Name: Dans Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Découvrez la synthèse de vésicules unilamellaires peptidiques par réhydratation de films sur billes de verre. Cette méthode robuste permet d'incorporer des échantillons sensibles comme des extraits cellulaires bruts pour la biologie membranaire.

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Nous remercions le soutien financier par le biais de la DFG TRR 235 (Emergence of Life, projet P15), du Conseil européen de la recherche (accord de subvention no 694410 AEDNA) et de la TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (projet no 9.05) . Nous remercions E. Falgenhauer pour son aide dans la préparation des échantillons. Nous remercions A. Dupin et M. Schwarz-Schilling pour leur aide dans le système TX-TL et pour leurs discussions utiles. Nous remercions N. B. Holland pour les discussions utiles.

1. Expression de polypeptides de l'élastine
<ol><li>Jour 1: Préparation d'une culture de démarrage et fournitures pour l'expression peptide
	<ol>
<li>Préparer et autoclaveexpression des flacons de culture d'expression (4 x 2,5 L) et 3 L de milieu LB. Pour 1 L de lb moyen, ajouter 25 g de poudre LB à 1 L d'eau ultrapure.</li>
		<li>Préparer une culture de démarrage avec 100 ml de milieu LB, 50 l de solution de chloramphenicol filtrée stérile (0,22 m) (25 mg/mL en EtOH) et 50 l de solution de carbenicilline filtrée stérile (0,22 m) (100 mg/mL dans 50 % et 50 % d'eau ultrapure).</li>
		<li>Ajouter une petite strie à partir d'un stock bactérien préfabriqué contenant la souche E. coli BL21(DE3)pLysS avec le vecteur d'expression pET20b (MD) codant la séquence de polypeptide MGHGVGVP((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP)4(GVGVP))3 (GFGVP)4GWP (abrégé en EF) à une culture de démarrage pré-chauffée de 100 ml et incuber à 37 oC pendant 16 h avec 250 tr/min dans un incubateur secouant (les souches et vecteursE. coli sont disponibles sur demande).</li>
		<li>Préchauffez les flacons de culture d'expression et les supports LB à 37 oC pendant la nuit afin qu'ils soient préparés pour le lendemain.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 2 : Expression protéinée
	<ol>
<li>Ajouter 750 ml de lb-moyen à chaque flacon de culture d'expression, 375 l de bouillon de chloramphenicol filtré stérile (0,22 m) (25 mg/mL dans EtOH), et 375 l de stock de carbenicilline filtré e (0,22 m) (100 mg/mL dans 50 % et 50 % d'eau ultrapure).</li>
		<li>Après l'agitation pour distribuer les antibiotiques, prendre 2 mL du support comme échantillon de référence pour la mesure de densité optique à 600 nm (OD600).</li>
		<li>Ajouter 7,5 ml de la culture de départ à la flacon d'expression et incuber pendant 1 h à 37 oC avec 250 tr/min.</li>
		<li>Après cette étape, l'OD600 de chaque flacon sera vérifié toutes les 20 min.</li>
		<li>Lorsque la densité optique atteint environ 0,8 réduire la température à 16 oC et induire l'expression peptide en ajoutant 750 L de 1 M stérile-filtré - isopropyl thiogalactoside (IPTG) dans l'eau ultrapure dans chaque flacon d'expression.</li>
		<li>Incuber le flacon d'expression avec les bactéries induites à 16 oC pendant 16 h avec 250 tr/min.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 3 : Extraction du polypeptide exprimé
	<ol>
<li>Pré-peser le flacon de centrifugation pour permettre la détermination de la masse de la granule cellulaire après la récolte.</li>
