Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Ce protocole permet un temps rapide et très pénétrant et des knock-outs génétiques limités dans l’espace dans les cellules souches neurales de la moelle épinière axolotl pour l’étude des mécanismes moléculaires de la régénération de la moelle épinière. Cette technique permet l’étude de la fonction génétique dans les cellules souches neurales, sa régénération médicale sans être confondue par des effets développementaux ou des effets d’autres types de cellules. Les cellules souches neurales axolotl contribuent en grande partie à leur capacité à régénérer leur moelle épinière.

Comprendre les mécanismes de régénération pourrait mener à des idées pour développer des traitements pour les lésions de la moelle épinière humaine. Cette méthode donne un aperçu de la façon dont les cellules souches neurales axolotls montent une réponse régénératrice aux lésions de la moelle épinière. Le positionnement correct du capillaire d’injection dans la colonne centrale de moelle épinière peut être difficile et la pratique sur des animaux d’essai aide avec la maîtrise de la technique.

L’affichage de l’administration peut montrer comment effectuer l’injection et à quoi ressemble une injection réussie. Pour préparer le mélange de protéines ribonucléaires à ARN guide Cas9, mélangez cinq microgrammes de protéines de séquence de localisation nucléaire Cas9, quatre microgrammes d’ARN guide et 0,9 microlitre de tampon Cas9 10X. Ensuite, apportez le volume total à 10 microlitres avec de l’eau sans nucléase et stockez le mélange de protéines ribonucléaires à ARN guide Cas9 à moins 80 degrés Celsius s’il n’est pas utilisé immédiatement.

Pour la préparation des plaques d’électroporation agarose, préparer 200 millilitres de 2% d’agarose dans le PBS de Dulbecco et dissoudre le mélange au micro-ondes. Après un léger refroidissement, verser l’agarose liquide dans des boîtes de Pétri de 10 centimètres à une profondeur d’environ 10 millimètres et permettre aux assiettes de se solidifier à température ambiante. Lorsque l’agarose est ferme au toucher, utilisez un scalpel chirurgical pour couper une fente dans l’agarose de chaque plat pour tenir la queue droite, un puits pour s’adapter au corps de l’animal, et deux puits supplémentaires pour tenir les électrodes.

Placez ensuite les plaques sur la glace et remplissez-les sur la jante avec du DPBS glacé. Pour configurer l’électroporateur, réglez l’impulsion poreuse sur une impulsion bipolaire à 70 volts d’une durée de cinq millisecondes, d’un intervalle de 50 millisecondes et d’aucune pourriture de tension. Réglez l’impulsion de transfert à quatre impulsions bipolaires de 40 volts d’une durée de 50 millisecondes, d’un intervalle de 999 millisecondes et d’une pourriture de tension de 10 %.

Connectez ensuite les électrodes à l’électroporateur et ajustez les pinces de sorte qu’elles soient séparées de sept millimètres avant de submerger les électrodes dans un bécher de PBS. Pour préparer des capillaires de micro-injection en verre, effectuez un test de rampe sur un puller de micropipette selon les instructions du fabricant pour déterminer la valeur thermique. Tirez ensuite les capillaires d’injection avec des extrémités coniques avec les paramètres indiqués.

Après avoir tiré, utilisez un microscope stéréo et des forceps fins pour briser le capillaire à un angle de sorte qu’il a une pointe inclinée à une position où la pointe est assez mince pour cibler le canal central de la colonne vertébrale axolotl tout en restant assez fort pour percer la peau. Avant de charger la pointe, ajouter la solution FCF vert rapide au mélange de protéines ribonucléaires à un rapport d’un à 30 et utiliser une pointe de pipette de chargement de gel pour charger environ cinq microlitres du mélange d’injection dans le capillaire. Montez ensuite le capillaire sur la pompe pneumatique avec la pointe inclinée orientée vers le bas.

Pour configurer la pompe pneumatique, réglez la prise à 0,5 livres par pouce carré, l’éjection à deux livres par pouce carré tenir, et la durée à gated. Pour tester les réglages capillaires et de la pompe, trempez le capillaire dans une goutte d’eau et appuyez sur la pédale pour l’injecter. Le mélange d’injection devrait sortir dans un flux lent mais régulier.

