Name: Traitement transitoire des cellules souches pluripotentes humaines avec DMSO pour promouvoir la différenciation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Découvrez un protocole simple utilisant le DMSO pour améliorer la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode augmente l'efficacité de génération de lignées cellulaires pour la thérapie cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Stanford University School of Medicine et une bourse Siebel décernée à S. C.

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

En résumé, ce protocole décrit un outil simple et peu coûteux pour améliorer la capacité de différenciation des cellules souches pluripotentes (CSP) à toutes les couches germinales primaires, à divers types de cellules progénitrices spécialisées, et même aux types fonctionnels et matures de cellules in vitro. et les paramètres in vivo. Illustrés sont des protocoles de différenciation spécifiques qui ont été effectivement reproduits dans notre laboratoire ainsi que d'autres, mais tout protocole de différenciation de choix peut être utilisé après le traitement DMSO. Comme le montre le tableau 1, un certain nombre de laboratoires ont également démontré une amélioration de la différenciation de la CFP après un traitement d'Administration numérique transitoire utilisant différents paradigmes pour générer divers autres types de cellules terminales. En outre, bien que les méthodes décrivent ici l'utilisation des CSP humains, le prétraitement DMSO peut être utilisé entre les espèces et s'est avéré efficace chez les cSP de souris, de lapins et de primates.
Bien que des doses plus élevées de DMSO soient connues pour être cytotoxiques, les faibles doses utilisées dans cette méthode (1%-2%) pour une période transitoire entraîner une mort cellulaire minimale. Alors que le nombre global de cellules immédiatement après le traitement DMSO peut diminuer en raison de la promotion DMSO de l'arrêt du cycle cellulaire dans la phase G1 du cycle cellulaire, des études antérieures montrent que les cellules sont en mesure d'atteindre le même niveau de confluence que les cultures témoins après l'ablation de DMSO3.
Le pourcentage et la durée du prétraitement DMSO devraient être optimisés par ligne cellulaire. Le temps de traitement doit être ajusté en tenant compte du temps de cycle/doublement des cellules. Par exemple, les CSP de souris ont généralement des temps de vélo beaucoup plus courts d'environ 15 h; ainsi, le traitement de DMSO pour 15 h pour ces cellules est suffisant. Certains laboratoires ont également constaté que le traitement DMSO était bénéfique lorsqu'il est maintenu pendant le protocole de différenciation ou à des concentrations plus faibles (voir le tableau 1). Il convient de noter que certaines lignes de la CFP sont plus modifiables à la différenciation par rapport à des lignées spécifiques. Par exemple, il a été démontré que les cellules HUES6 sont moins permissives à la différenciation et ont donc connu une amélioration marquée avec le traitement DMSO (figure 2). Alternativement, il a été démontré que les cellules HUES8 utilisées dans la figure 4 et la figure 5 ont une plus grande propension à la différenciation endodermale; ainsi, moins de différences ont été montrées entre le contrôle et DMSO pour la différenciation aux étapes initiales vers l'endoderm définitif. Néanmoins, l'amélioration du prétraitement DMSO est observée à des stades ultérieurs de différenciation dans cette lignée cellulaire (figure 4B). Le traitement DMSO est également polyvalent en ce qu'il est efficace dans les deux systèmes de cultures cellulaires 2D et 3D, il peut être utilisé avec différents types de matériau de revêtement sur les plaques de culture cellulaire, et il fonctionne dans différents types de milieu d'entretien qui favorisent la croissance et l'expansion de hPSC (p. ex. mTeSR, E8, médias conditionnés MEF, etc.).
Plus généralement, ces résultats suggèrent que l'état de départ des cellules souches pluripotentes a une forte influence sur la propension à la différenciation initiale ainsi qu'à la différenciation terminale en types de cellules fonctionnelles. Nous avons précédemment montré que le traitement DMSO fonctionne par rb dans hPSCs3,5. Rb joue un rôle important dans la promotion de la différenciation terminale, la survie cellulaire, et la stabilité génétique des cellules41,42,43,44, et il peut donc expliquer les effets persistants sur les cellules différenciés des hPSC traités par DMSO. Cibler ces premiers modes de régulation peut placer les HPSC sur une meilleure trajectoire de différenciation et, en fin de compte, améliorer leur utilité pour la médecine régénérative.

