Name: Différenciation pan-myéloïde du sang de cordon humain Dérivé CD34- Cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Découvrez la différenciation pan-myéloïde des cellules CD34+ du sang de cordon humain. Cette méthode permet d'étudier les quatre lignées myéloïdes et l'impact des mutations sur l'hématopoïèse.

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Les auteurs tient à remercier Wendy Barrett, Rachel Caballero et Gabriella Ruiz de Maricopa Integrated Health Systems pour les unités de sang de cordon désitruré et données, Mrinalini Kala pour l'aide à la cytométrie du débit, et Gay Crooks et Christopher Seet pour conseils sur la différenciation myéloïde ex vivo. Ce travail a été soutenu par des fonds à S.S. des National Institutes of Health (R21CA170786 et R01GM127464) et de l'American Cancer Society (la Subvention de recherche institutionnelle 74-001-34-IRG). Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

Le sang de cordon ombilical humain pour l'expérimentation a été donné par des individus en bonne santé après consentement éclairé aux systèmes intégrés de santé de Maricopa (MIHS), Phoenix. Les unités identifiées ont été obtenues dans le cadre d'un accord de transfert de matériel entre le MIHS et l'Université de l'Arizona.
1. Réactifs et tampons
REMARQUE: Préparer tous les réactifs et tampons dans des conditions stériles dans un coffret de sécurité biologique.
<ol><li>Préparer le tampon stérile PBS-BSA-EDTA (PBE) en ajoutant 7,2 ml d'albumine stérile à 35 % de sérum bovin (BSA; utilisation de la culture stérile des tissus de qualité 35 % BSA) et 5 mL de téthylène téthylène tétra acétique ténu tétra tétra tétra técétique stérile (EDTA) à 487,8 mL de phosphate stérile saline (DPBS). Filtrer la stérilisation et dégazer le tampon en laissant le filtre attaché à l'aspirateur dans un coffret de sécurité biologique pendant au moins 2 h. Aliquot le tampon dégazé en plus petits volumes (250 ml) et le stocker à 4 oC.</li>
	<li>Préparer 1x Hanks solution de sel équilibré (1x HBSS). Diluer 100 ml de 10x HBSS stock dans 900 ml d'eau distillée stérile pour faire 1 L de 1x HBSS et ajuster le pH à 7,2. Filtrer stériliser le 1x HBSS avant utilisation.</li>
	<li>Préparer une solution d'acide acétique de 2 % en ajoutant 2 ml d'acide acétique glaciaire à 98 ml d'eau distillée.</li>
	<li>Préparer 20 ng/mL recombinant e solution de fragment de fibronectin humain dans 1x PBS. Faire 10 ml par assiette de 48 puits.</li>
	<li>Préparer 2% BSA. À 100 ml 1x PBS, ajouter 2 grammes de fraction BSA V. Filtrer stériliser avant utilisation.</li>
	<li>Faites compléter le milieu d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco en ajoutant la poudre de DMEM, 3,7 gm de bicarbonate de sodium, 100 ml de sérum bovin fœtal (FBS) et 5 mL de pénicilline-streptomycine (PS) à 800 mL d'eau distillée stérile. Mélanger et faire le volume à 1 L, et filtrer stériliser avant utilisation.</li>
	<li>Préparer le milieu de congélation en mélangeant 90 ml de FBS et 10 ml de sulfoxide de diméthyle stérile (DMSO).</li>
	<li>Préparer le milieu de stimulation. Pour le milieu sans sérum, ajouter la L-glutamine à 2 mm, et les cytokines à une concentration finale de 50 ng/mL pour le facteur de cellules souches (SCF), la thrombopoiétine (TPO), et la tyrosine de type Fms kinase 3 ligand (Flt3L), et 20 ng/mL pour l'interleukine-3 (IL3) (voir tableau des matériaux pour la préparation des solutions de stock de cytokine). Faire 5 ml par assiette de 48 puits.</li>
	<li>Préparer 1x milieu de différenciation myéloïde. Pour compléter le DMEM, ajouter les cytokines à une concentration finale de 5 ng/mL pour le SCF, le Flt3L et l'IL3, 50 ng/mL pour le TPO et 4 unités/mL pour l'érythropoïétine (EPO). Faire 5 ml par assiette de 48 puits.</li>
	<li>Préparer 2x milieu de différenciation myéloïde. Pour compléter dMEM, ajouter des cytokines à une concentration finale de 10 ng/mL pour SCF, Flt3L et IL3, 100 ng/mL pour TPO, et 8 unités/mL pour l'OEB. Faire 5 ml par assiette de 48 puits.</li>
	<li>Préparer le tampon de cytométrie de flux. À 1 L de 1x PBS, ajouter 10 g de fraction BSA V.</li>
	<li>Préparer 1% de paraformaldéhyde en 1x PBS (voir Tableau des matériaux pour plus de détails).</li>
	<li>Préparer la solution poly-L-lysine en ajoutant 500 l de 10 mg/mL de poly-lysine à 49,5 ml de 1x PBS.</li>
</ol>2. Isolement des cellules mononucléaires du sang de cordon ombilical
REMARQUE: Pour le protocole décrit ci-dessous, des volumes de sang de cordon de 90 à 100 ml ont été utilisés. L'isolement descellules CD34 doit être effectué dans des conditions stériles dans un coffret de sécurité biologique.
<ol><li>Vaporiser le sac contenant de l'UCB avec 70 % d'éthanol pour stériliser la surface extérieure avant de l'introduire dans l'armoire de sécurité biologique. Transférer l'UCB dans une bouteille en plastique stérile de 250 ml et la diluer 1:1 en ajoutant un volume égal de température ambiante (RT) 1x HBSS.</li>
	<li>Distribuer 15 ml de milieu de fractionnement MNC (MFM; voir Tableau des matériaux) par tube en environ six tubes coniques stériles de 50 ml. Inclinez le tube avec MFM, et versez doucement 30 mL d'UCB dilué sur la couche MFM sans le déranger.</li>
	<li>Centrifugeles les tubes à 400 x g pendant 30 min à RT avec une accélération lente et sans frein.</li>
	<li>Après centrifugation, aspirez entre 15-20 ml du plasma au-dessus de la couche MNC. Recueillir délicatement les MNC à l'eau avec une pipette et transférer dans un nouveau tube conique de 50 ml. REMARQUE: Les MNC se déposent sous forme de couche blanche à l'interface du plasma et de la MFM, et des sédiments des globules rouges (RBC) au fond du tube conique.</li>
	<li>Piscine MNCs recueillies à partir de 2-3 tubes ensemble. Faire le volume de chaque tube à 50 ml avec tampon PBE froid.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 10 min à 4 oC, avec le frein à feu doux.</li>
	<li>Aspirer le supernatant et appuyez doucement sur le tube pour desserrer la pastille cellulaire.</li>
	<li>Suspendre à nouveau les cellules granulées dans 5 ml de tampon de Glace pBE froide. Utilisez les mêmes 5 ml de cellules re-suspendues pour recueillir les cellules d'autres tubes. Mélanger les cellules de 3 à 4 tubes ensemble dans un tube conique de 50 ml.</li>
	<li>Pour recueillir les cellules restantes, lavez tous les tubes avec 5 ml de tampon pBE froid et ajoutez au tube conique de 50 ml.</li>
	<li>Comptez les MNC en diluant 10 ll de suspension cellulaire dans une solution d'acide acétique de 490 l. REMARQUE: L'acide acétique lyse les RBC contaminants pour faciliter le comptage des MNC.</li>
	<li>Faire le volume de la suspension cellulaire à 50 ml avec tampon PBE glacé. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min à 4 oC, avec frein à basse température. REMARQUE: La suspension MNC peut être traitée immédiatement pour l'isolement des cellules CD34ou congelée pour des applications ultérieures.</li>
	<li>Pour congeler les MNC, retirer le supernatant et le suspendre à une densité de 2 x 107 cellules/mL dans le milieu de congélation à RT.</li>
	<li>Congeler les cellules à -80 oC pendant la nuit dans un récipient de congélation cellulaire, puis les transférer dans de l'azote liquide.</li>
</ol>3. Isolement des Cellules CD34des cellules mononucléaires
<ol><li>Si vous utilisez des MNC fraîchement isolés, passez directement à l'étape 3.3.</li>
	<li>Si vous utilisez des mNC congelés, décongelez rapidement les cellules congelées dans un bain d'eau de 37 oC et transférez-les dans un tube conique de 50 ml. Recueillir les cellules restantes dans les flacons avec 1 ml de tampon de PBE glacé et transférer dans le tube conique de 50 ml.</li>
	<li>Faire le volume de la suspension MNC à 50 ml avec tampon PBE froid et centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
	<li>Retirez le supernatant et appuyez doucement sur le tube pour desserrer la pastille cellulaire. Resuspendre les MNC à 1 x 108 cellules dans 300 lde de tampon de PBE glacé.</li>
	<li>Ajoutez 100 l de réagent de blocage FcR du kit humain de microbilles CD34 de tri de cellules activées magnétiquement (MACS) pour 1 x 108 MNC et mélangez doucement. REMARQUE: Cela bloque la liaison non spécifique aux microbilles CD34.</li>
	<li>Ajouter 100 L des microbilles CD34 pour 1 x 108 cellules. Mélanger délicatement et incuber à 4 oC pendant 30 min au réfrigérateur. Ne pas couver sur la glace.</li>
	<li>Pendant que les cellules couvent, placez une colonne LS et un filtre de pré-séparation dans le champ magnétique du séparateur MACS. Équilibrez la colonne avec un tampon PBE glacé en ajoutant 2 ml directement dans la colonne et 1 ml dans le filtre de pré-séparation. Laisser la colonne se vider dans un tube conique de 15 ml et jeter le flux à travers.</li>
	<li>Retirer les MNC de 4 oC, ajouter un tampon PBE glacé pour compenser le volume à 15 ml, et centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min à 4 oC, avec le frein à basse température.</li>
	<li>Aspirer le supernatant et re-suspendre les cellules dans 1 ml de tampon de PBE glacé.</li>
	<li>Ajoutez la suspension cellulaire au filtre de pré-séparation placé sur la colonne LS. REMARQUE: Le filtre de pré-séparation supprime les agrégats cellulaires volumineux qui peuvent bloquer la colonne.</li>
