulants et d'autres leucocytes7. Les monocytes infiltrants se différencient en macrophages qui engloutissent les lipides avec la transformation qui s'ensuit en cellules de mousse de macrophage8.
L'athérosclérose a été étudiée dans des modèles de souris avec une fréquence croissante depuis le milieu des années 1980. C57BL/6 est la souche de souris consanguine la plus couramment utilisée pour ces études, et elle est utilisée comme fond génétique pour la majorité des souches génétiquement modifiées9. Cette souche a été établie dans les années 192010, et son génome a été publié en 200211. Les expériences sur les modèles murins présentent plusieurs avantages : les colonies se reproduisent rapidement, le logement est économe en espace et la consanguinité réduit la variabilité expérimentale. Le modèle permet également des manipulations génétiques, telles que des suppressions de gènes ciblées et l'insertion de transgènes. Cela a conduit à une nouvelle compréhension pathophysiologique de la maladie et de nouvelles cibles de thérapie12.
Les souris de type sauvage C57BL/6 sont naturellement résistantes à l'athérosclérose. Ils ont la plupart du cholestérol circulant dans HDL, et les lésions athérosclérotiques complexes ne sont pas formées même lorsqu'elles sont alimentées un régime riche en graisses et en cholestérol13. Les souris hypercholestérolémiques, comme Apoe-/- sur le c57BL/6-arrière-plan, sont donc utilisées comme modèles expérimentaux de l'athérosclérose14,15. L'absence d'ApoE altère l'upprise hépatique des lipoprotéines restantes et perturbe sévèrement le métabolisme des lipides. Dans Apoe-/- souris, le cholestérol circulant est principalement dans les particules de VLDL, et les souris développent des plaques athérosclérotiques complexes sur un régime régulier de chow.
Ldlr-/- les souris imitent le développement de l'athérosclérose vue chez l'homme avec l'hypercholestérolémie familiale16. Les souris Ldlr-/- ont besoin d'un régime occidental de type pour développer l'athérosclérose17. Le régime occidental imite l'apport alimentaire humain et contient habituellement 0,15% de cholestérol. Le récepteur LDL reconnaît apoB100 et ApoE et médiatise l'apport de particules de LDL par endocytose. Les récepteurs de LDL sont fondamentaux pour le dégagement de foie du LDL de la circulation, alors que l'expression de récepteur de LDL dans les cellules hématopoietic n'influence pas ce processus. Ceci ouvre la possibilité pour la transplantation de moelle de Ldlr- / cellules dans l'hypercholestérolémie Ldlr-/- destinataires et évaluation du développement d'athérosclérose. Les chimères de moelle ont été couramment employées pour étudier la participation des cellules hématopoïétiques dans l'athérosclérose expérimentale. Cependant, la transplantation de moelle pourrait influencer la taille et la composition des plaques athérosclérotiques, rendant l'interprétation des résultats ambigu.
Différentes variantes d'Apoe-/et de Ldlr-/- des souris présentant d'autres altérations génétiques ont été développées pour étudier des processus spécifiques de la maladie18. Un exemple est l'homme APOB100-transgénique Ldlr-/- (HuBL) souris qui portent la pleine longueur humaine APOB100 gène19,20. Ces souris développent l'hypercholestérolémie et l'athérosclérose sur un régime régulier de chow. Cependant, le développement de plaques athérosclérotiques complexes prend au moins six mois et les protocoles expérimentaux plus courts utilisent habituellement le régime occidental21. Une grande fraction du cholestérol plasmatique circule dans les particules de LDL, ce qui donne aux souris HuBL un profil de lipoprotéines dyslipidémiques plus humains que les souris Apoe-/- et Ldlr-/- Les souris HuBL permettent également des études de l'apoB humain comme autoantigène22.
Les modèles de souris de l'athérosclérose développent des plaques athérosclérotiques complexes avec des dispositifs partagés de la maladie humaine. Cependant, les plaques sont assez résistantes à la rupture avec l'infarctus du myocarde qui s'ensuit. L'athérothromose n'est détectée que sporadiquement et expérimentalement difficile à évaluer23,24,25. Des modèles spéciaux de rupture de plaque ont été développés, mais le champ expérimental n'a pas de modèle fiable et reproductible pour l'évaluation des agents stabilisateurs de plaque.
Quantification de l'athérosclérose a été rapportée de nombreuses manières dans la littérature. Des efforts récents ont tenté de normaliser la conception expérimentale, l'exécution et la production de rapports sur les études sur les animaux26. Les chercheurs ont des préférences et des techniques différentes adaptées à leurs laboratoires. La plupart des projets de recherche sont également uniques d'une manière qu'ils nécessitent des modifications au protocole. En raison de la nature multifactorielle de la maladie, les contrôles optimaux varient d'un projet à l'autre. Les conditions locales et l'absence de normalisation peuvent entraîner des différences observées dans le développement de la maladie, ce qui entrave les progrès du domaine de la recherche. Les différences dans la variabilité expérimentale signifient également que les calculs statistiques de la puissance doivent être basés sur des études pilotes dans des conditions locales.
La quantification de l'athérosclérose est recommandée à plusieurs endroits dans l'arbre vasculaire. Ce protocole décrit comment obtenir des résultats de la racine aortique, de l'arc aortique, et de l'artère brachiocéphalique dans une souris simple, en plus de laisser le reste de l'aorte thoracoabdominale pour d'autres analyses. En préparations face permettent une quantification rapide des plaques chargées de lipides dans l'arc aortique. La charge de morbidité dans l'artère brachiocéphalique peut également être quantifiée si les spécimens sont soigneusement montrés. Le découpement plus long de la racine aortique laisse plusieurs sections disponibles pour l'évaluation détaillée de la composition de la plaque.