		<li>Récoltez toutes les bactéries des flacons d'expression par centrifugation pendant 20 min à l'aide d'une centrifugeuse pré-réfrigérée à 4 000 x g et 4 oC.</li>
		<li>Verser le supernatant et éponger les bouteilles de centrifugeuse sur un essuie-tout stérile.</li>
		<li>Peser les flacons de centrifugation et calculer la masse de granules cellulaires.</li>
		<li>Resuspendre les cellules, qui sont granulées à partir de 750 ml de culture cellulaire d'origine, dans 15 ml de saline tamponnée de phosphate (PBS, pH 7,4) par pipetting, et centrifugeuse à 4 000 x g pendant 20 min à 4 oC. Verser le supernatant et éponger les bouteilles de centrifugeuse sur un essuie-tout stérile.</li>
		<li>Resuspendre la pastille cellulaire pour l'étape de lyse dans 2 ml de tampon par 1 gramme de granule cellulaire à l'aide de PBS (pH 7,4) complété avec du lysozyme (1 mg/mL), 1 mM de phénylmethylsulfonyle fluorure (PMSF), 1 mM de benzamidine, et 0,5 U de DNase I.</li>
		<li>Sonicate les cellules pour une lyse supplémentaire sur la glace avec un sonicator à 8 W pour 9 min avec une alternance de 10 s sonication et 20 étapes de pause, suivie d'une pause de 9 minutes au cours de laquelle l'échantillon doit être refroidi sur la glace. Répétez l'étape de sonication de 9 min une fois de plus.</li>
		<li>Ajouter 2 ml de 10 % (w/v) de polyéthylèneimine (PEI) par 1 L de culture cellulaire originale pour les précipitations d'acide nucléique.</li>
		<li>Distribuer l'échantillon dans des tubes centrifugeuses de 2 ml et couver à 60 oC pendant 10 min, puis une incubation de 10 min à 4 oC.</li>
		<li>Centrifuger la solution à 16 000 x g pendant 10 min à 4 oC et recueillir le supernatant contenant le PEL.</li>
	</ol></li>
	<li>Purification des protéines par cycle de température inverse :
	<ol>
<li>Ajustez le supernatant à un pH de 2 pour passer la partie hydrophile du peptide à l'agrégation hydrophobe et induire. Pour ajuster le pH, l'acide phosphorique et l'hydroxyde de sodium sont utilisés. Les rayures de pH sont suffisantes pour déterminer le niveau de pH.</li>
		<li>Pour améliorer le rendement de la purification de l'échantillon, chauffer l'échantillon à 60 oC et ajouter du chlorure de sodium jusqu'à 2 M.</li>
		<li>Par la suite, centrifuger l'échantillon à 16 000 x g pendant 10 min à température ambiante (RT).</li>
		<li>Jetez le supernatant et re-dissoudre le granule dans PBS (mais seulement la moitié du volume initial est utilisé par rapport à l'étape précédente).</li>
		<li>Ajuster le pH à 7 avec de l'acide phosphorique et de l'hydroxyde de sodium. Les rayures de pH sont suffisamment précises pour déterminer le pH.</li>
		<li>Centrifuger l'échantillon par la suite à 16 000 x g pendant 10 min à 4 oC.</li>
		<li>Recueillir le supernatant et répéter les étapes 1.4.1 -1.4.6 jusqu'à 3x total, sauf que dans la dernière répétition de l'étape 1.4.4, seule l'eau est ajoutée au lieu de PBS.</li>
		<li>Mesurer la concentration des peptides à l'eau à l'eau avec un spectromètre d'absorption. Utilisez un coefficient d'extinction de 5500/M/cm à 280 nm.</li>
		<li>Ajuster la concentration du PEL à 700 M.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Production de vésicule utilisant la méthode des perles de verre
<ol><li>Concentrez la solution ELP à 1,1 mM à l'aide d'un concentrateur à vide centrifuge.</li>
	<li>Mélanger 200 l de la solution D'ELP concentrée avec 1 250 l d'un mélange chloroforme/méthanol de 2:1 suivi d'un vortex.</li>
