Analyse comparative des lésions par une approche de séquençage ciblée

Notre protocole permet la capture de la relation génétique entre les lésions primaires et métastatiques par l’identification des altérations moléculaires impliquées dans la progression de la maladie. Notre méthode offre l’occasion d’explorer la relatedness génétique dans l’échantillon clinique avec la sensibilité et la spécificité élevées. Ceci est dû à l’intégration de l’analyse moléculaire et histopathologique.

L’évaluation de l’hétérogénéité intratumorale dans le domaine de la recherche sur le cancer est d’une importance primordiale dans la conception de stratégies antitumorales efficaces et notre méthode est largement applicable à de nombreux types de tumeurs solides. Après avoir préparé et quantifié les bibliothèques d’intérêt, diluer chaque bibliothèque à une concentration de 100 picomolaires dans de l’eau sans nucléase et combiner 10 microlitres de chaque bibliothèque diluée pour une seule fois en un seul tube. Ensuite, mélanger les bibliothèques poolées par pipetting.

Pour lancer une course de séquençage, ouvrez d’abord le navigateur Torrent sur un ordinateur connecté au système de séquençage. Planifiez une nouvelle série à l’aide du modèle générique pour l’application sélectionnée et sous l’onglet kits sélectionnez le système Ion Proton ou le système Ion Gene Studio S5. Sélectionnez la puce appropriée dans le menu dropdown de type puce et sélectionnez Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit à partir de la liste de dropdown de la trousse de bibliothèque.

Sélectionnez le bouton Ion Chef pour le kit de modèle et sélectionnez le kit chef approprié à partir de la liste de dropdown du kit de modèle. Sélectionnez le kit de séquençage approprié dans le menu dropdown du kit de séquençage et sélectionnez Ion Express à partir de la liste de dropdown définie par code à barres. Sous l’onglet plugin, sélectionnez le plugin d’analyse de couverture.

Sous l’onglet plan, sélectionnez le génome GRCH37HG19 de la liste de dropdown de la bibliothèque de référence. À partir de la liste de dropdown des régions cibles, sélectionnez le panneau approprié à séquencer. Réglez ensuite le nombre de codes à barres à séquencer et définissez le nom du code à barres et le nom de l’échantillon pour chaque bibliothèque.

Pour une dilution des bibliothèques mise en commun, diluer la bibliothèque de stock avec de l’eau sans nucléase à une concentration de 25 picomolaires pour une puce de proton iion et pipette 50 microlitres de chaque bibliothèque diluée au fond du tube d’échantillon approprié de la bibliothèque. Chargez les tubes d’échantillon contenant les bibliothèques diluées poolées sur le système de préparation de la bibliothèque et démarrez l’amplification clonale. Pour le séquençage de prochaine génération, suivez les instructions à l’écran pour para parasénaliser l’instrument.

Lorsque l’amplification clonale est terminée, ouvrez la porte de l’instrument Ion Chef, puis ouvrez le couvercle de la centrifugeuse de chargement des copeaux et retirez les deux puces du système de préparation de la bibliothèque. Placez les copeaux dans des contenants de rangement séparés et chargez l’un des copeaux dans le compartiment à copeaux de l’instrument. Fermez ensuite le couvercle du compartiment à copeaux et commencez le séquençage.

Pour l’analyse des mutations, ouvrez le plugin d’analyse de couverture et utilisez la sortie d’analyse de couverture pour vérifier la profondeur de la couverture et l’uniformité. Utilisez le plugin Torrent Variant Caller pour effectuer la variante appelant en sélectionnant la lignée germinale ou le flux de travail somatique, le cas échéant. Téléchargez ensuite des variantes filtrées de fichiers de format d’appel variante et utilisez le logiciel prédicteur d’effet variante dans la base de données REFSeq NCBI pour annoter les variantes.

Pour estimer les variations du nombre de copies, utilisez le plugin d’uploader ion reporter pour charger les données de séquençage dans le logiciel de reporter iion et utiliser le flux de travail complet de la paire normale de tumeurs du panneau de cancer pour analyser les données. Filtrez manuellement les mutations et les variations de numéro de copie en fonction des scores attribués par le logiciel et vérifiez visuellement les variations avec la visionneuse génomique intégrative. Inspectez ensuite visuellement l’alignement pour décelez les lectures inhabituelles qui peuvent générer des appels artefacts et inspectez la couverture normalisée de tous les amplicons d’un gène donné par rapport à la couverture normalisée de la ligne de base pour vérifier les variations du nombre de copies.

Pour chaque cas, indexer les appels de mutation du séquençage du tissu normal ou du sang ou de la tumeur primaire ou de la métastase. Signaler comme ligne germinale et rejeter les appels qui sont également évidents à partir des données de séquençage de l’ADN de la lignée germinale. Marquer comme clonal ou fondateur les mutations qui sont partagées entre toutes les lésions d’un patient donné.

Puis signaler comme sous-clonal ou progresseur les mutations qui sont détectées dans certaines, mais pas toutes les lésions d’un patient donné. Dans cette expérience représentative, le séquençage multi-lésion de cinq cas pseudopapillary solides de néoplasme ciblant les séquences de codage de 409 gènes cancer-connexes a identifié un total de 27 mutations somatiques dans huit gènes. Les mutations ont été définies comme fondatrices ou clonales lorsqu’elles sont partagées entre toutes les lésions d’un patient donné et d’un progresseur ou d’un sous-continent lorsqu’elles sont détectées dans certaines lésions, mais pas toutes, d’un patient donné.

Uniformément, la coloration immunohistochemical pour le bêta-caténine et KMD6A était homogène parmi les lésions diverses des cas avec des mutations des gènes correspondants. La coloration modérée de KMD6A chez les spécimens mutés suggère que l’altération génétique est susceptible de modifier la fonction plutôt que l’expression de la protéine. La perte de fonction kmd6A dans les tumeurs pancréatiques est associée à la régulation vers le haut du marqueur d’hypoxie GLUT-1.

Et en conséquence, GLUT-1 a été sur-exprimé dans les cas portant des mutations KMD6A. L’immunohistochimie pour BAP1 et TP53 a confirmé que les mutations dans ces gènes étaient subclonales. Dans ce karyotype virtuel d’un cas représentatif montrant l’emplacement, la proximité et l’état du numéro de copie des gènes modifiés, l’analyse de variation du nombre de copies à l’aide de données de séquençage a révélé des altérations dans tous les spécimens analysés.

Et contrairement aux mutations ponctuelles, la majorité des modifications de variation de copie-nombre étaient sous-clonales. La validation et l’indexation des mutations et la variation de copie-nombre et utilisant la comparaison normale d’ADN de tumeur sont importantes pour éviter la génération des appels artifactual qui pourraient invalider les résultats. Cette procédure pourrait également être appliquée à des études de séquençage du génome entier visant à interroger l’ensemble du génome pour l’identification de la mutation entre la lésion de différents types de tumeurs solides.

Dans le domaine de la recherche sur le cancer, ces techniques sont des outils essentiels pour comprendre la biologie des maladies ayant d’importantes implications cliniques visant à concevoir des thérapies ciblées personnalisées et efficaces.