<table><tbody><tr><td>Acétone</td><td>VWR Chemicals</td><td>20066.296</td><td>Pour la fixation de coupes pour l’immunohistochimie.</td></tr><tr><td>Ruban isolant électrique noir (50 mm de large)</td><td></td><td>Tout détaillant spécialisé-Pour</td> <td>créer des lits d’épinglage pour les arcs aortiques.</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5417C</td><td>Microcentrifugeuse de paillasse.</td></tr><tr><td>Panneau de liège</td><td>N’importe quel détaillant spécialisé</td> <td>-</td> <td>Pour couper les cœurs dans la préparation du cryomontage des racines aortiques.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 560</td><td>Pour la cryosection en série des racines aortiques.</td></tr><tr><td>Eau déminéralisée</td> <td>-</td><td></td> <td>Pour le rinçage et la préparation des solutions.</td></tr><tr><td>Appareil photo numérique</td><td>Leica Microsystems</td><td>DC480</td><td>5,1 mégapixels CCD pour des images haute résolution des arcs aortiques et des coupes de racines aortiques.</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection (10 cm, droits)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Pour la dissection générale des organes.</td></tr><tr><td>Pince Dumont #5 (11 cm, droite)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500341</td><td>Pour la microdissection de l’aorte.</td></tr><tr><td>Éthanol 70 % (v/v)</td><td>VWR Chemicals</td><td>83801.290</td><td>Liquide et vapeur hautement inflammables, à stocker dans un endroit bien ventilé et à conserver au frais.</td></tr><tr><td>Éthanol absolu &ge ; 99,8 %</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.310</td><td>Liquide et vapeur hautement inflammables, à stocker dans un endroit bien ventilé et à conserver au frais.</td></tr><tr><td>Formaldéhyde 4 % stabilisé, tamponné (pH 7,0)</td><td>VWR Chemicals</td><td>9713.1000</td><td>Nocif par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion.</td></tr><tr><td></td><td>Logiciel d’analyse d’images</td> <td>ImageJ</td><td>NIH</td>.</tr><tr><td>Pince à iris (10 cm, incurvée, dentelée)</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915-G</td><td>Utilisée comme pince anatomique.</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>1096341011</td><td>Liquide inflammable, provoque une irritation oculaire grave et peut provoquer de la somnolence ou des étourdissements.</td></tr><tr><td>Gélatine glycérol de Kaiser</td><td>Merck</td><td>1092420100</td><td>Milieu de montage aqueux contenant du phénol. Suspecté de provoquer des anomalies génétiques.</td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM LB2</td><td>Pour l’analyse lors du sectionnement et la documentation des micrographies colorées en rouge à l’huile.</td></tr><tr><td>Mayer’s hematoxylin</td><td>Histolab</td><td>1820</td><td>Solution colorante non toxique sans hydrate de chloral, mais provoque une grave irritation des yeux.</td></tr><tr><td>Ciseaux Mayo (17 cm, droits)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501751-G</td><td>Pour la dissection générale.</td></tr><tr><td>Porte-aiguille Micro Castroviejo (9 cm, droit)</td><td>World Precision Instruments</td><td>503376</td><td>Pour l’épinglage des arcs aortiques.