	<li>Ajouter 1,5 g de perles de verre sphériques (212 à 300 m) sur un flacon rond de 10 ml.</li>
	<li>Ajouter la solution contenant le PEL et le mélange chloroforme/méthanol au flacon de fond rond et mélanger par une secousse douce.</li>
	<li>Connectez le flacon à un évaporateur rotatif. Ajuster la vitesse à 150 tr/min et réguler la pression à -0,2 x 105 Pa (-200 mbar) pendant environ 4 min jusqu'à ce que le liquide soit évaporé à température ambiante.</li>
	<li>Placer le flacon de fond rond dans un dessiccateur pendant au moins 1 h pour s'assurer que le chloroforme et le méthanol restants sont évaporés. Pour éviter la perte des perles de verre, le papier d'aluminium lâchement attaché devrait être enroulé autour de l'ouverture ronde de flacon de fond.</li>
	<li>Pour une seule expérience, mélanger 100 mg de perles de verre recouvertes de peptide avec 60 L de la solution de gonflement, comme le PBS. Incuber cet échantillon à 25 oC pendant 5 min.</li>
	<li>Centrifugez l'échantillon rapidement à l'eau avec une centrifugeuse de table pour sédimenter les perles de verre.</li>
	<li>Utilisez une pipette pour recueillir le supernatant qui contient les vésicules.</li>
</ol>3. Transcription de l'ARN Aptamer dBroccoli à l'intérieur des vésicules
<ol><li>Nettoyez le banc de laboratoire avec des lingettes contenant une solution de décontamination RNase pour créer un environnement de travail sans RNase.</li>
	<li>Mélanger l'ADNs (5 M) comprenant la séquence promotrice et dBroccoli T7 (GAGACGGTCGGCCATCTGAGACGGTCGGGTCACGATATTCGTTTGTTGTTGTCGTCGAGTAGGTGTGTGCTCAGATGTCGAGGagTAGTAGGTGTGTGTGGGCTC Tampon de réaction RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT), et 2 mM spermidine], pour préparer le modèle d'ADN pour la réaction de transcription.</li>
	<li>Incuber la solution à 90 oC pendant 5 min, suivie d'une baisse lente de la température à 20 oC pendant 30 min.</li>
	<li>Préparer une solution de 1 mM (5Z)-5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2,3-dimethyl-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one (DFHBI) en dissolvant 1,26 mg de DFHBI en 5 mL de DMSO.</li>
	<li>Préparer la réaction de transcription en mélangeant le tampon de réaction RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (TNT), et 2 mM spermidine] avec 125 mM KCl, 15 mM MgCl2, 4 mM rNTP, 10 M DFHBI, 200 nM DNA template, 0.5 U/L RNase murine inhibiteur, et l'eau.</li>
	<li>Juste avant le début de la réaction, ajouter 4 polymérases T7 U/L T7.</li>
	<li>Utilisez ce mélange de réaction comme solution de gonflement à l'étape 2.7 et incubez à 37 oC pendant la durée de l'expérience, qui est généralement de 1 h.</li>
</ol>4. Transcription-traduction (TX-TL) Réaction
REMARQUE: Pour la réaction de transcription-traduction, un extrait brut de cellules est exigé aussi bien que le tampon de réaction et l'ADN. L'extrait de cellules brutes est préparé comme décrit dans Sun et al.18. Pour une réaction TX-TL, utilisez ce qui suit : 33 % (v/v) de l'extrait brut d'E. coli, 42 % (v/v) tampon de réaction et 25 % (v/v) adn purifié phénol-chloroforme plus additifs. Les concentrations finales sont d'environ 9 mg/mL de protéines, 50 mM HEPES (pH 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzyme A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 68 mM d'acide folinique, 1 mM sM , 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2 % PEG-8000, 13,3 mM maltose, 1 U de T7 RNA polymérase, et 50 nM d'ADN plasmide dans l'eau ultrapure.
