Induire et caractériser la stéatose vésiculaire dans des cellules HepaRG différenciées

Ce protocole décrit comment induire la stéatose vésiculaire de foie dans les cellules différenciées d’HepaRG et les méthodes pour la détection et la quantification de l’accumulation de lipide. Ce modèle de cellules humaines in vitro représente une alternative précieuse aux modèles de souris in vivo et aux hépatocytes humains primaires. Décongeler un lot de cellules HepaRG cryopréservées à faible passage d’azote en les immergeant dans un bain de 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient décongelées.

Transférer rapidement les cellules dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu proliférant. Après avoir centrifugé pendant cinq minutes, jeter le supernatant et resuspendre les cellules en cinq millilitres de milieu proliférant. Comptez les cellules et diluez pour plaquer 250 000 cellules par centimètre carré.

Plaquez les cellules sur des plats de culture cellulaire de 100 millimètres et renouvelez le milieu tous les deux ou trois jours. Les cellules prolifèrent avec un temps de doublement d’environ 24 heures. Une fois que les cellules HepaRG atteignent 80% de confluence, détachez-les par une incubation de trois à cinq minutes avec une solution trypsine de 0,05%.

Recueillir les cellules en proliférant moyen et centrifugeuse pendant cinq minutes comme avant. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules avec cinq millilitres de milieu proliférant. Encore une fois, comptez les cellules et diluez afin de plaquer 250 000 cellules par centimètre carré.

À ce stade, amplifier les cellules en répétant ces étapes pour atteindre un nombre approprié de cellules pour commencer des expériences. Pour cryopréserver les cellules HepaRG, détachez les cellules 24 heures après le placage à travers une incubation de trois à cinq minutes avec une solution trypsine de 0,05%. Recueillir les cellules en proliférant moyen et centrifugeuse pendant cinq minutes comme avant.

Jeter le supernatant, resuspendre les cellules en un millilitre par lot de milieu de congélation, et cryopréserver les lots dans de l’azote liquide. Le jour zéro, les cellules hépaRG de graines à 250.000 cellules par centimètre carré dans des plats traités par culture avec un volume approprié de milieu de prolifération. Deux plats doivent être plaqués pour chaque analyse, un pour les cellules de contrôle et un pour les cellules traitées à l’oléate.

Le deuxième jour et le quatrième jour, changer le milieu avec un volume approprié de milieu de prolifération et laisser les cellules se développer jusqu’à ce qu’elles atteignent la confluence. Le septième jour, les cellules doivent être 100% confluentes. Lavez les cellules une fois avec 1X PBS.

Ensuite, retirez le 1X PBS et ajoutez un volume approprié de support de différenciation. Les jours huit, neuf, 12, 15 et 18, lavez les cellules une fois avec 1X PBS avant d’ajouter un volume approprié de milieu de différenciation. Le jour 21, observez les cellules HepaRG au microscope et assurez-vous que les cellules sont des cultures différenciées confluentes.

En tant que contrôle, récoltez un plat de contrôle pour effectuer l’analyse de l’expression génétique des gènes marqueurs de différenciation. Au jour 21, les cellules HepaRG différenciées peuvent être cryopréservées dans de l’azote liquide. Le jour 21, diluer l’oléate de sodium avec un volume approprié de milieu de différenciation complète à une concentration finale de 250 micromolaires.

Ajouter 99% de méthanol à un rapport de un à 400 dans un autre aliquot de milieu de différenciation pour faire le traitement de contrôle du véhicule. Lavez les cellules une fois avec 1X PBS et ajoutez le véhicule ou le milieu d’oléate de sodium. Le jour 23 et le jour 25, changez le milieu avec le volume approprié de milieu fraîchement préparé.

Le jour 26, observez les cellules par microscopie optique. Les gouttelettes lipidiques s’accumulent dans les cellules traitées à l’oléate de sodium et sont facilement visibles sous forme de gouttelettes translucides dans le cytoplasme. Pour effectuer la coloration oil red o, lavez d’abord les cellules une fois avec 1X PBS et retirez complètement le 1X PBS.