L'utilisation de cellules souches pluripotentes a mené à de nombreux progrès dans la recherche biomédicale, y compris les domaines de la médecine régénérative et des thérapies à base de cellules souches, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Il a également conduit à la perspective globale d'une recherche plus traduisible et de la médecine personnalisée. L'avènement de la technologie induite des cellules souches pluripotentes (iPSC) il y a plus de 20 ans a permis aux chercheurs de développer des cellules souches pluripotentes à partir de tissus somatiques et de les différencier en types de cellules fonctionnelles pour étudier une variété de pathologies, y compris maladies cardiovasculaires, neurologiques et immunologiques. Bien que des progrès significatifs aient été réalisés dans la technologie de différenciation des cellules souches, des défis ont été relevés dans la différenciation efficace des cellules souches embryonnaires humaines (HESC) et des iPSC, ce qui limite l'utilisation généralisée de la technologie des cellules souches dans différents programmes de recherche. La variabilité inhérente entre les différentes lignées cellulaires et clones continue de poser des obstacles à la différenciation des lignées de cellules souches aux linages désirés1. En outre, la réalisation de cellules fonctionnelles matures et différenciées en phase terminale des hPSC demeure un processus fastidieux et inefficace à travers de nombreuses lignées. En fait, les cellules différenciées des hPSC ne se différencient souvent pas en cellules fonctionnelles2. Dans le déplacement des thérapies à base de cellules souches à utiliser chez les patients, il est nécessaire d'améliorer et d'assurer l'efficacité des cellules qui sont générées à partir de hPSC.
Notre laboratoire a mis en place un outil rapide et peu coûteux pour améliorer considérablement l'efficacité de la différencié des iPSC et des ESC en types de cellules matures. Nous avons constaté que le prétraitement des hiPSCs et des HESC avec le sulfoxide de diméthyle de réactif couramment utilisé (DMSO) pendant 24 h à 48 h avant les résultats dirigés de différenciation dans une amélioration marquée de la capacité de différenciation de cellules souches. Le traitement par DMSO augmente la proportion de hiPSCs et de HESC s'au début de la phase G1 du cycle cellulaire et active la protéine rétinoblastome (Rb)3, un régulateur critique de la prolifération cellulaire, de la survie et de la différenciation4. Dans des travaux plus récents, il a été constaté que Rb et ses membres de la famille sont nécessaires pour les effets pro-différenciation de DMSO, de sorte que l'inactivation transitoire de Rb supprime les effets de DMSO, tandis que l'activation constitutive de Rb d'une manière transitoire améliore Effets de DMSO5. Analogue au cycle cellulaire au cours du développement embryonnaire, le cycle cellulaire des ESC et des iPSC est caractérisé par une phase G1 abrégée qui favorise l'auto-renouvellement6,7,8. Cette phase G1 abrégée permet une prolifération plus illimitée mais limite le potentiel de différenciation4,9. En favorisant l'arrêt de croissance dans G1 et en activant des contrôles de point de contrôle dans le cycle cellulaire des HESC et des iPSC, les cellules de traitement de DMSO des nombres premiers pour des changements de destin de cellules suivant la différenciation dirigée.
À ce jour, il a été démontré que le prétraitement DMSO améliore la capacité de différenciation des trois couches germinales dans plus de 30 lignées cellulaires humaines SPÉCIFIQUES à l'ESC et à l'iPSC3,5 ainsi que la différenciation des cellules souches et d'autres lignées cellulaires à une variété d'autres types de cellules matures dans les études ultérieures10,11,12,13,14,15,16, 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 21 Ans, états-unis , 22 Ans , 23 Ans, états-unis , 24 Ans, états-unis , 25 Annonces , 26 Annonces , 27 Annonces , 28 (Tableau 1). En outre, le traitement DMSO s'est avéré efficace pour améliorer la différenciation des cellules primaires non humaines21,23 (p. ex. souris, primate, lapin), suggérant des mécanismes partagés entre les espèces. Enfin, le prétraitement DMSO a également été étendu à la technologie d'édition de gènes, avec une étude particulière montrant que 24 h DMSO prétraitement des HESC / iPSCs considérablement augmenté la capacité de Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) /CRISPR-associé protéine-9 (Cas9)-mediated efficacité d'édition de l'ADN non-codage sans incorporer des mutations involontaires29. Fourni ici est une méthodologie détaillée du prétraitement DMSO des HESC et iPSCs pour des applications dans la biologie des cellules souches et la différenciation dirigée.