<ol><li>
Purification phénol-chloroforme du modèle d'ADN
	<ol>
<li>Préparer six cultures de nuit avec 5 ml de lb moyen et 5 l de solution de carbenicilline filtrée stérile (0,22 m) (100 mg/mL dans 50 % d'EtOH et 50 % d'eau ultrapure).</li>
		<li>Ajoutez une petite strie à partir d'un stock bactérien préfabriqué contenant du DH5 E. coli avec le vecteur d'expression pET20b(MD) à chaque culture de nuit préréchauffée de 5 ml et incubez à 37 oC pendant 16 h avec 250 tr/min. Selon le peptide (EF) ou la protéine (YPet ou mVenus) qui doit être exprimé, un plasmide d'encodage spécifique est utilisé.</li>
		<li>Extraire le plasmide avec un kit de mini-préparation tel que décrit dans le manuel de l'utilisateur ou en suivant le protocole fourni par Zhang et al.24.</li>
		<li>Préparer 100 L de l'ADN plasmide prépurifié (la concentration peut varier de 200 à 600 ng/L) et mélanger avec 100 OL de Roti-phenol/chloroform/isoamyl alcohol (pH - 7,5 à 8,0) dans un tube microcentrifugeur pour permettre une meilleure séparation de phase.</li>
		<li>Inverser délicatement le tube jusqu'à 6x et la centrifugeuse pendant 5 min à 16 000 x g à RT.</li>
		<li>Ajouter 200 l de chloroforme à la phase supérieure du tube et inverser le tube jusqu'à 6x.</li>
		<li>Centrifugelifuger l'échantillon à 16 000 x g pendant 5 min à RT.</li>
		<li>Pipet le supernatant à un tube séparé et ajouter 10 L de 3 M d'acétate de sodium pour les précipitations d'éthanol.</li>
		<li>Ajouter 1 ml d'éthanol froid de -80 oC et conserver l'échantillon à -80 oC pendant 1 h.</li>
		<li>Centrifuger l'échantillon à 16 000 x g pendant 15 min à 4 oC.</li>
		<li>Décant le supernatant et ajouter 1 ml d'éthanol froid de -20 oC 70 % (v/v).</li>
		<li>Centrifugeuse à 16 000 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
		<li>Retirer le liquide par pipetage. Veillez à ne pas déranger la pastille d'ADN.</li>
		<li>Conservez l'échantillon à RT pendant environ 15 minutes pour évaporer le reste de l'éthanol.</li>
		<li>Ajouter de l'eau ultrapure à l'échantillon pour ajuster la concentration de l'échantillon à environ 300 nM, qui est mesurée par absorption à 260 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de la réaction TX-TL
	<ol>
<li>Décongeler l'extrait de cellules brutes préparé et le tampon de réaction sur la glace.</li>
		<li>Pour un mélange de réaction de 60 l, ajouter l'ADN plasmide (phénol-chloroforme purifié) à 37,5 l du tampon de réaction [50 mM HEPES (pH 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzyme A, 0,33 mM NAD , 0,75 mM de cAMP, 68 mM d'acide folinique, 1 mm de spermidine, 30 mM de PEP, 1 mM de TNT, 2 % de PEG-8000 et 13,3 mM de maltose), suivi de l'ajout de 28,7 l d'extrait de cellules brutes. Remplir à un volume final avec de l'eau ultrapure à 58,8 L.</li>
		<li>Juste avant le début de la réaction, ajouter 1,2 l de la solution de polymérase à ARN T7 et mélanger l'échantillon en tirant de haut en bas.</li>
		<li>Utilisez ce mélange de réaction comme solution de gonflement à l'étape 2.7 et incubez à 29 oC pendant toute la durée de l'expérience, qui est généralement de 4 à 8 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Conjugaison de polypeptides de forme d'élastine avec des fluorophores via Copper Catalyzed Azide-alkyne Huisgen Cycloaddition
<ol><li>Préparer une solution de 20 mM nhs-azide linker (azidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester) dans DMSO.</li>
	<li>Mélanger 250 oL de la solution ELP (600 M) avec PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L Na2HPO4, 0,27 g/LK 2HPO4, pH -7,2) et NHS-azide (1,2 mM) et incuber pendant 12 h à RT.</li>
	<li>Chargez l'échantillon dans une cassette de dialyse de 10 kDa et conservez-le à 4 oC pendant 12 h dans 1 L d'eau ultrapure pour enlever les sels et les résidus de NHS-azide.</li>
	<li>Mélanger le PEL activé (500 M) avec le colorant conjugué à l'alkyne (500 M), le Cy5-alkyne ou le Cy3-alkyne.</li>
	<li>Mélanger cet échantillon avec 1 mM TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine), 10 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochlorure) et 10 mM CuSO4 et incuber à 4 oC pendant 12 h.</li>
	<li>Chargez l'échantillon dans une cassette de dialyse de 10 kDa et conservez-le à 4 oC pendant 12 h dans 1 L d'eau ultrapure, pour enlever les sels et les colorants résiduels conjugués à l'alkyne.</li>
	<li>Ces PEL modifiés par colorant sont utilisés dans un mélange 1:1 des PEL étiquetés Cy3 et des PEL étiquetés Cy5 analogues aux peptides dans la deuxième partie.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li>
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<li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li>
<li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0%3A+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li>
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<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).</li>
<li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+light+scattering%3A+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

La réhydratation du film est une procédure courante pour la création de petites vésicules unilamellar. La principale source de défaillance est la mauvaise manipulation des matériaux utilisés dans la procédure.