</td></tr><tr><td>Microtubes à centrifuger</td><td>Corning</td><td>MCT-175-C</td><td>Microtubes en polypropylène avec capuchon à bouton-pression.</td></tr><tr><td>Microlance 3 aiguilles, calibre 23</td><td>BD</td><td>300800</td><td>Pour le prélèvement sanguin.</td></tr><tr><td>Microlance 3 aiguilles, calibre 27</td><td>BD</td><td>302200</td><td>Pour la perfusion de souris.</td></tr><tr><td>Microvette 500 et micro ; L, K3 EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>20.1341.100</td><td>Pour le prélèvement sanguin.</td></tr><tr><td>Microvette 500 et micro ; L, Héparine de lithium</td><td>Sarstedt</td><td>20.1345.100</td><td>Pour le prélèvement sanguin.</td></tr><tr><td>Pinces à insectes minutien, 0,10 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Pour l’épinglage des arcs aortiques.</td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td>Non classé comme substance ou mélange dangereux.</td></tr><tr><td>Température de coupe optimale (OCT) cryomount</td><td>Histolab</td><td>45830</td><td>Pour l’enrobage de tissus.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td>Film de cire de paraffine utilisé pour créer des lits d’épinglage pour les arcs aortiques.</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri (100 mm x 20 mm)</td><td>Tout fournisseur de culture</td> <td>cellulaire-Proposé</td> <td>comme conteneur de stockage pour les aortes épinglées.</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td> <td>-</td><td></td> <td>Une solution stérile et sans RNase est nécessaire pour la perfusion des souris.</td></tr><tr><td>Papier filtre qualitatif (grade 1001)</td><td>Munktell</td><td>120006</td><td>Pour filtrer la solution de travail Oil Red O (rétention typique 2-3 &micro ; m).</td></tr><tr><td>Réactif de stabilisation de l’ARNlater ARN</td><td>Qiagen</td><td>76106</td><td>Pour la stabilisation de l’ARN dans les échantillons de tissus</td></tr><tr><td>RNaseZap Solution de décontamination de la RNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>Une solution de décontamination de surface qui détruit les RNases au contact.</td></tr><tr><td>Manche de scalpel #3 (13 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td>Pour couper les cœurs en préparation de la cryomonte des racines aortiques.</td></tr><tr><td>Lame de scalpel standard #10</td><td>World Precision Instruments</td><td>500239</td><td>Pour couper les cœurs dans la préparation à cryomonter les racines aortiques.</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ6</td><td>Pour la dissection et la documentation en face</td></tr><tr><td>Sudan IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4261</td><td>Non classé comme substance ou mélange dangereux.</td></tr><tr><td>Lames de microscope Superfrost Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>Pour collecter des sections de racines aortiques.</td></tr><tr><td>Pince à tissus (15 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501741-G</td><td>Pour la dissection générale.</td></tr><tr><td>Cryomoules Tissue-Tek (10 mm x 10 mm x 5 mm)</td><td>Sakura</td><td>4565</td><td>Pour l’enrobage des racines aortiques dans l’OCT.</td></tr><tr><td>Ciseaux Vannas (8 cm, droits)</td><td>World Precision Instruments</td><td>503378</td><td>Pour la microdissection de l’aorte.</td></tr></tbody></table>