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>6 puits transparent à fond plat traité TC Plaque de culture cellulaire multipuits</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>plaque d’agitation à 9 positions&nbsp ;</td><td>Chemglass</td><td>CLS-4100</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI</td><td>Gibco</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>Alk5i II</td><td>Axxora</td><td>ALX-270-445</td><td></td></tr><tr><td>Acide rétinoïque tout-trans&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>anti-Brachyury</td><td>R& D Systems</td><td>AF2085</td><td>Aucune variabilité observée sur les différents numéros de lot</td></tr><tr><td>anti-peptide C</td><td>Études sur le développement Hybridoma Bank</td><td>GN-ID4</td><td>Aucune variabilité observée sur les différents numéros de lot</td></tr><tr><td>anti-FoxA2</td><td>Millipore</td><td>07-633</td><td>Aucune variabilité observée sur les différents numéros de lot</td></tr><tr><td>anti-Nkx2.2</td><td>Université de l’Iowa, Developmental Hybridoma Bank</td><td>74.5A5</td><td>Aucune variabilité n’a été observée entre les différents numéros de lot</td></tr><tr><td>anti-Nkx6.1</td><td>Université de l’Iowa, Developmental Hybridoma Bank ; &nbsp ;</td><td>F55A12-surnageant</td><td>Aucune variabilité observée entre les différents numéros de lot</td></tr><tr><td>anti-Olig2</td><td>EMD Millipore</td><td>MABN50</td><td>Aucune variabilité observée entre les différents numéros de lot</td></tr><tr><td>anti-Pax-6</td><td>Biolegend</td><td>901301</td><td>Aucune variabilité observée entre les différents numéros</td></tr><tr><td>de lot anti-Pdx1</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td>Aucune variabilité n’a été observée entre les différents numéros de lot</td></tr><tr><td>anti-SOX1.</td><td>R& D Systems</td><td>AF3369</td><td>Aucune variabilité n’a été observée entre les différents numéros de lot</td></tr><tr><td>anti-SOX17</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>Aucune variabilité observée entre les différents numéros de lot</td></tr><tr><td>B-27 Supplément, moins la vitamine A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes basiques</td><td>Gibco</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>Betacellulin</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>50932345</tr><tr><td>Chir99021</td><td>Stemgent</td><td>04-000-10</td><td></td></tr><tr><td>CMRL 1066</td><td>Corning</td><td>99-603-CV</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Compteur de cellules automatisé</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>AMQAF1000</tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>G7528&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Flacons tournants jetables</td><td>Corning, VWR</td><td>89089-814</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Média</td><td>Gibco</td><td>A1516501</td><td></td></tr><tr><td>FAF-BSA</td><td>Proliant&nbsp ;</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>PeproTech</td><td>100-19</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>héparine&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>H3149&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Insuline ultrasensible humaine ELISA</td><td>ALPCO Diagnostics</td><td>80-INSHUU-E01.1</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td></td><td></td>51500056</tr><tr><td>KGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-19</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Sérum de remplacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-3,3&prime ;,5-Triiodothyronine (T3)</td><td>EMD Millipore</td><td>642245</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>MCDB-131</td><td>Cellgro&nbsp ;</td><td>15-100-CV&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>S3817&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Noggin Fc Chimera Protein</td><td>R& D Systems</td><td>3344-NG-050</td><td></td></tr><tr><td>PdBU</td><td>EMD Millipore</td><td>524390</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine&nbsp ;</td><td>Mediatech&nbsp ;</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Sant1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4572</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agoniste lissé, SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Microplaques à très faible fixation</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Vitamine C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544 ;</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3a</td><td>R& D Systems</td><td>5036-WN</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748</td><td></td></tr><tr><td>XXI</td><td>EMD Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>StemCell Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