	<li>Rincer le tube avec 3 ml de tampon PBE glacé et l'ajouter au filtre de pré-séparation placé sur la colonne LS. Après cela, jetez le filtre de pré-séparation.</li>
	<li>Laver la colonne LS quatre fois en ajoutant 3 ml de tampon PBE glacé, ce qui permet à la colonne de s'écouler à chaque fois. REMARQUE: Lescellules CD34 resteront liées à la colonne et les cellules non étiquetées circuleront à travers la colonne.</li>
	<li>Après le lavage final, retirez la colonne du champ magnétique séparateur MACS et placez-la dans un nouveau tube conique de 15 ml, loin de l'aimant.</li>
	<li>Ajouter un tampon PBE glacé de 5 ml à la colonne et expulser les cellules CD34 reliées en poussant fermement dans le piston.</li>
	<li>En option, passez les cellules CD34et isolées de la première colonne sur une autre colonne LS avec le filtre de pré-séparation tel que décrit ci-dessus (étapes 3.10-3.13).</li>
	<li>Comptez les cellules isolées cD34avec le bleu trypan (10 l de cellules et 10 l de bleu trypan) pour déterminer le nombre total de cellules vivantes. REMARQUE: À ce stade, les cellules isolées CD34peuvent être congelées pour une utilisation ultérieure ou peuvent être traitées directement pour l'analyse des HSPC par cytométrie de débit (section 4) ou pour la différenciation des cellules de lignée myéloïde (section 5).</li>
	<li>Centrifugelant la suspension cellulaire à 600 x g pendant 5 min à RT, avec frein à basse.</li>
	<li>Pour congeler les cellules CD34, aspirer le supernatant et suspendre à nouveau jusqu'à 5 x 106 cellules dans 1 ml de milieu de congélation et congeler comme décrit ci-dessus (étape 2.13). Dans le cas contraire, passez à l'article 4 ou 5.</li>
</ol>4. Détermination des populations de tiges et d'ancêtres par cytométrie des flux
<ol><li>Pour déterminer les fractions des populations de tiges et d'ancêtres dans les CD34fraîchement isolés, les centrifuger à 600 x g pendant 5 min et suspendre à nouveau 1 x 106 cellules dans 50 L de tampon de cytométrie d'écoulement.</li>
	<li>À 1 x 106 cellules CD34, ajoutez des anticorps (voir Tableau des matériaux pour les dilutions) aux marqueurs de lignée (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 et CD235a — tous étiquetés FITC), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (APC) et 7- aminoactinomycine D (7-AAD; comme tache vivante/morte) et composent le volume total à 100 L. Incubate sur la glace dans l'obscurité pendant 20 min. REMARQUE: Moins de 1 x 106 cellules CD34 peuvent être utilisées pour l'analyse. Si la coloration de moins de cellules, le volume total et le volume d'anticorps ajoutés doivent être réduits en conséquence. Pour l'analyse de cytométrie du débit, les MNC non tachés et teints ne devraient pas être utilisés comme contrôles pour fixer des barrières positives et négatives pour chaque fluorophore.</li>
	<li>Après l'incubation, laver les cellules avec 1 ml de tampon de cytométrie d'écoulement et centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Optionnellement, fixer les cellules tachées dans 0.5 ml de solution de paraformaldehyde de 1% pendant 10 min dans l'obscurité à RT.</li>
	<li>Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min et aspirez le supernatant.</li>
	<li>Laver les cellules fixes/tachées avec 1 ml de tampon de cytométrie d'écoulement et centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
	<li>Aspirer le supernatant, re-suspendre les cellules dans 500 'L de tampon de cytométrie de flux, et d'analyser par un cytomètre de flux (Tableau des matériaux).</li>
</ol>5. Différenciation myéloïde des cellules de tige et de progéniture de CD34
REMARQUE: Pour différencier les CD34et HSPC aux cellules de lignée myéloïde, ils sont d'abord stimulés dans des plaques recombinantes de fibronectin humain enduites, puis ensemiés sur une couche de cellules stromales MS-5 dans le milieu de différenciation myéloïde. La différenciation peut être surveillée chaque semaine pendant 3 semaines en fonction de l'expression des marqueurs de surface cellulaire spécifiques aux quatre lignées myéloïdes. Pendant la stimulation et la différenciation, toutes les incubations sont effectuées à 37 oC et 5 % de CO2 dans une chambre humidifiée. Toutes les étapes doivent être effectuées dans un coffret de sécurité biologique.
<ol><li>Enrober les puits d'une plaque stérile non couchée de 48 puits en ajoutant 200 L/puits de solution de fibronectin humain recombinant dans 1x PBS pour 2 h à RT.</li>
	<li>Après 2 h, retirer soigneusement la solution de fibronectin humain recombinant e et jeter.</li>
	<li>Bloquer les puits avec 200 l/puits de 2% BSA pendant 30 min à RT.</li>
	<li>Aspirez la solution BSA et lavez les puits deux fois avec 500 l de 1x PBS stérile. REMARQUE: Les plaques enduites de fragments de fibronectin peuvent être stockées à 4 oC pendant une température pouvant aller jusqu'à 2 semaines.</li>
	<li>Pour stimuler les CD34et hSPc, suspendez à nouveau les cellules fraîchement isolées (à partir de l'étape 3.17) à une densité de 1 x 105 cellules/200 l ou 5 x 105 cellules/mL de milieu de stimulation chaud de 1x.</li>
	<li>Si vous utilisez des cellules CD34et CD34 congelées, dégelez rapidement et transférez les cellules dans un tube conique de 15 ml contenant du DMEM complet chaud. Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min et re-suspendre les cellules comme décrit à l'étape 5.5.</li>
	<li>Plaque 200 l de la suspension de cellules CD34par puits du fragment de fibronectin enduit 48 puits et incuber pendant 48 h.</li>
	<li>Le lendemain, les graines de 15 000 cellules stromales MS-5 dans 200 L de DMEM complet par puits d'une plaque traitée par la culture tissulaire de 48 puits et incitaient à 37 oC pendant 24 h.</li>
	<li>Après 48 h de stimulation, collectez les cellules CD34par pipetage doux. Laver les puits avec 500 l de DMEM chaud et la piscine avec la suspension cellulaire.</li>
	<li>Comptez les cellules avec le bleu trypan. Centrifugelant la suspension à 600 x g pendant 5 min et suspendez à une densité de 5 000 cellules/200 l de 1 x milieu de différenciation myéloïde.</li>
	<li>À partir de la plaque de culture tissulaire de 48 puits ensemait de cellules stromales MS-5, aspirez doucement le milieu sans déranger les cellules. Couche de 200 l (5 000 cellules) de la suspensioncellulaire CD34 par puits de la plaque et incuber à 37 oC. REMARQUE: La culture des cellules MS-5 peut être maintenue dans le DMEM complet. Le jour où lescellules CD34 sont ensemencées, les cellules MS-5 doivent être en couche uniforme (80-90% de confluence). Il est recommandé que les cellules MS-5 soient plaquées au moins 24 heures avant l'ensemencement descellules CD34.  Si les cellules MS-5 doivent être plaquées 48 h ou 72 h avant d'ensemencer les cellules CD34, la densité cellulaire doit être ajustée en conséquence. Il est également recommandé de laisser les puits périphériques de la plaque de 48 puits vides ou remplis de 200 l d'eau stérile afin d'éviter les effets de bord.</li>
	<li>Effectuer un changement de demi-moyen tous les 3 à 4 jours en enlevant doucement 100 l du milieu du haut de chaque puits et en le remplaçant par 100 l de 2x milieu de différenciation myéloïde par puits.</li>
	<li>Le jour 21, récoltez les cellules pour l'analyse de l'expression de marqueur de lignée myéloïde par cytométrie de flux. Sans perturber la couche MS-5, pipette doucement le milieu et transférer les cellules à un tube de 5 ml. REMARQUE: Pour l'analyse de la cytométrie de coloration et d'écoulement, les cellules de 1-2 puits sont suffisantes. La différenciation peut également être surveillée les jours 1, 7 et 14. Si vous effectuez l'immunophénotypage sur plusieurs jours, le nombre de puits nécessaires à l'analyse doit être calculé en conséquence.</li>
	<li>Tainer 5 x 105 cellules avec des anticorps à CD34 (APC-Cy7), CD66b (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (PerCP-Cy5.5), et CD235a (APC) dans un volume total de 50 'L. Incubate sur la glace dans l'obscurité pendant 20 min. Inclure mNCs non tachés et unique souillé comme pour les contrôles portes positives et négatives pour chaque fluorophore, et 7-AAD comme une tache vivante /morte pour éliminer les cellules mortes de l'analyse.</li>
	<li>Laver et fixer (facultatif) les cellules tachées telles que décrites ci-dessus (étapes 4.3-4.6).</li>
	<li>Re-suspendre les cellules dans 500 'L de tampon de cytométrie de flux et d'analyser par un cytomètre de flux.</li>
</ol>6. Évaluation de la morphologie cellulaire
<ol><li>Nettoyez les lames de microscope en pulvérisant de l'éthanol et en essuyant jusqu'à ce qu'ils grincent.</li>
	<li>Immerger les lames propres dans la solution poly-L-lysine pendant 5 min à RT et sécher pendant 1 h à RT.</li>
	<li>Resuspendre les HSPC de l'étape 3.14 et les cellules différenciées de l'étape 5.13 dans 10 'L de tampon de cytométrie de flux.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire sur les lames enduites et les laisser sécher à l'air. REMARQUE: Les diapositives du jour 1 et du jour 21 peuvent être stockées à RT et tachées simultanément.</li>
	<li>Verser 0,5 ml de la tache Wright-Giemsa sur la glissière et laisser reposer pendant 3 min à RT.</li>
	<li>Ajouter un volume égal d'eau déionisée et laisser reposer 10 min de plus à RT.</li>
	<li>Laver la glissière dans de l'eau déionisée.</li>
	<li>Visualisez les cellules tachées à un grossissement de 60x ou 100x par un microscope.</li>
</ol>