Ajouter 4% de paraformaldéhyde et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Retirer le paraformaldéhyde et laver les cellules deux fois avec 1X PBS. Après avoir enlevé le PBS, incuber les cellules avec 60% d’isopropanol pendant cinq minutes à température ambiante.

Retirer l’isopropanol et laisser sécher complètement les cellules à température ambiante. Maintenant, ajoutez la solution de travail Oil Red O aux cellules et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Le volume de solution de travail requis pour chaque échantillon correspond au volume de supports utilisés pour la culture des cellules.

Retirer la solution Oil Red O et ajouter immédiatement de l’eau double distillée. Après avoir lavé les cellules quatre fois avec de l’eau double-distillée, acquérir des images sous le microscope pour analyse. Pour ésiguer le colorant Oil Red O, retirer toute l’eau et laisser sécher.

Ensuite, ajouter un millilitre de 100% isopropanol et incuber pendant 10 minutes avec des secousses douces à température ambiante. Pipette l’isopropanol avec de l’huile eluted Red O colorant de haut en bas à plusieurs reprises, en veillant à ce que tout l’huile rouge O est dans la solution. Transférer la solution dans une cuvette.

Mesurez la densité optique à 500 nanomètres par spectrophotométrie et utilisez 100% isopropanol comme blanc. Lavez les cellules une fois avec 1X PBS. Puis, incuber avec 100 nanomolaires de Bodipy dilués en 1X PBS dans l’obscurité pendant 40 minutes à 37 degrés Celsius.

Un contrôle non taché doit être inclus dans les mesures de cytométrie du débit. Retirez la solution de coloration et lavez les cellules une fois avec 1X PBS. Ensuite, lavez les cellules à nouveau et retirez complètement le PBS.

Ajouter 4% de paraformaldéhyde et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Retirer le paraformaldéhyde et laver les échantillons trois fois pendant cinq minutes dans PBS. Les cellules peuvent être conservées en 1X PBS à quatre degrés Celsius ou photographiées immédiatement.

Pour le rangement, envelopper de Parafilm et couvrir de papier d’aluminium pour empêcher les cellules de sécher. Pour vérifier l’induction efficace de la stéatose, les cellules hépaRG traitées à l’oléate et de contrôle ont été tachées de colorant Oil Red O. Après coloration, les gouttelettes lipidiques sont facilement visibles sous forme de gouttelettes rouges.

La coloration peut être quantifiée par mesure spectrophotométrique du colorant Oil R O élit avec de l’isopropanol. L’absorption de l’huile élitée Rouge O des cellules est directement proportionnelle à l’accumulation de gouttelettes lipidiques cytoplasmiques. La concentration d’oléate de sodium et le temps d’exposition ont été déterminés par l’essai colorimétrique de viabilité de cellules de MTT.

Le produit Formosan est quantifié par son absorption à 490 nanomètres et est directement proportionnel au nombre de cellules vivantes en culture. Le traitement d’oléate de sodium a été comparé au traitement de palmitate de sodium. Le médicament apoptotique doxorubicine a été utilisé comme un contrôle.

Pour quantifier l’augmentation de la teneur en lipides cellulaires après le traitement de l’oléate de sodium, la coloration avec le colorant Bodipy a été utilisée pour étiqueter les gouttelettes lipidiques. À l’aide de l’analyse cytofluorométrique, il est possible de quantifier la teneur en triglycérides par intensité fluorescente moyenne corporelle, qui est plus élevée dans les cellules traitées aux oléate que dans les cellules de contrôle. Ceci indique l’accumulation efficace de graisse après traitement d’oléate.

En effet, des images de cellules tachées de bodipy montrent des gouttelettes fluorescentes vert vif de lipide dans les cellules oléate-traitées qui ne sont pas visibles dans les cellules de contrôle. Pour caractériser davantage l’accumulation de gouttelettes lipidiques après le traitement de l’oléate de sodium, la microscopie CARS peut être effectuée comme décrit dans le protocole textuel qui permet la quantification des gouttelettes lipidiques sans étiquetage. Ce modèle basé sur les cellules peut accroître la connaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans la stéatose hépatique non oncotique et pourrait conduire à la mise au point de nouveaux marqueurs pour le diagnostic précoce et de nouvelles stratégies de traitement.