Pour injecter le mélange de protéines ribonucléaires, retournez les axolotls à injecter à l’envers dans l’eau pour confirmer la sédation et utilisez des forceps d’anneau pour transférer un animal sur un lit de silicone avec le côté gauche de l’animal orienté vers le haut et la queue pointant vers la droite. Placez le site d’injection au milieu du champ de vision du microscope stéréo et ajustez le micromanipulateur de sorte que le capillaire pénètre dans l’animal à un angle de 60 degrés du côté droit du champ de vision. Après avoir identifié la moelle épinière et le canal central, déplacez lentement le capillaire vers le canal central de la moelle épinière jusqu’à ce qu’il perce doucement la peau et le muscle.

Lorsque le capillaire est en position, appuyez et maintenez la pédale pour injecter le mélange dans le canal central. Si le capillaire a été correctement placé, le mélange de protéines ribonucléaires se propagera le long du canal central comme une ligne bleue dans les deux directions. Il peut être difficile de positionner le capillaire correctement.

Si le mélange ne se propage pas correctement, ajustez la position capillaire en petits pas tout en gardant le pavé pressé. Continuer à maintenir la pédale jusqu’à ce que le mélange atteigne la vésicule terminale à l’extrémité de la moelle épinière et les ventricules dans le cerveau. Il peut être nécessaire d’ajuster la pression d’éjection pendant l’injection.

Immédiatement après l’injection, utilisez des forceps d’anneau pour transférer l’animal sur la plaque d’électroporation agarose préparée sur la glace et placez la queue à l’intérieur de la fente afin qu’elle soit prise en sandwich par l’agarose. Placez les électrodes dans les puits des deux côtés de la queue, en prenant soin que l’animal entier et les électrodes sont recouverts de PBS glacé et appuyez sur l’interrupteur du pied pour commencer l’électroporation. Puis remettre l’animal à l’eau avec surveillance jusqu’à ce que le rétablissement complet et injecter et électroporer les animaux suivants de la même manière.

Pour évaluer l’efficacité du knock-out au niveau des protéines, obtenir une section transversale de la queue et effectuer une analyse immunohistochimique selon les protocoles standard. Sinon, extraire la moelle épinière électroporée et lyser l’échantillon pour obtenir l’ADN. Effectuez ensuite le génotypage PCR suivi du séquençage Sanger ou du séquençage de prochaine génération pour évaluer le pourcentage de loci génétiques édités.

L’injection et l’électroporation des complexes d’ARN guide cas9 contre Sox2 dans le canal central de la moelle épinière axolotl conduit à une perte massive de l’immunoréactivité Sox2 dans la majorité des cellules souches neurales de la moelle épinière ont comparé l’injection et l’électroporation des complexes d’ARN guide Cas9 contre la tyrosinase comme un contrôle. La quantification des cellules sox2-positives dans les échantillons de section de tissu de moelle épinière indique un nombre sensiblement réduit de cellules Sox2-exprimant dans cas9 Sox2 guident des animaux knock-out d’électroporation d’ARN, indiquant que cette méthode mène à un gène efficace et fortement pénétrant knock-out dans les cellules souches neurales de moelle épinière. Après l’injection simultanée et l’électroporation de deux complexes d’ARN guide Cas9 contre Sox2 et GFP en axolotls transgéniques avec l’expression omniprésente de GFP, un pourcentage élevé de cellules souches neurales à double knock-out est observé, indiquant que le protocole peut être utilisé pour assommer de manière flexible plusieurs gènes.

Il est utile de pratiquer le ciblage du canal central avec un capillaire et de mettre sur la formule avec les étapes de dépannage pour quand l’injection ne fonctionne pas comme prévu. Cette technique permet aux chercheurs d’étudier les fonctions des gènes dans les cellules souches neurales qui sont spécifiques à la régénération. Prenez soin lors de la manipulation du capillaire et assurez-vous de ne pas poignarder vos propres doigts.