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<li>Caceres, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TP53+suppression+promotes+erythropoiesis+in+del%285q%29+MDS%2C+suggesting+a+targeted+therapeutic+strategy+in+lenalidomide-resistant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASXL1+plays+an+important+role+in+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ASXL1 plays an important role in erythropoiesis.</a> Scientific Reports. 6, 28789(2016).</li>
<li>Mazumdar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-Associated+Cohesin+Mutants+Dominantly+Enforce+Stem+Cell+Programs+and+Impair+Human+Hematopoietic+Progenitor+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation.</a> Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).</li>
<li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enforced+expression+of+an+Flt3+internal+tandem+duplication+in+human+CD34%2B+cells+confers+properties+of+self-renewal+and+enhanced+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis.</a> Blood. 105 (1), 77-84 (2005).</li>
<li>Ambrosini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+inhibits+ILC3+while+favoring+NK-cell+maturation+of+umbilical+cord+blood+CD34%28%2B%29+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors.</a> European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).</li>
<li>Batard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%28beta%291+maintains+hematopoietic+immaturity+by+a+reversible+negative+control+of+cell+cycle+and+induces+CD34+antigen+up-modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation.</a> Journal of Cell Science. 113, Pt 3 383-390 (2000).</li>
<li>Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+potent+small+molecule+capable+of+regulating+polyploidization%2C+megakaryocyte+maturation%2C+and+platelet+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production.</a> Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136(2016).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le protocole décrit ici convient à la différenciation ex vivo des CD34 cD34 dérivés de l'UCBet des HSPC aux quatre lignées myéloïdes. L'incubation initiale avec un mélange de cytokine composé de SCF, TPO, Flt3L et IL3 stimule lescellules CD34. Par la suite, la différenciation est réalisée avec un cocktail de SCF, IL3, Flt3L, EPO et TPO. Dans ce mélange, SCF, IL3, et Flt3L sont importants pour la survie et la prolifération des CD34- HSCs. EPO et TPO favorisent la différenciation vers les é...