quantification de l'athérosclérose chez les souris

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde. La cause sous-jacente dans la plupart des cas est l'athérosclérose, qui est en partie une maladie inflammatoire chronique. Des études expérimentales sur l'athérosclérose ont élucidé le rôle du cholestérol et de l'inflammation dans le processus de la maladie. Ceci a mené aux essais cliniques réussis avec des agents pharmaceutiques qui réduisent des manifestations cliniques de l'athérosclérose. Des expériences minutieuses et bien contrôlées dans des modèles murins de la maladie pourraient encore élucider la pathogénie de la maladie, qui n'est pas entièrement comprise. L'analyse normalisée des lésions est importante pour réduire la variabilité expérimentale et augmenter la reproductibilité. La taille de lésion de détermination dans la racine aortique, l'arc aortique, et l'artère brachiocéphalique sont des points de terminaison communs dans l'athérosclérose expérimentale. Ce protocole fournit une description technique pour l'évaluation de l'athérosclérose à tous ces emplacements dans une seule souris. Le protocole est particulièrement utile lorsque le matériel est limité, comme c'est souvent le cas lorsque des animaux génétiquement modifiés sont caractérisés.

Dans les modèles de souris de l'athérosclérose les lésions les plus importantes ont tendance à se développer dans la racine aortique et l'arc aortique. Ce protocole décrit la quantification de l'athérosclérose dans la racine aortique, l'arc aortique, et l'artère brachiocéphalique dans une souris simple. Les lésions mesurables dans l'aorte descendante thoracique et l'aorte abdominale sont seulement présentes dans les animaux présentant la maladie avancée. Dans ce protocole, ces parties ne sont pas analysées pour la charge athérosclérotique, mais enregistrées pour l'analyse ultérieure des niveaux d'ARNm ou d'autres analyses. Les sections sérielles des lésions athérosclérotiques dans la racine aortique sont habituellement affichées dans un graphique avec la taille de lésion sur l'axe de yet la distance au sinus aortique sur le x-axe28. Les vraies coupes transversales sont cruciales pour la quantification de la taille des lésions. Les sections obliques peuvent surestimer la taille des lésions et une inclinaison de seulement 20 degrés pourrait surestimer la surface de lésion absolue de 15 %29. Toutefois, le calcul de la fraction de lésion de la superficie totale du navire rend le résultat moins sensible aux différences d'angle possibles au cours de la section (figure4A). Une méthode statistique appropriée pour détecter les différences entre les groupes est habituellement une analyse régulière à deux voies de la variance (ANOVA). Les tests post-tests Bonferroni sont ensuite effectués pour détecter les différences à certains niveaux. La différence la moins significative de Fisher pourrait également être utilisée comme test de suivi à ANOVA. Il réduit la probabilité d'erreurs statistiques de type II, mais ne tient pas compte de comparaisons multiples. En outre, il pourrait être illustratif de calculer la zone sous la courbe ou la taille moyenne des lésions par souris et de présenter les données dans une parcelle de point pour visualiser davantage la variation individuelle au sein des groupes (Figure 4B).
L'huile rouge O est un colorant diazo rouge vif liposoluble, qui tache les lipides neutres. Les lipides polaires dans les membranes cellulaires ne sont pas tachés. La coloration rouge O à l'huile peut être effectuée sur des échantillons frais, congelés ou fixés en formaline, mais pas sur des échantillons incorporés à la paraffine en raison de l'élimination des lipides dans le processus de déparaffinisation requis. Une quantification de l'accumulation de lipides lésions pourrait être effectuée en délimitant la zone positive de l'huile rouge O de la surface totale de lésion (Figure 4C). L'hématoxylin produit une coloration bleue des noyaux cellulaires, qui est utile pour visualiser la morphologie de plaque. Les artères coronaires droites et gauches divergent habituellement de l'aorte autour de 250 m du sinus aortique27,qui coïncident souvent avec les tailles de lésion les plus importantes. Les sections transversales de cette région sont souvent affichées comme des résultats représentatifs (figure 4D).