traitement transitoire des cellules souches pluripotentes humaines avec dmso pour promouvoir la différenciation

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Malgré l'utilisation croissante de cellules souches pluripotentes (CSP), des difficultés demeurent pour différencier efficacement les cellules souches embryonnaires et induites (ESC et iPSC) à travers diverses lignées. De nombreux protocoles de différenciation ont été développés, mais la variabilité entre les lignées cellulaires et les faibles taux de différenciation posent des défis dans la mise en œuvre réussie de ces protocoles. Décrit ici est un moyen facile et peu coûteux pour améliorer la capacité de différenciation des CFP. Il a déjà été démontré que le traitement des cellules souches ayant une faible concentration de sulfoxide de diméthyle (DMSO) augmente considérablement la propension d'une variété de CSP à se différencier de différents types de cellules suivant la différenciation dirigée. Cette technique s'est maintenant avérée efficace entre différentes espèces (p. ex. souris, primateet stupéfères) en plusieurs lignées, allant des neurones et des sphéroïdes corticaux aux cellules musculaires lisses et aux hépatocytes. Le prétraitement DMSO améliore la différenciation de la PSC en régulant le cycle cellulaire et en amorçant les cellules souches pour être plus sensible aux signaux de différenciation. Fourni ici est la méthodologie détaillée pour utiliser cet outil simple comme un moyen reproductible et largement applicable pour différencier plus efficacement LES CFP à toute lignée de choix.

Générer des types de cellules différenciées des cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) est très prometteur sur le plan thérapeutique, mais demeure difficile. Les CFP présentent souvent une incapacité inhérente à se différencier même lorsqu'elles sont stimulées par un bon ensemble de signaux. Décrit ici est un outil simple pour améliorer la différenciation multilinéaire à travers une variété de lignes de PSC.

Traitement transitoire des cellules souches pluripotentes humaines avec DMSO pour promouvoir la différenciation