Initialement, les PEL sont produits par des cellules E. coli. Le rendement après la purification du PEL peut varier considérablement en fonction de la prudence avec soin du protocole au cours de ses étapes cruci...

La création de systèmes cellulaires vivants synthétiques est généralement approchée à partir de deux directions différentes. Dans la méthode descendante, le génome d'une bactérie est réduit à ses composants essentiels, conduisant finalement à une cellule minimale. Dans l'approche ascendante, les cellules artificielles sont assemblées de novo à partir de composants moléculaires ou de sous-systèmes cellulaires, qui doivent être intégrés fonctionnellement dans un système cellulaire cohérent.
Dans l'approche de novo, la compartimentation des composants biochimiques nécessaires est généralement réalisée à l'aide de membranes faites de phospholipides ou d'acides gras1,2,3,4. C'est parce que les membranes cellulaires "modernes" se composent principalement de phospholipides, tandis que les acides gras sont considérés comme des candidats plausibles des enceintes de membrane prébiotique5,6. Pour la formation de nouvelles membranes ou pour faciliter la croissance des membranes, les blocs de construction amphiphiles doivent être fournis à partir de l'extérieur7 ou idéalement par la production dans un compartiment membranaire en utilisant les processus anabolisants correspondants4 ,8.
Tandis que la synthèse de lipide est un processus métabolique relativement complexe, les peptides peuvent être produits tout à fait facilement utilisant des réactions d'expression de gène cell-libres9,10. Par conséquent, les membranes peptidiques formées par les peptides amphiphiles représentent une alternative intéressante aux membranes lipidiques comme enclos pour les imitations de cellules artificielles qui sont capables de se développer11.
Les copolymères de di-bloc d'élastine amphiphiles (PEL) sont une classe attrayante de peptides, qui peuvent servir de bloc de construction pour de telles membranes12. Le motif de base de séquence d'acide aminé des PEL est (GaGVP)n, où "a" peut être n'importe quel acide aminé excepté la proline et « n » est le nombre de répétitions de motif13,14,15,16,17 . Les PEL ont été créés avec un bloc hydrophobe contenant principalement de la phénylalanine pour un bloc hydrophile et principalement composé d'acide glutamique11. Selon les paramètres d'une solution, tels que le pH et la concentration de sel, les PEL présentent une transition de température dite inverse à la température Tt, où les peptides subissent une transition de phase entièrement réversible d'un hydrophile à l'hydrophobe état. La synthèse des peptides peut être facilement mis en œuvre à l'intérieur des vésicules à l'aide de l'extrait de cellules bactériennes "TX-TL"11,18,19,20,21, qui fournit tous les composants nécessaires pour les réactions couplées de transcription et de traduction.