<img alt="Analyse des lésions aortiques ; graphiques, diagrammes à barres, images histologiques ; taille de la lésion, résultat d’une coloration O rouge huile." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 : Lésions atherosclérotiques dans la racine aortique. (A) Vingt-huit semaines de chimères mâles de moelle ont alimenté le régime occidental pendant huit semaines ont été évaluées pour déterminer l'effet des cellules T Smad7-déficientes sur le développement d'athérosclérose. Ldlr expérimental-/- les chimères ont reçu la moelle osseuse Cd4-Cre -Smad7fl/fl et les contrôles ont reçu la moelle osseuse Cd4-CreetSmad7fl/MD. Le graphique montre la quantification de la zone de lésion athérosclérotique de huit sections consécutives, 100 - 800 m du sinus aortique affiché comme fraction de lésion de la surface totale du navire (Cd4-Cre-Smad7fl //Ldlr-/- n-6, Cd4-Cre-Smad7fl/fl/Ldlr-/- n ' 9, 2 voies ANOVA avec le post-test de Bonferroni, graphique montre moyenne 'SEM, accolades indiquent le niveau d'importance pour la comparaison de souche). (B) L'intrigue à points combinés et le graphique à barres montre la zone moyenne de lésion athérosclérotique des sections de racine aortique (Cd4-Cre-Smad7fl //Ldlr-/- n -6, Cd4-Cre-Smad7fl/fl/ Ldlr-/- n ' 9, Student's t-test) (C) Fraction of Oil Red O-stained area in the lesions (Cd4-Cre-Smad7fl//Ldlr-/- n ' 4, Cd4-Cre'Smad7fl/fl /Ldlr-/- n -6, Student's t-test, ns'non-significant) (B-C) Lespoints représentent des souris individuelles et les barres montrent la moyenne des micrographies représentatives montrant la coloration de l'huile rouge O (en rouge couleur) de lipides neutres dans la racine aortique 300 m de sinus aortique (grossissement 50x), barre d'échelle de 500 m. Ce chiffre a été modifié à partir de Gister et al.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Huile Red O pourrait être utilisé pour la coloration des aortes en face préparée, mais ce protocole utilise Soudan IV, un autre colorant diazo liposoluble pratique. Soudan IV visualise clairement les plaques athérosclérotiques d'une couleur orange-rouge en taclant les lipides, les triglycérides et les lipoprotéines. Enlever le fond sombre dans les images représentatives des arcs aortiques en face pourrait améliorer l'affichage visuel (Figure 5A). Habituellement, la taille des lésions est normalement répartie en groupes, ce qui permet des tests statistiques avec le testt-test de l'étudiant entre les groupes. Une parcelle de point qui montre à la fois les souris individuelles et la moyenne, qui est comparée entre les groupes, est une façon informative d'afficher les résultats (Figure 5B-C). Puisque la variation au sein des groupes est typiquement différente entre les endroits dans l'arbre vasculaire, des calculs séparés de puissance sont habituellement nécessaires. La variation inutile peut être évitée par la compétence de méthode et la normalisation de protocole. Il est important d'obtenir des résultats statistiquement significatifs, mais la pertinence biologique d'une différence observée doit toujours être prise en considération.
<img alt="Analyse des lésions de l’arc aortique : images des artères, comparaison des données de lésions dans les modèles HuBL et BT1xHuBL, graphiques." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figure 5 : Lésions atherosclérotiques dans l'arc aortique et l'artère brachiocéphalique. (A) Représentant en visage micrographies d'arcs aortiques avec des plaques chargées de lipides tachées de Soudan IV (en couleur orange) de souris de 20 semaines nourri régime occidental pendant dix semaines, visualisé ensemble. Barre d'échelle de 2 mm. Les souris ldlr-/- ( HuBL)ont été utilisées comme témoins et le groupe expérimental était composé de souris transgéniques TCR avec des lymphocytes T réactifs LDL (BT1) croisés à des souris HuBL. (B) Lésions atherosclérotiques dans l'arc aortique (HuBL n 10, BT1xHuBL n 12; L'étudiant t-test). (C) Lésions atherosclérotiques dans l'artère brachiocéphalique (HuBL n 8, BT1xHuBL n - 9, Student's t-test). (B-C) Les points représentent des souris individuelles, les barres montrent la moyenne de 'SEM. 'p '0,05. Ce chiffre a été modifié à partir de Gister et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Figure supplémentaire 1 : Organisation alternative de diapositives pour les sections sérielles de la racine aortique. Une organisation systématique simplifiée de diapositives pour la collecte des sections de la racine aortique. La collection permet la coloration oil Red O pour les lipides et immunohistochemistry ou la coloration immunofluorescence. Des diapositives dédiées pour la coloration rouge Picrosirius de collagène sont omises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/2019-JoVE-Figure-S1.eps">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Les modèles murines de l'athérosclérose sont des outils utiles pour étudier les voies pathogènes au niveau moléculaire, mais exigent une quantification normalisée du développement des lésions. Ce protocole décrit une méthode optimisée pour déterminer la taille de lésion dans les vaisseaux artériels principaux comprenant la racine aortique, l'arc aortique, et l'artère brachiocéphalique.