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

Il s’agit d’un traitement simple qui peut être appliqué à n’importe quelle lignée de cellules souches ou protocole de différenciation aux cellules de choix pour la différenciation. Tout ce qu’on a à faire est d’ajouter DMSO à 1-2% dans le milieu de maintenance de la culture cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’augmenter significativement le potentiel de différenciation des cellules souches pluripotentes dans n’importe quelle lignée de choix en amorçant les cellules pour la différenciation.Le traitement par DMSO augmente les chances que les cellules se différencient des iPSC dérivés du patient, ce qui leur permet d’être utilisées pour la thérapie de remplacement cellulaire, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Elle peut donner lieu à l’apparition précoce d’une réglementation qui contrôle la sous-prolifération, la différenciation et les spécifications au cours du développement embryonnaire. Nous avons démontré que le traitement DMSO améliore la différenciation dans près de 50 lignées de cellules souches pluripotentes embryonnaires et induites.Alors que d’autres laboratoires ont montré qu’il est bénéfique pour les cellules souches d’autres espèces, comme la souris et le primate. Un jour avant le début de la différenciation, ajoutez DMSO à une concentration de 1 ou 2% pendant 24 heures dans votre support d’entretien typique. 24 heures après le traitement DMSO, remplacez le milieu et procédez à votre protocole de différenciation habituel.Cultiver des cellules selon les instructions manuscrites. Lorsque les cellules atteignent une confluence appropriée, dissociez-les et préparez une suspension à cellule unique. Comptez les cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatiques, à l’aide d’un marqueur de viabilité tel que le bleu trypan.Afin d’atteindre 80-90% confluency dans le pré-traitement de 24 heures DMSO, plaquez les cellules sur une plaque enduite de six puits à une densité de 500.000 à 1 million de cellules par puits. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone. Ensuite, aspirez les médias et remplacez-les par une solution DMSO de 1 à 2 %.Laissez les cellules couver pendant 24-28 heures avant la différenciation. Si vous couvez pendant 48 heures, remplacez le média après 24 heures par une solution DMSO fraîche. Pour atteindre la différenciation de la culture 3D, grandir et recueillir les cellules dans une suspension cellulaire.Comptez les cellules vivantes et plaquez-les dans une plaque de six puits non encoated et à faible attachement dans les médias de cellules souches avec inhibiteur de ROCK. En règle générale, des sphères de cellules souches pluripotentes humaines 3D se forment dans les 24 heures. Laissez les cellules couver pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone.Préparer 1-2%DMSO dans les médias de cellules souches préchauffées selon les instructions manuscrites. Pour remplacer le média après l’incubation, inclinez la plaque à un angle de 30 à 45 degrés et laissez les sphères cellulaires s’installer au fond du puits. Aspirez les supports des cellules et suspendez-les doucement dans la solution DMSO.Laissez les cellules couver pendant 24-48 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone. Pré-traiter les cellules avec DMSO tel que décrit pour les cultures 2D, et préparer noggin et SB431542 solutions de stock. Préparez suffisamment de remplacement de sérum de 10%KNOCKOUT, ou KOSR, dans knockout DMEM pour trois à quatre jours de changement de médias.Préparez des supports de différenciation ectodermique en ajoutant de la noggine et du SB431542 au DMEM KO KOSR préchauffé tel que décrit dans le manuscrit. Après le prétraitement du DMSO, aspirer les médias des cellules et ajouter deux millilitres de médias de différenciation à chaque puits. Laissez les cellules couver pendant trois à quatre jours à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone, remplaçant quotidiennement les médias par de nouveaux facteurs de différenciation.Le pré-traitement du DMSO entraîne une diminution transitoire et dépendante de la dose du taux de croissance cellulaire par rapport aux cellules non traitées. Cette diminution de la prolifération est associée à une augmentation du contact cellule à cellule, qui est particulièrement prononcée dans les cellules traitées à 2 % par le DMSO. Lorsque les cellules sont fixées et tachées pour les marqueurs prototypiques de chaque couche germinale, on peut voir que 2% DMSO pré-traitement entraîne une proportion accrue de cellules différenciées couche germinale.Par exemple, SOX17 a été taché pour visualiser les cellules endoderm. Afin d’étudier l’effet du DMSO sur la différenciation des types de cellules progénitrices du système nerveux central, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme pourraient être différenciées en cellules progénitrices neurales ou en cellules progénitrices oligodendrocytes. Comparé aux cellules de contrôle, le pré-traitement de 2%DMSO augmente l’expression du marqueur de cellules progénitrices neurales Pax6.De même, le pré-traitement augmente la proportion de cellules exprimant oligodendrocyte marqueur cellulaire ancêtre Olig2. En outre, le traitement initial de DMSO améliore la fonction embryonnaire humaine de cellules souches dérivées après transplantation in vivo. Lorsque des cellules progénitrices pancréatiques différenciées sont transplantées sur des souris immunodéficientes, leur fonctionnalité peut être testée en réponse à un défi de glucose ou à une stimulation KCl.Les améliorations de la fonctionnalité cellulaire sont évidentes de deux semaines à 16 semaines après la transplantation. La considération la plus importante à prendre en compte est le temps de cycle ou de doublement de vos cellules souches. La durée du traitement DMSO devrait être la même que le temps de cycle des cellules.Après le traitement initial du DMSO, on peut comprendre comment la prolifération cellulaire et le cycle cellulaire sont régulés dans les cellules souches, car le traitement aide à promouvoir l’arrêt de la croissance dans la phase G1 du cycle cellulaire. Les cellules différenciées peuvent être utilisées pour comprendre les mécanismes liés à la maladie, pour la co-culture avec d’autres types de cellules, dans les tests de tumorigénicité, et dans des analyses fonctionnelles ou des études de transplantation pour déterminer si les cellules différenciées peuvent sauver un phénotype de la maladie.

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Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo montre la méthode d’amélioration de la différenciation des cellules souches avec un traitement transitoire au DMSO, qui arrête les cellules en phase G1. Après le traitement, un milieu de différenciation ectodermique avec des inhibiteurs de BMP et de TGF-β est ajouté pour favoriser la formation de précurseurs neuraux.

Amélioration de la différenciation des cellules souches avec un traitement transitoire au DMSO

La vidéo présente une technique de différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) en cellules progénitrices neurales (NPC). Initialement, les hiPSC sont cultivées sur une couche nourricière de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Par la suite, les cellules sont détachées et transférées sur une plaque recouverte de biopolymère pour permettre aux MEF d’adhérer et de se séparer des hiPSC. Les hiPSC en suspension sont ensuite transférés sur une plaque à fond en...

Différenciation de cellules souches pluripotentes induites en cellules progénitrices neurales

Nous, sur la base des connaissances de la biologie du développement et des recherches publiées, avons développé un protocole optimisé pour générer efficacement des neurones dopaminergiques A9 du mésencéphale à partir de cellules souches embryonnaires humaines et de cellules souches pluripotentes induites humaines, ce qui serait utile pour la modélisation de la maladie et la thérapie de remplacement cellulaire pour la maladie de Parkinson.