La différenciation normale des cellules souches hématopoïétiques (HSC) est essentielle pour le maintien des niveaux physiologiques de toutes les lignées de cellules sanguines. Au cours de la différenciation, dans une réponse coordonnée aux indices extracellulaires, y compris les facteurs de croissance et les cytokines, les HSC donnent d'abord lieu à des cellules progénitrices multipotentes (MPP) qui ont un potentiel lympho-myéloïde1,2,3 ,4 (Figure 1). Les MPP donnent lieu à des progéniteurs myéloïdes communs (PMC) et à des progéniteurs lymphoïdes communs (CLP) qui sont limités par la lignée. Les CLP se différencient en lignées lymphoïdes composées de cellules tueuses B, T et naturelles. Les CmP génèrent les lignées myéloïdes à travers deux populations d'ancêtres plus restreintes, les progéniteurs d'érythroïdes mégacaryocytes (MEPs) et les progéniteurs de monocytes granulocytes (GMP). Les députés donnent lieu à des mégacaryocytes et des érythrocytes, tandis que les GMP donnent lieu à des granulocytes et des monocytes. En plus de surgir par le biais des PMC, les mégacaryocytes ont été signalés pour provenir directement de HSCs ou premiers MPP par des voies non-canoniques5,6.
Les cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre (HSPc) sont caractérisées par le marqueur de surface CD34 et l'absence de marqueurs spécifiques de lignée (Lin-). D'autres marqueurs de surface couramment utilisés pour distinguer les HSC et les populations d'ancêtres myéloïdes comprennent CD38, CD45RA et CD1232 (figure 1). Les HSC et les MPP sont Lin-/CD34-/CD38- et Lin-/CD34etCD38 , respectivement. Les populations d'ancêtres myéloïdes se distinguent par la présence ou l'absence de CD45RA et de CD123. Les CMP sont Lin-/CD34-/CD38/CD45RA-/CD123lo, les GmP sont Lin-/CD34-/CD38-/CD45RA-/CD123lo, et les députés sont Lin-/CD34 /CD38/CD45RA-/CD123-.
La population totale de cellules souches et progénitrices CD34 peut être obtenue à partir du sang de cordon ombilical humain (UCB), de la moelle osseuse et du sang périphérique. CD34- les cellules constituent 0,02% à 1,46% du total des cellules mononucléaires (MNC) dans l'UCB humain, tandis que leur pourcentage varie entre 0,5% et 5,3% dans la moelle osseuse et est beaucoup plus faible à 0,01% dans le sang périphérique7,8,9 . La capacité de prolifération et le potentiel de différenciation descellules CD34 dérivées de l'UCB sont significativement plus élevés que ceux de la moelle osseuse ou des cellules sanguines périphériques1,10, offrant ainsi un avantage distinct pour l'obtention matériel suffisant pour des analyses moléculaires en combination avec la caractérisation immunophenotypic et morphologique exécutante des cellules pendant la différenciation.
La différenciation ex vivo du sang de cordon ombilical dérivé CD34- HSPCs est un modèle largement appliqué pour étudier l'hématopoiesis normal et les mécanismes de la maladie hématopoïétique. Lorsqu'ils sont cultivés avec les cytokines appropriées, les UCB CD34et HSPC peuvent être induits à se différencier le long des lignées myéloïdes ou lymphoïdes11,12,13,14,15 , 16. Ici, nous décrivons des protocoles pour l'isolement et la caractérisation immunophénotypique des CD34- HSPc de l'UCB humain, et pour leur différenciation aux cellules de lignée myéloïdes. Ce système de culture est basé sur la différenciation induite par la cytokine des HSPC en présence de cellules stromales MS-5 pour imiter le microenvironnement dans la moelle osseuse. Les conditions de culture provoquent une expansion initiale descellules CD34, suivies de leur différenciation aux cellules qui expriment des marqueurs pour les quatre cellules de lignée myéloïde, à savoir les granulocytes (CD66b), les monocytes (CD14), les mégacaryocytes (CD41), et érythrocytes (CD235a). Les applications du protocole de différenciationdes cellules CD34 comprennent des études sur les mécanismes moléculaires régulant l'hématopoiesis, et des études de l'impact des mutations associées à la myéloïde et des petites molécules sur l'auto-renouvellement et différenciation des HSPC.