Quantification de l'athérosclérose chez les souris

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde. Les modèles muraux sont des outils utiles pour étudier cette maladie et notre protocole peut être utilisé pour quantifier l’athérosclérose chez la souris. En utilisant ce protocole, la taille de lésion peut être mesurée dans trois emplacements vasculaires.La racine aortique, l’arc aortique et l’artère brachiocéphale. La quantification de l’athérosclérose chez la souris peut être une tâche fastidieuse. Nous avons fourni des étapes détaillées qui, nous l’espérons, peuvent accélérer le processus.Certaines de ces étapes sont difficiles à décrire par écrit. Nous espérons que cette vidéo vous aidera à obtenir une analyse robuste de la taille des lésions athéroclérotiques. Après la récolte d’un cœur de souris selon les protocoles standard, placez le cœur sur un lit de liège, côté ventral vers le haut sous un microscope disséquant et utilisez une aiguille pour fixer le cœur au liège à travers l’apex.Tenant la base du coeur avec des forceps anatomiques, utilisez un scalpel tenu à un angle de 20 degrés caudally dans le plan sagittal, et 20 degrés cranially dans le plan transversal, pour couper les deux tiers apical du coeur. Intégrir la racine aortique et la base du cœur dans le composé optimal de température de coupe, ou OCT, et presser doucement le cœur avec les forceps pour remplir la racine aortique avec du composé et pour enlever les bulles d’air. Transférer le spécimen au fond d’un cryomold rempli d’OCT avec la racine aortique perpendiculaire à la surface inférieure et congeler le composé sur de la glace sèche.Rangez ensuite l’échantillon de tissu dans un sac de congélation à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit cryosection. Pour préparer un lit d’épinglant pour l’analyse en face, pliez un segment de film de cire de paraffine huit fois pour faire une surface plate de 25 par 25 mm et envelopper le ruban isolant électrique noir autour du film pour faire un fond foncé pour l’aorte. Placez une étiquette sur le côté arrière du lit d’épinglant et utilisez un crayon de plomb pour enregistrer le numéro d’identification de la souris.Transférer l’arc aortique dans le lit d’épinglant et ajouter une goutte de PBS au tissu. À l’aide d’un microscope stéréo, nettoyez l’aorte du tissu adipeux périadventitial restant et utilisez des ciseaux Vannas et des forceps Dumont pour éplucher doucement tout le tissu adipeux environnant sans manipuler ni endommager l’aorte. Ensuite, introduisez les ciseaux Vannas dans le lumen aortique pour exposer la surface intimale.Commencez à couper la courbure extérieure de l’arc ascendant dans la direction distale, en continuant à ouvrir les branches, y compris l’artère brachiocéphale et en épargnant la partie dorsale de la région thoracique descendante. Pour afficher la surface intimale, coupez la courbure inférieure et pliez l’aorte. À l’aide d’un porte-aiguilles Castroviejo micro, fixer l’arc ouvert vers le lit d’épinglant avec l’extrémité émoussée des broches d’insectes minuten sans étirer le spécimen, en pliant doucement les broches loin de l’échantillon que le tissu est maintenu en place.Rangez ensuite l’arc épinglé face cachée dans une boîte de Pétri de PBS à quatre degrés Celsius. Pour la coloration Soudan IV, rincer le spécimen pendant cinq minutes dans une boîte de Pétri de 70% d’éthanol avec l’arc orienté vers le bas, avant de transférer le spécimen dans un plat de Soudan IV solution de travail pendant sept