Réalisé neurone dopaminergique différenciation de cellules pluripotentes humaines souches

Ce travail décrit un protocole de différenciation in vitro pour produire pigmentées, mélanocytes matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines par une crête neurale et mélanoblaste étape intermédiaire en utilisant un protocole de 25 jours sans alimentation.

Dérivation libre Feeder-de mélanocytes de pluripotentes humaines Cellules souches

Nous avons décrit en détail deux protocoles de base chimique pour la culture des cellules souches embryonnaires de souris. Cette nouvelle méthode utilise des mécanismes synergiques de promouvoir l’oxydation induite par le Tet (par la vitamine C) et réprimant la synthèse de novo de la 5-méthylcytosine (par PD0325901) pour maintenir l’hypométhylation de l’ADN et la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris.

Une méthode de Culture Alternative pour maintenir l’hypométhylation génomique des cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de MEK inhibiteur PD0325901 et vitamine C

Le protocole présenté ici décrit une plate-forme pour l’identification de petites molécules pour le traitement des maladies du foie. On présente une description étape par étape détaillant comment de CISP se différencient en cellules ayant des caractéristiques d’hépatocytes en plaques à 96 puits et d’utiliser les cellules pour dépister les petites molécules ayant une activité thérapeutique potentielle.

À l’aide de l’homme induit des hépatocytes-comme dérivé de cellules souches pluripotentes for Drug Discovery

Nous présentons un protocole pour la reversion chimique efficace, rapide et en vrac de classiques pluripotentes humaines lineage-amorcé des cellules souches (hPSC) dans un état de préimplantation épiblaste comme pluripotentes naïve epigenomically stable. Cette méthode se traduit par l’expression des gènes de lignée-amorcé une baisse et une amélioration marquée dans la différenciation multilignée dirigée à travers un vaste répertoire des lignes classiques hPSC.

Réversion chimique des cellules souches pluripotentes humaines classiques à un état semblable au naïf avec une puissance améliorée de différenciation multilignée

Ce protocole détaille une méthode monocouche, sans sérum, pour générer efficacement des cellules hépatocytes à partir de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) en 18 jours. Cela implique six étapes que les hPSC se différencient séquentiellement en types de cellules intermédiaires tels que la strie primitive, endoderm définitif, prégut postérieur et progéniteurs de bourgeons hépatiques avant de former des cellules hépatocytes.

Différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines en cellules hépatiques

Cette étude rapporte une nouvelle approche pour mesurer plusieurs paramètres fonctionnels mitochondriaux basés sur la cytométrie en flux et la double coloration avec deux rapporteurs fluorescents ou anticorps pour détecter les changements dans le volume mitochondrial, le potentiel de membrane mitochondriale, le niveau d’espèces réactives de l’oxygène, la composition de la chaîne respiratoire mitochondriale et l’ADN mitochondrial.

Analyse cytométrique en flux de paramètres mitochondriaux multiples dans des cellules souches pluripotentes induites par l’homme et leurs dérivés neuronaux et gliaux

Nous présentons ici un protocole pour un système automatisé de culture cellulaire. Ce système de culture automatisé réduit la main-d’œuvre et profite aux utilisateurs, y compris les chercheurs qui ne sont pas familiers avec la manipulation des cellules souches pluripotentes induites (iPS), de l’entretien des cellules iPS à la différenciation en différents types de cellules.

Système de culture automatisé pour le maintien et la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Ce protocole décrit et compare deux méthodes représentatives pour différencier les hiPSCs en cellules stromales mésenchymateuses (CSM). La méthode monocouche se caractérise par un coût inférieur, un fonctionnement plus simple et une différenciation ostéogénique plus facile. La méthode des corps embryoïdes (EBs) se caractérise par une consommation de temps plus faible.

Comparaison de deux méthodes représentatives pour la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules stromales mésenchymateuses

Découvrez un protocole simple utilisant le DMSO pour améliorer la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode augmente l'efficacité de génération de lignées cellulaires pour la thérapie cellulaire.

Traitement transitoire des cellules souches pluripotentes humaines avec DMSO pour promouvoir la différenciation

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