Le système TX-TL a été encapsulé ensemble, avec le modèle d'ADN codant les PEL en vésicules ELP en utilisant la déshydratation-réhydratation des perles de verre comme un soutien solide. La formation de vésicules se produit par la réhydratation des peptides séchés de la surface de perle11. D'autres méthodes22 pour la formation de vésicules peuvent être utilisées, qui peuvent potentiellement montrer une polydispersity plus faible et de plus grandes tailles de vésicule (par exemple, électro-formation, transfert de phase d'émulsion, ou méthodes microfluidiques). Pour tester la viabilité de la méthode d'encapsulation, la transcription de l'aptamer fluorogénique dBroccoli23 peut alternativement être utilisée11, ce qui est moins complexe que l'expression génique avec le système TX-TL.
En raison de l'expression des blocs de construction de membrane dans vesiculo et de leur incorporation ultérieure dans la membrane, les vésicules commencent à se développer11. L'incorporation de membrane des PEL peut être démontrée par un analyse FRET. À cette fin, les PEL utilisés pour la formation de la population initiale de vésicules sont conjugués avec des colorants fluorescents en parts égales constituant une paire FRET. Lors de l'expression des PEL non étiquetés en vesiculo et de leur incorporation dans la membrane, les PEL étiquetés dans la membrane sont dilués et, par conséquent, le signal FRET diminuede 11. Comme méthode polyvalente et commune pour la conjugaison, le cuivre catalysé azide-alkyne cycloaddition est utilisé. Avec l'utilisation d'un ligand stabilisateur tel que tris (benzyltriazolylmethyl)-amine, la réaction peut être effectuée dans une solution aqueuse à un pH physiologique sans l'hydrolyse des réactifs11, ce qui est approprié pour les réactions de conjugaison peptides.
Le protocole suivant présente une description détaillée de la préparation pour la croissance des peptidosomes à base de PEL. L'expression des peptides et de la formation de vésicule utilisant la méthode de perles de verre sont décrites. En outre, il est décrit comment mettre en œuvre la transcription de l'aptamer fluorogénique dBroccoli et la réaction de transcription-traduction pour l'expression de protéine à l'intérieur des vésicules d'ELP. Enfin, à condition est une procédure pour la conjugaison des PEL avec des fluorophores, qui peut être utilisé pour prouver la croissance de la vésicule par un test FRET11.

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals</td><td>3012-032</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td><td>VWR</td><td>733-2478</td><td></td></tr><tr><td>alkiné Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777331</td><td></td></tr><tr><td>alkine-conjugué Cy5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777358</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>Carl Roth</td><td>CN38.2</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli souche</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline</td><td>Carl Roth</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Carl Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Carl Roth</td><td>4432.1</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Carl Roth</td><td>P024.1</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI</td><td>Lucerna Technologies</td><td>410</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Acide folinique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>Perles de verre, lavées à l’acide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (&beta ;-isopropyl thiogalactoside )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>P017.1</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Carl Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Carl Roth</td><td>82.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de chromatographie Micro Bio-Spin</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>NHS-azide linker (ester d’oxysuccinimide d’acide y-azidobutyrique)</td><td>Baseclick</td><td>BCL-033-5</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Carl Roth</td><td>263.2</td><td></td></tr><tr><td>Bandes de pH</td><td>Carl Roth</td><td>549.2</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthylsulfonyle</td><td>Carl Roth</td><td>6367.2</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>VWR</td><td>76180-684</td><td></td></tr><tr><td>Acide</td> <td>phosphoriqueSigma-Aldrich</td><td>W290017</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylèneimine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique</td><td>solution Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de réaction RNAPol</td><td>NEB</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNase murine</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Lingettes RNaseZap</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9788</td><td></td></tr><tr><td>rNTP</td><td>NEB</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Phenol/Chloroforme/Alcool isoamylique</td><td>Carlroth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>RTS Échantillonneur d’acides aminés</td><td>5 Cassettes de</td><td></td> dialyse Prime 2401530 <td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Carl Roth</td><td>8655.1</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Filtré stérilement (0.22 &micro ; Filtre m)</td><td>Carl Roth</td><td>XH76.1</td><td></td></tr><tr><td>T7 polymérase</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>TBTA (tris(benzyltriazolylméthyl)amine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)-phospine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>ARNt (issu d’E. coli)</td><td>Roche Applied Science</td><td>MRE600</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td></td></tr></tbody></table>

dans vesiculo synthesis of peptide membrane precursors for autonomous vesicle growth

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

La compartimentation des réactions biochimiques est un aspect central des cellules synthétiques. À cette fin, les compartiments de réaction à base de peptides constituent une alternative attrayante aux liposomes ou aux vésicules à base d'acides gras. Extérieurement ou à l'intérieur des vésicules, les peptides peuvent être facilement exprimés et simplifier la synthèse des précurseurs de la membrane. Fourni ici est un protocole pour la création de vésicules avec des diamètres de 200 nm à base de l'élastine amphiphile-comme polypeptides (ELP) en utilisant la déshydratation-réhydratation à partir de perles de verre. Sont également présentés des protocoles pour l'expression et la purification bactériennes du PEL par le biais du cycle de température inverse, ainsi que leur fonctionnalisation covalente avec des colorants fluorescents. En outre, ce rapport décrit un protocole pour permettre la transcription du dbroccoli dBroccoli d'aptamer d'ARN à l'intérieur des vésicules d'ELP comme exemple moins complexe pour une réaction biochimique. Enfin, un protocole est fourni, qui permet dans l'expression vesiculo des protéines fluorescentes et le peptide de membrane, tandis que la synthèse de ce dernier entraîne la croissance vésiculeuse.

Production de vésicules La figure 1 montre des images de microscopie électronique de transmission (TEM) de vésicules préparées avec différentes solutions de gonflement et la méthode des perles de verre (voir aussi Vogele et al.11 ). Pour l'échantillon de la figure 1A, seul le PBS a été utilisé comme solution d'enflure pour prouver la formation de vésicules et déterminer leur taille. Lorsque TX-TL a été utilisé comme so...

Présentés ici sont des protocoles pour la création de petits vésicules unilamellar à base de peptides capables de croître. Pour faciliter la production de vesiculo du peptide membranaire, ces vésicules sont équipées d'un système de transcription-traduction et du plasmide codant peptide.

Dans Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Dans notre protocole, nous utilisons la réhydratation du film à partir de petites perles de verre pour former des compartiments de réaction faits de peptides. Dans les expériences, nous profitons de la simplicité et de la robustesse du protocole. Le principal avantage de cette technique est la capacité d’incorporer même des échantillons sensibles, tels que l’extrait de cellules brutes utilisé.Le contact avec les solvants organiques affectera considérablement l’échantillon. Pour commencer cette procédure, utilisez un concentrateur de vide centrifuge pour concentrer la solution PEL à 1,1 millimolaire. Mélanger 200 microlitres de cette solution concentrée avec 1 250 microlitres d’un mélange de chloroforme et de méthanol de deux à un.Vortex la solution pour bien mélanger. Ensuite, ajoutez 1,5 gramme de perles de verre sphériques à un flacon de fond rond de dix millilitres. Ajouter le PEL et la solution de méthanol chloroforme au flacon du fond rond et agiter délicatement pour mélanger.Connectez le flacon à un évaporateur rotatif. Réglez la vitesse à 150 RPM et réglez la pression à 20 000 pascals pendant environ quatre minutes, jusqu’à ce que le liquide soit évaporé à température ambiante. Il est important d’être prudent lors de l’utilisation de l’évaporateur rotatif en raison d’un retard d’ébullition possible.Après cela, envelopper lâchement du papier d’aluminium autour de l’ouverture