<table><tbody><tr><td>0,4 % de bleu de trypan en solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td>Diluer la substance de travail à 0,2 % dans un stérile 1x PBS</td></tr><tr><td>0,5 M UltraPure Ethylène diamine acide tétraacétique, pH 8,0</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14185052</td><td>Diluer à 1x avec de l’eau distillée stérile & pH à 7,2</td></tr><tr><td>2,5 % Trypsine, sans rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15090046</td><td>Diluer le matériau de travail à 1x avec stérile 1x PBS</td></tr><tr><td>30 &micro ; m Filtres de pré-séparation</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>35 % stérile Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>Biolegend</td><td>420404</td><td>Utilisé comme colorant vivant/mort pour éliminer les cellules mortes de l’analyse FACS</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD10-FITC humain (Clone HI10a)</td><td>Biolegend</td><td>312207</td><td>Utilisation Dilution</td></tr> <tr><td>1:20Anticorps anti-CD11b-FITC humain (activé) (Clone CBRM1/5)</td><td>Biolegend</td><td>301403</td><td>Use Dilution 1:5</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD123-APC humain (Clone 6H6)</td><td>Biolegend</td><td>306012</td><td>Use Dilution 1:20</td></tr><tr><td>Anticorps CD14-PE humain (Clone M5E2)</td><td>Biolegend</td><td>301806</td><td>Use Dilution 1:20</td></tr><tr><td>Anticorps CD19-FITC humain (Clone 4G7)</td><td>BD Biosciences</td><td>347543</td><td>Utilisation Dilution 1:5</td></tr><tr><td>Anticorps anti-humain CD235a-APC (Clone GA-R2 (HIR2))</td><td>BD Biosciences</td><td>551336</td><td>Utilisation Dilution 1:20</td></tr><tr><td>Anticorps anti-humain CD235a-FITC (Clone HIR2)</td><td>Biolegend</td><td>306609</td><td>Utilisation Dilution 1:50</td></tr><tr><td>Anticorps anti-humain CD34-APC-Cy7 (Clone 581)</td><td>Biolegend</td><td>343514</td><td>Utilisation Dilution 1:20</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD38-PE humain (Clone HIT2)</td><td>Biolegend</td><td>303506</td><td>Utiliser une dilution 1:20</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD3-FITC humain (clone UCHT1)</td><td>Biolegend</td><td>300405</td><td>Use Dilution 1:20</td></tr><tr><td>Anticorps anti-humain CD41a-PerCP-Cy5.5 (clone HIP8)</td><td>Biolegend</td><td>303720</td><td>Use Dilution 1:20</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD45Ra-PE-Cy7 humain (clone HI100)</td><td>Biolegend</td><td>304126</td><td>Use Dilution 1:20</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD66b-PE-Cy7 humain (clone G10F5)</td><td>Biolegend</td><td>305116</td><td>Use Dilution 1:20</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD7-FITC humain (Clone CD7-6B7)</td><td>Biolegend</td><td>343103</td><td>Utilisation Dilution 1:20</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>Filtrer stériliser avant utilisation</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) en poudre avec L-Glutamine&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>12100046</td><td>Reconstituer 1 sachet pour faire 1 L de média DMEM avec du bicarbonate de sodium, 10 % FBS & 1 % de pénicilline & streptomycine&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin, source australienne, inactivé par la chaleur</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-22 Lot #609716</td><td></td></tr><tr><td>Kit de microbilles CD34 humaines&nbsp ;</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-046-702</td><td></td></tr><tr><td>Thrombopoïétine humaine (TPO), qualité recherche</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-094-011</td><td>Faire un stock de 100 &micro ; g/mL dans 1 PBS + 0,1 % BSA. Utilisez 50 ng/mL pour la différenciation myéloïde et milieu de stimulation</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Omega Scientific</td><td>GS-60</td><td>2 mM concentration dans le milieu de stimulation</td></tr><tr><td>Colonnes LS</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multi stand</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MidiSéparateur magnétique</td><td>Miltenyi biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de fractionnement MNC (Ficol-Paque PLUS)</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr>Cellules <td></td><td></td><td>MS-5</td><td>Don du laboratoire de Gay Crooks, UCLA</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Chauffer 800 mL de 1x PBS dans un bécher en verre sur une plaque d’agitation dans une hotte chimique à ~65 &deg ;C. Ajouter 10 g de poudre de paraformaldéhyde. Pour dissoudre complètement le paraformaldéhyde, augmentez le pH en ajoutant 1 N NaOH. Refroidir et filtrer la solution et porter le volume à 1 L avec 1x PBS. Ajustez le pH à 7,2.</td></tr><tr><td>Pénicilline et Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Produire un stock de 10 mg/mL dans 1x PBS</td></tr><tr><td>Érythropoïétine humaine recombinante-alpha (rHu EPO-&alpha ;)</td><td>BioBasic</td><td>RC213-15</td><td>Réaliser un stock de 2 000 unités/mL dans 1x PBS + 0,1 % BSA. Utiliser 4 unités/mL pour la différenciation myéloïde</td></tr><tr><td>Fragment de fibronectine humaine recombinante (RetroNectin)</td><td>Takara&nbsp ;</td><td>T100B</td><td>Utilisation 20 & micro ; g/mL dilué dans du PBS stérile 1x pour enrober les puits avant la stimulation des CSH CD34+.</td></tr><tr><td>Ligand humain recombinant Flt-3 (rHu Flt-3L)</td><td>BioBasic</td><td>RC214-16</td><td>Faire un stock de 100 &micro ; g/mL dans 1 PBS + 0,1 % BSA. Utiliser 5 ng/mL pour la différenciation myéloïde et 50 ng/mL dans un milieu de stimulation</td></tr><tr><td>Interleukine-3 humaine recombinante (rHu IL-3)</td><td>BioBasic</td><td>RC212-14</td><td>Faire un stock de 100 &micro ; g/mL dans 1 PBS + 0,1 % BSA. Utiliser 5 ng/mL pour la différenciation myéloïde et 20 ng/mL dans un milieu de stimulation</td></tr><tr><td>Facteur de cellules souches humaines recombinantes (rHu SCF)</td><td>BioBasic</td><td>RC213-12</td><td>Produire un stock de 100 &micro ; g/mL dans 1 PBS + 0,1 % BSA. Utiliser 5 ng/mL pour la différenciation myéloïde et 50 ng/mL dans un milieu de stimulation</td></tr><tr><td>Milieu exempt de sérum (X-Vivo-15)</td><td>Lonza&nbsp ;</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Coloration Wright-Giemsa, modifiée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WG16-500</td><td>Utilisation selon les instructions du fabricant</td></tr><tr><td><fort>équipement&nbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Sorvall Legend RT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