minutes. À la fin de l’incubation, rincer l’échantillon à l’aide de deux lavages de trois minutes dans 80 % d’éthanol pour acher la surface intimale normale, suivi d’un rinçage final en PBS avant de retourner le tissu dans sa boîte pétri d’origine.Puis acquérir des micrographes sous un microscope stéréo connecté à un appareil photo numérique à un grossissement 10X, obtenir des images de l’arc épinglé immergé dans PBS, en utilisant de petits poids métalliques pour tenir le lit d’épinglant au fond de la boîte petri. Pour obtenir des cryosections de la racine aortique intégrée, réglez la température du cryostat à moins 20 degrés Celsius et l’épaisseur de la section à 10 micromètres. Monter le bloc OCT contenant la racine aortique sur le porte-spécimen avec le tissu ventriculaire orienté vers l’extérieur.Sécurisez le positionnement avec un oct supplémentaire si nécessaire. La racine aortique doit maintenant être positionnée perpendiculairement à la lame du couteau. Recueillir les sections de contrôle initiales contenant du tissu musculaire cardiaque sur des diapositives de microscope ordinaires, en vérifiant la progression à travers le tissu tous les 200 micromètres sous un microscope léger.Lorsque la première cuspide aortique apparaît, inclinez le spécimen vers le point zéro cuspide pour aligner le plan de section avec les deux autres cuspides et compter chaque section de 10 micromètres qui est coupée à partir du point zéro. Commencez à collecter des sections pour analyse à partir de 90 micromètres et à partir de la diapositive prévue, jusqu’à ce que 800 micromètres à partir du point zéro a été atteint. Le calcul de la fraction de lésion de la surface totale du vaisseau de la racine aortique rend les données moins sensibles aux différences d’angle possibles pendant la sectionnement.En outre, il pourrait être illustratif de calculer la zone sous la courbe ou la taille de lésion d’atheroto par souris et de présenter les données dans une parcelle de point pour visualiser davantage les variations individuelles au sein des groupes. L’accumulation de lipides lésionnels peut être quantifiée par la couleur seuil de l’huile rouge O zones positives de la zone de lésion totale. Les artères coronaires droites et gauches divergent habituellement de l’aorte autour de 250 micromètres du sinus aortique qui coïncide souvent avec les tailles de lésion les plus proéminentes.La suppression du fond sombre dans les images représentatives des arcs aortiques en face peut améliorer l’affichage visuel. La taille de lésion est typiquement normalement distribuée dans les groupes, permettant l’analyse statistique utilisant le t-test de l’étudiant entre les groupes. Nous vous recommandons de pratiquer avec du matériel d’essai jusqu’à ce que vous avez obtenu des compétences suffisantes pour le traitement de vos échantillons expérimentaux.Si la taille de lésion est différente entre les groupes, vous devriez déterminer le mécanisme, car une analyse de composition de lésion est habituellement la prochaine étape à poursuivre.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

L’analyse ex vivo des lésions artérielles à partir de modèles animaux de maladies cardiovasculaires repose classiquement sur des techniques histologiques et immunohistochimiques. Ceux-ci fournissent des mesures en 2 dimensions dans les lésions en 3 dimensions. Ce manuscrit décrit la génération de lésions artérielles pour une analyse quantitative en 3 dimensions à l’aide de la tomographie par projection optique.

