Dans Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Présentés ici sont des protocoles pour la création de petits vésicules unilamellar à base de peptides capables de croître. Pour faciliter la production de vesiculo du peptide membranaire, ces vésicules sont équipées d'un système de transcription-traduction et du plasmide codant peptide.

Dans notre protocole, nous utilisons la réhydratation du film à partir de petites perles de verre pour former des compartiments de réaction faits de peptides. Dans les expériences, nous profitons de la simplicité et de la robustesse du protocole. Le principal avantage de cette technique est la capacité d’incorporer même des échantillons sensibles, tels que l’extrait de cellules brutes utilisé.

Le contact avec les solvants organiques affectera considérablement l’échantillon. Pour commencer cette procédure, utilisez un concentrateur de vide centrifuge pour concentrer la solution PEL à 1,1 millimolaire. Mélanger 200 microlitres de cette solution concentrée avec 1 250 microlitres d’un mélange de chloroforme et de méthanol de deux à un.

Vortex la solution pour bien mélanger. Ensuite, ajoutez 1,5 gramme de perles de verre sphériques à un flacon de fond rond de dix millilitres. Ajouter le PEL et la solution de méthanol chloroforme au flacon du fond rond et agiter délicatement pour mélanger.

Connectez le flacon à un évaporateur rotatif. Réglez la vitesse à 150 RPM et réglez la pression à 20 000 pascals pendant environ quatre minutes, jusqu’à ce que le liquide soit évaporé à température ambiante. Il est important d’être prudent lors de l’utilisation de l’évaporateur rotatif en raison d’un retard d’ébullition possible.

Après cela, envelopper lâchement du papier d’aluminium autour de l’ouverture de la fiole du fond rond pour éviter la perte de perles de verre et placer le flacon dans un dessiccateur pendant au moins une heure, pour s’assurer que le chloroforme et le méthanol restants sont évaporés. Pour une seule expérience, mélanger 100 milligrammes de perles de verre recouvertes de peptide avec 60 microlitres d’une solution de gonflement. Incuber cet échantillon à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Utilisez une centrifugeuse de table pour centrifuger rapidement les échantillons et sédimenter les perles de verre. Ensuite, utilisez une pipette pour recueillir le supernatant, qui contient les vésicules. Tout d’abord, mélanger 100 microlitres de l’ADN plasmide pré-purifié avec 100 microlitres d’alcool Roti-Phénol, chloroforme ou isoamyle dans un tube de micro centrifugeuse pour permettre une meilleure séparation de phase.

Inversez doucement le tube jusqu’à six fois et centrifugez à 16 000 fois g et température ambiante pendant cinq minutes. Ajouter ensuite 200 microlitres de chloroforme à la phase supérieure et inverser le tube jusqu’à six fois. Centrifugez l’échantillon à 16 000 fois g et température ambiante pendant cinq minutes.

Après cela, pipette le supernatant à un tube séparé et ajouter 10 microlitres de trois acétate de sodium molaire pour les précipitations d’éthanol. Ajouter un millilitre d’éthanol froid à 80 degrés Celsius et conserver l’échantillon à 80 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Décanter le supernatant et ajouter un millilitre de froid 70% d’éthanol à 20 degrés Celsius. Centrifugeuse à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le liquide par pipetting, en prenant soin de ne pas déranger la pastille d’ADN.

Conserver l’échantillon à température ambiante pendant environ 15 minutes pour évaporer le reste de l’éthanol. Après cela, ajouter de l’eau ultra pure à l’échantillon pour ajuster la concentration de l’échantillon à environ 300 nanomolaires, qui est mesurée par absorption à 260 nanomètres. Pour préparer la réaction transcription-traduction, suivez l’extraction des cellules brutes préparées et le tampon de réaction sur la glace.

Pour un mélange de réaction de 60 microlitres, ajouter l’ADN plasmatique à 37,5 microlitres du tampon de réaction, ajouter 28,7 microlitres d’extrait de cellules brutes et remplir d’eau ultra pure à un volume final de 58,8 microlitres. Juste avant le début de la réaction, ajouter 1,2 microlitres de la solution de polymése T7RNA, et pipette de haut en bas pour mélanger. Incuber l’échantillon et une solution de gonflement à 29 degrés Celsius pour la durée de l’expérience, qui est généralement de quatre à huit heures.

Les images de microscopie électronique de transmission des vésicules montrent que diverses solutions de gonflement, telles que TX/TL ou même seulement PBS peuvent être employées pour former des vésicules. Pour les deux solutions, la détermination de la taille est un pas en avant. La diffusion dynamique de la lumière montre que les vésicules préparées sans la méthode des perles de verre ont un diamètre de 134 nanomètres, avec une polydispersité de 25%Lorsque des perles de verre sont utilisées, le diamètre se traduit par 168 nanomètres, avec une polydispersité de 21%L’intensité de fluorescence de deux protéines fluorescentes, qui sont exprimées à l’intérieur des vésicules PEL, sont ensuite mesurées à l’aide d’un lecteur de plaque de fluorescence.

Il est important de noter qu’après la formation de vésicules, le contenu des vésicules et la solution externe sont les mêmes, donc, l’antibiotique Kanamycine est ajouté à la solution extérieure pour supprimer l’expression des protéines. Comme contrôle, la kanamycine est également ajoutée à la solution de gonflement, auquel cas l’expression de protéine à l’intérieur de la vésicule est supprimée. Cela indique que kanamycine ne diffuse pas à travers la membrane, et supprime l’expression interne en permanence, tout le temps.

L’analyse fret est ensuite effectuée pour démontrer l’incorporation du PEL dans la membrane. Lors de l’expression des PEL membranaires, des peptides supplémentaires s’incorporent dans la membrane, ce qui augmente la distance moyenne entre les paires fret, et qui entraîne une augmentation du signal donneur. La technique présentée peut être utilisée pour produire des récipients de réaction simples ou pour créer des cellules artificielles avec des membranes à base de peptide.

Le contenu à l’intérieur peut être choisi au besoin. En utilisant ces vésicules peptidiques, nous pouvons maintenant nous attendre à des réactions de synthèse plus complexes en leur sein.