différenciation pan-myéloïde du sang de cordon humain dérivé cd34- cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice

Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

La différenciation ex vivo des cellules souches hématopoïétiques humaines est un modèle largement utilisé pour étudier l'hématopoiesis. Le protocole décrit ici est pour la différenciation induite par cytokine des cellules de tige et d'progéniture de CD34- hématopoïétique aux quatre cellules myéloïdes de lignée. Lescellules CD34 sont isolées du sang de cordon ombilical humain et co-cultivées avec des cellules stromales MS-5 en présence de cytokines. La caractérisation immunophénotypique des cellules souches et progénitrices, et des cellules de lignée myéloïdes différenciées sont décrites. À l'aide de ce protocole, lescellules CD34 peuvent être incubées avec de petites molécules ou transduisantes avec des lentivirus pour exprimer des mutations de la myéloïde pour étudier leur impact sur la différenciation myéloïde.

L'application des protocoles ci-dessus donne 5,6 (0,5) x 108 MNC et 1 (0,3) x 106 CD34cellules à partir d'une unité de sang de cordon de 100 ml. Le pourcentage total de CD34et de cellules varie entre 80 et 90 % (figure2A,B). L'analyse immunophénotypique du schéma décrit par Manz et al.5 démontre que les cellules CD34-se composent généralement de 20 % de HSC et de MPP de 72 % qui sont Lin-</su...

Ici, nous présentons un protocole pour la caractérisation immunophenotypic et la différenciation induite par cytokine du sang de cordon dérivé CD34- cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice aux quatre lignées myéloïdes. Les applications de ce protocole comprennent des études sur l'effet des mutations de la maladie myéloïde ou de petites molécules sur la différenciation myéloïde descellules CD34.

Différenciation pan-myéloïde du sang de cordon humain Dérivé CD34- Cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice

Ex vivo differentiation of human hematopoietic stem cells is a widely used model for studying hematopoiesis. The protocol described here is for cytokine ...