Génération et quantification 3-Dimensional des lésions artérielles chez la souris utilisant la tomographie optique de projection

Nous décrivons des procédures pour quantifier et caractériser les lésions athéroscléreuses dans des modèles murins en utilisant une section de précision du sinus aortique et de l’aorte ascendante combinée à une analyse histochimique et immunohistochimique.

Analyse quantitative et caractérisation des lésions d&#39;athérosclérose dans le murin aortique Sinus

Cette vidéo montre deux modèles de l'intima développement de la plaque dans les artères de souris et met l'accent sur les différences dans l'hyperplasie myo-intimale et l'athérosclérose.

Induisant myointimale hyperplasie Versus athérosclérose chez la souris: An Introduction de deux modèles valides

Cette étude décrit une procédure invasive pour l’induction de l’athérosclérose accélérée chez les souris. En comparaison avec d’autres méthodes utilisant des dommages électriques ou cryo-induits, les dommages mécaniques-induits imitent la condition humaine de la restenose après thérapies de revascularisation et est idéale pour l’étude des mécanismes moléculaires impliqués.

Induction de l’athérosclérose accélérée chez les souris : le modèle « Wire-Injury »

Les auteurs décrivent un protocole visant à induire l’athérosclérose à la racine aortique de l’ApoE- / - souris nourries avec un régime athérogène, grâce à un rejet constant de l’aldostérone. Méthodes pour caractériser la composition de la plaque sont également décrites.

Induction de Plaques d’athérome grâce à l’Activation des récepteurs minéralocorticoïdes chez les souris déficientes en apolipoprotéine E

Nous vous proposons un protocole normalisé afin de caractériser la composition cellulaire des stades des lésions athéroscléreuses murines y compris des méthodes systématiques de dissection animale, incorporation de tissus, coupes, coloration et analyse des artères brachiocéphalique atheroprone muscle lisse cell lineage traçage souris.

Analyse quantitative de la Composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées de Muscle lisse Cell Lineage-Tracing souris

Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour analyser la charge athéroscléreuse chez la souris. Les chercheurs peuvent utiliser ce protocole pour comparer l’abondance, l’emplacement et la taille des lésions athérosclérotiques chez différents animaux.

Imagerie et analyse de lésions de l’aorte entière o-colorée à l’huile dans un modèle murin d’hyperlipidémie d’anévrisme

Ici, nous présentons des protocoles optimisés de nettoyage des tissus pour imager l’aorte murine en trois dimensions (3D). Nous décrivons des procédures de pointe pour l’immunomarquage, la clairance optique et l’imagerie dans le but de définir la proximité anatomique du système nerveux périphérique avec les plaques d’athérosclérose et l’adventice dans l’athérosclérose.

Imagerie tridimensionnelle des tissus de l’aorte dans l’athérosclérose

Ce protocole fournit une méthodologie complète pour l’analyse quantitative des plaques d’athérosclérose afin de faciliter des recherches plus approfondies sur les mécanismes et la progression de l’athérosclérose.

Isolement et analyse de lésions de l’arc aortique et de la racine dans un modèle murin athérosclérotique

γ-herpèsvirus (γ-HVS) établir long de la vie la persistance dans leur hôte. L'infection de souris avec γ-HV68 offre une tractable...

Mesure de γHV68 infection chez les souris

Apprenez à quantifier l'athérosclérose chez la souris en mesurant les lésions dans la racine aortique, l'arc aortique et l'artère brachio-céphalique. Cette méthode standardisée améliore la précision et la reproductibilité des analyses.

Quantification de l'athérosclérose chez les souris

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