de la fiole du fond rond pour éviter la perte de perles de verre et placer le flacon dans un dessiccateur pendant au moins une heure, pour s’assurer que le chloroforme et le méthanol restants sont évaporés. Pour une seule expérience, mélanger 100 milligrammes de perles de verre recouvertes de peptide avec 60 microlitres d’une solution de gonflement. Incuber cet échantillon à 25 degrés Celsius pendant cinq minutes.Utilisez une centrifugeuse de table pour centrifuger rapidement les échantillons et sédimenter les perles de verre. Ensuite, utilisez une pipette pour recueillir le supernatant, qui contient les vésicules. Tout d’abord, mélanger 100 microlitres de l’ADN plasmide pré-purifié avec 100 microlitres d’alcool Roti-Phénol, chloroforme ou isoamyle dans un tube de micro centrifugeuse pour permettre une meilleure séparation de phase.Inversez doucement le tube jusqu’à six fois et centrifugez à 16 000 fois g et température ambiante pendant cinq minutes. Ajouter ensuite 200 microlitres de chloroforme à la phase supérieure et inverser le tube jusqu’à six fois. Centrifugez l’échantillon à 16 000 fois g et température ambiante pendant cinq minutes.Après cela, pipette le supernatant à un tube séparé et ajouter 10 microlitres de trois acétate de sodium molaire pour les précipitations d’éthanol. Ajouter un millilitre d’éthanol froid à 80 degrés Celsius et conserver l’échantillon à 80 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.Décanter le supernatant et ajouter un millilitre de froid 70% d’éthanol à 20 degrés Celsius. Centrifugeuse à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le liquide par pipetting, en prenant soin de ne pas déranger la pastille d’ADN.Conserver l’échantillon à température ambiante pendant environ 15 minutes pour évaporer le reste de l’éthanol. Après cela, ajouter de l’eau ultra pure à l’échantillon pour ajuster la concentration de l’échantillon à environ 300 nanomolaires, qui est mesurée par absorption à 260 nanomètres. Pour préparer la réaction transcription-traduction, suivez l’extraction des cellules brutes préparées et le tampon de réaction sur la glace.Pour un mélange de réaction de 60 microlitres, ajouter l’ADN plasmatique à 37,5 microlitres du tampon de réaction, ajouter 28,7 microlitres d’extrait de cellules brutes et remplir d’eau ultra pure à un volume final de 58,8 microlitres. Juste avant le début de la réaction, ajouter 1,2 microlitres de la solution de polymése T7RNA, et pipette de haut en bas pour mélanger. Incuber l’échantillon et une solution de gonflement à 29 degrés Celsius pour la durée de l’expérience, qui est généralement de quatre à huit heures.Les images de microscopie électronique de transmission des vésicules montrent que diverses solutions de gonflement, telles que TX/TL ou même seulement PBS peuvent être employées pour former des vésicules. Pour les deux solutions, la détermination de la taille est un pas en avant. La diffusion dynamique de la lumière montre que les vésicules préparées sans la méthode des perles de verre ont un diamètre de 134 nanomètres, avec une polydispersité de 25%Lorsque des perles de verre sont utilisées, le diamètre se traduit par 168 nanomètres, avec une polydispersité de 21%L’intensité de fluorescence de deux protéines fluorescentes, qui sont exprimées à l’intérieur des vésicules PEL, sont ensuite mesurées à l’aide d’un lecteur de plaque de fluorescence.Il est important de noter qu’après la formation de vésicules, le contenu des vésicules et la solution externe sont les mêmes, donc, l’antibiotique Kanamycine est ajouté à la solution extérieure pour supprimer l’expression des protéines. Comme contrôle, la kanamycine est également ajoutée à la solution de gonflement, auquel cas l’expression de protéine à l’intérieur de la vésicule est supprimée. Cela indique que kanamycine ne diffuse pas à travers la membrane, et supprime l’expression interne en permanence, tout le temps.L’analyse fret est ensuite effectuée pour démontrer l’incorporation du PEL dans la membrane. Lors de l’expression des PEL membranaires, des peptides supplémentaires s’incorporent dans la membrane, ce qui augmente la distance moyenne entre les paires fret, et qui entraîne une augmentation du signal donneur. La technique présentée peut être utilisée pour produire des récipients de réaction simples ou pour créer des cellules artificielles avec des membranes à base de peptide.Le contenu à l’intérieur peut être choisi au besoin. En utilisant ces vésicules peptidiques, nous pouvons maintenant nous attendre à des réactions de synthèse plus complexes en leur sein.

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