Ce protocole peut être utilisé pour étudier les changements moléculaires et cellulaires qui se produisent au cours de la différenciation myéloïde normale des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices positives cd34 humaines. Le principal avantage de ce protocole est qu’il permet la différenciation des cellules cd34 positives le long des quatre lignées myéloïdes, y compris les mégacaryocytes, érythrocytes, granulocytes et monocytes. Aditi Bapat, post-doc de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Pour l’isolement cellulaire mononucléaire d’un échantillon de sang de cordon ombilical humain, stérilisez la surface externe d’un sac de sang de cordon ombilical avec 70% d’éthanol avant de transférer le contenu du sac dans une bouteille en plastique stérile de 250 millilitres dans une armoire de sécurité biologique. Diluer le sang avec un volume égal de la solution saline tamponnée de Hank à température ambiante, et ajouter 15 millilitres de milieu de fractionnement cellulaire mononucléaire à chacun des cinq tubes coniques stériles de 50 millilitres. Après un mélange doux, versez soigneusement 30 millilitres de sang de cordon ombilical dilué sur le milieu de fractionnement mononucléaire dans chaque tube, en tenant les tubes de 50 millilitres à un angle pour éviter de mélanger les couches.Séparez les cellules par centrifugation de gradient de densité, et retirez les 15 à 20 millilitres supérieurs de plasma au-dessus de la couche mononucléaire de cellules. Utilisez une pipette pour transférer soigneusement la couche cellulaire mononucléaire exposée dans un nouveau tube de 50 millilitres, en mettant en commun les cellules mononucléaires de deux à trois tubes ensemble, et amener le volume final dans chaque tube jusqu’à 50 millilitres avec tampon PBE froid. Pelleter les échantillons de cellules mononucléaires par centrifugation, et aspirer les supernatants.Appuyez doucement sur chaque tube pour desserrer les granulés cellulaires et diluer les granulés en cinq millilitres de tampon PBE glacé. Combinez les cellules de trois à quatre tubes dans un tube conique de 50 millilitres, et lavez tous les tubes avec cinq millilitres de tampon PBE frais pour recueillir les cellules restantes. Après compter, porter le volume final dans le tube jusqu’à 50 millilitres avec tampon PBE froid de glace fraîche, et recueillir les cellules par centrifugation.Pour isoler les cellules mononucléaires positives CD34, suspendez la pastille en 50 millilitres de tampon PBE frais avant de recueillir les cellules avec une autre centrifugation. Après avoir jeté le surnatant, appuyez doucement pour desserrer la pastille, et re-suspendre les cellules à une fois 10 aux huit cellules mononucléaires par 300 microlitres de concentration tampon de PBE froid. Bloquez toute liaison non spécifique avec 100 microlitres de récepteur Fc bloquant le réaccente, mélangez doucement, puis ajoutez 100 microlitres de microlitres de microbilles CD34 à partir d’un kit de microbille de CD34 humain activé magnétique par une fois 10 aux huit cellules avec mélange doux, et incuber les cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Pendant que les cellules couvent, placez une colonne LS et un filtre de pré-séparation dans un champ magnétique de séparateur MACS. Equilibrer la colonne avec deux millilitres de tampon PBE glacé et le filtre de pré-séparation avec un millilitre de tampon. Laissez la colonne se vider dans un tube conique de 15 millilitres et jetez l’écoulement.À la fin de l’incubation, amener le volume final de l’échantillon de cellules mononucléaires jusqu’à 15 millilitres avec tampon PBE froid de glace fraîche et sédimenter les cellules par centrifugation. Suspendez à nouveau la pastille dans un millilitre de tampon PBE glacé et chargez les cellules sur le filtre de pré-séparation sur la colonne. Rincez le tube avec trois millilitres de tampon PBE froid de glace fraîche et ajoutez le tampon au filtre de pré-séparation.Lavez la colonne quatre fois avec trois millilitres supplémentaires de tampon PBE glacé par lavage sans filtre, ce qui permet à la colonne de s’écouler complètement entre chaque lavage. Après le lavage final, déplacez la colonne dans un nouveau tube de 15 millilitres, et plongez cinq millilitres de PBE froid de glace fraîche à travers la colonne dans le tube. Pour déterminer les fractions des populations de tiges et de progéniteurs dans les cellules hématopoïétiques et progénitrices hématopoïétiques positives fraîchement isolées, recueillez les cellules par centrifugation et suspendez la pastille à une fois 10 à six cellules pour 50 microlitres de concentration tampon de cytométrie d’écoulement.Ensuite, transférez les cellules en aliquots de 50 microlitres par tube de tri cellulaire activé par fluorescence de cinq millilitres selon le protocole expérimental de coloration de cytométrie du flux. Ajoutez le cocktail d’anticorps approprié et la coloration vivante/morte aux cellules, en ajustant le volume à 100 microlitres totaux. Après 20 minutes dans l’obscurité à l’abri de la lumière, laver les cellules avec un millilitre de tampon de cytométrie d’écoulement frais par tube, et de suspendre à nouveau les cellules dans 500 microlitres de tampon de cytométrie d’écoulement frais par tube.Ensuite, analyser les cellules sur un cytomètre d’écoulement selon les protocoles cytométriques d’écoulement standard. Pour différencier la microbille isolée de cellules souches et progénitrices cd34 positives en cellules de lignée myéloïde, enduire d’abord les puits d’une plaque stérile et non encolée de 48 puits avec 200 microlitres par puits de solution de fibronectine humaine recombinante en PBS pendant deux heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, jeter la solution de fibronectine de chaque puits et bloquer les puits avec 200 microlitres d’albumine sérique bovine à 2 %.Après 30 minutes à température ambiante, laver les puits deux fois avec 500 microlitres de PBS stérile par lavage. Suspendre à nouveau les cellules positives CD34 fraîchement isolées à cinq fois 10 les cinq cellules par millilitre de concentration moyenne de stimulation chaude. Ensuite, les graines 200 microlitres de cellules dans chaque puits de la plaque enduite de fragment de fibronectine et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures.À la fin de l’incubation, recueillir les cellules avec pipetting doux, et laver les puits avec 500 microlitres de chaud Dulbecco modifié Eagle moyen, la mise en commun des lavages avec la suspension cellulaire. Après comptage, re-suspendre les cellules à un 2,5 fois 10 aux quatre cellules par millilitre de différenciation myéloïde concentration moyenne. Couche 200 microlitres de cellules cd34 positives par puits dans une cellule stromal MS-5 ensemencée 48 plaque de culture de tissu de puits.Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire, remplaçant doucement 100 microlitres du supernatant dans chaque puits avec 100 microlitres de milieu de différenciation myéloïde 2X frais tous les trois à quatre jours. Le jour 21, récoltez les cellules pour l’analyse de l’expression de marqueur de lignée myéloïde par cytométrie d’écoulement comme juste démontré. Le pourcentage typique de cellules positives CD34 totales isolées du sang de cordon ombilical par séparation des microbilles selon les fourchettes démontrées entre 80 et 90%Analyse immunophénotopypique révèle que ces cellules positives CD34 se composent généralement d’une lignée négative CD34 positive CD34 positive CD38 population négative de cellules souches hématopoïétiques et d’une lignée négative cd34 positive CD38 positive population de cellules progénitrices multi-puissantes.Dans la population multi-puissante de cellules progénitrices, environ 25% des cellules expriment des marqueurs progéniteurs myéloïdes communs, environ 15% expriment des marqueurs progéniteurs de monocyte de granulocyte, et environ 56% expriment des marqueurs d’ancêtre érythroïde de mégakaryocyte. L’immunophéotypage démontre également que le pourcentage de cellules cd34 positives passe d’environ 90 % à l’isolement à moins de 25 % le jour 21. L’analyse de la population négative de CD34 démontre une augmentation concomitante du pourcentage de cellules exprimant des marqueurs myéloïdes matures de lignée.En outre, les cellules tachées wright-giemsa démontrent des caractéristiques morphologiques distinctes les jours un et 21 avec les cultures indifférenciées présentant de grands noyaux ronds et très peu de cytoplasme et les cultures différenciées affichant des caractéristiques morphologiques des cellules de lignée comprenant qui sont des monocytes, des granulocytes, et des érythroblastes. N’oubliez pas de verser le sang de cordon dilué sur le milieu de fractionnement cellulaire mononucléaire sans mélanger les couches, et ne pas déranger les cellules sM-5 et CD34 positives lors du changement du milieu. Suivant ce protocole de différenciation, les cultures cellulaires positives CD34 peuvent être analysées pour les changements morphologiques, les effets apoptotiques, les changements dans les modèles de cycle cellulaire, et le degré de différenciation.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Une méthode pour analyser la distribution des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse par cytométrie en flux ainsi que d'isoler efficacement hautement purifiées de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est décrite. La procédure d'isolement est essentiellement basée sur l'enrichissement magnétique des cellules + c-kit et de tri cellulaire pour purifier CSH pour des études cellulaires et moléculaires.

Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

Cette vidéo démontre une technique de différenciation des mégacaryocytes et de formation des plaquettes. Les cellules souches progénitrices hématopoïétiques – isolées du sang de cordon ombilical humain – se différencient en mégacaryocytes matures en présence de thrombopoïétine. Les mégacaryocytes matures produisent des extensions cytoplasmiques appelées proplaquettes, qui donnent naissance à des plaquettes individuelles.

Méthode in vitro pour la différenciation des mégacaryocytes et la formation plaquettaire

Nous décrivons ici un protocole pour isoler des sous-ensembles de précurseurs des lymphocytes B du sang de cordon ombilical. Une quantité suffisante et de qualité des acides nucléiques peut être extrait des cellules et utilisées dans des essais ultérieurs en utilisant l'ADN ou de l'ARN.

Isolement des précurseurs des cellules B des sous-ensembles à partir de sang de cordon ombilical

Une méthode a été développée afin de dériver directement des cellules souches neuronales humaines à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies de cellules du sang périphérique.

Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

Nous présentons ici pluripotentes humaines protocoles de culture de cellules souches (hPSC), utilisés pour différencier les hPSCs en CD34+ progéniteurs hématopoïétiques. Cette méthode utilise la manipulation spécifique au stade de canonique WNT de signalisation indiquer les cellules exclusivement pour le programme hématopoïétique de définitif ou primitif.

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

Une population très pure de mégacaryocytes peut provenir de cordon dérivés du sang CD34+ cellules. Une méthode pour CD34+ la différenciation des cellules d’isolement et mégacaryocyte est décrite ici.

Différenciation du mégacaryocyte et plaquettes Formation de l’homme cordon CD34 dérivés du sang des cellules+

Nous démontrons comment identifier et isoler les 6 sous-ensembles de progéniteurs myéloïdes de murins de la moelle osseuse à l’aide d’une combinaison de magnétique et de la fluorescence de tri (MACS et FACS). Ce protocole peut être utilisé pour les essais de culture in vitro (cultures de méthylcellulose ou liquide), des expériences in vivo transfert adoptif et analyses ARN/protéines.

Identification et isolement des Oligopotent et des progéniteurs myéloïdes Lineage-commis de moelle osseuse de souris

Nous décrivons ici l’ex vivo expansion des cellules souches hématopoïétiques CD34+ cellules provenant du sang de cordon ombilical traitement avec une combinaison d’un cocktail de cytokine et l’APV. Cette méthode conduit à un degré significatif d’expansion ex vivo de csh primitif des deux cliniques ou les applications de laboratoire.

Expansion ex Vivo de cellules souches hématopoïétiques CD34 de dérivés du sang de cordon ombilical humain+ des cellules à l’aide de l’acide valproïque

Ici, nous présentons un protocole pour former précisément l'endothélium hémogène à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans une condition sans mangeoire et sans xéno. Cette méthode aura de larges applications dans la modélisation des maladies et le dépistage des composés thérapeutiques.

Différenciation hémogénique de l'endothélium par des cellules souches pluripotentes humaines dans une condition définie sans mangeoire et sans xéno

Présenté ici est une technique basée sur la cytométrie de flux qui permet de mesurer simultanément le nombre de divisions cellulaires, le phénotype des cellules de surface et la parenté cellulaire. Ces propriétés peuvent être testées statistiquement à l’aide d’un framework basé sur la permutation.

Évaluation simultanée de la parenté, du numéro de division et du phénotype par cytométrie en flux pour les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices

La modélisation de l’érythropoïèse offre une occasion précieuse de comprendre l’importance biologique des acteurs de ce processus et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles d’atténuer les défauts de différenciation. Nous décrivons ici une méthode simple et fiable pour différencier efficacement les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices CD34+ ex vivo.

Un pipeline complet pour évaluer l’efficacité de l’érythropoïèse humaine in vitro et ex vivo

Découvrez la différenciation pan-myéloïde des cellules CD34+ du sang de cordon humain. Cette méthode permet d'étudier les quatre lignées myéloïdes et l'impact des mutations sur l'hématopoïèse.

Différenciation pan-myéloïde du sang de cordon humain Dérivé CD34^- Cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice

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