Imagerie intravitale des lymphocytes intraépithéliales dans l'intestin grêle de Murine

La microscopie intravitale de la petite muqueuse intestinale peut fournir un aperçu de la dynamique spatiotemporale des interactions cellulaires dans l’épithélium entre différents types de cellules immunitaires, ou entre ces deux compartiments. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’acquisition d’images à grande vitesse et haute résolution dans la muqueuse intestinale en temps réel. L’imagerie en direct de l’intestin peut fournir un aperçu supplémentaire des interactions cellulaires, ou de la signalisation cellulaire impliquée dans l’immunité muqueuse, la biologie épithéliale ou la biologie du cancer.

Il s’agit d’une méthode difficile qui nécessite la pratique de la technique chirurgicale, ainsi que la patience et le positionnement optimal de la souris pour l’acquisition d’images. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils chez une souris transgénique anesthésiée, exprimant une protéine fluorescente verte améliorée, ou EGFP, récepteur gamma-delta des lymphes T, utilisez une seringue de tuberculine pour injecter lentement 200 microlitres de hoechst 33342 Dye Solution fraîchement préparé dans le sinus veineux rétro-orbital. Une à deux minutes après l’injection, appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal pour l’empêcher de se dessécher.

Ensuite, faire une incision verticale de 2CM à travers la peau et le péritoine, le long de la ligne médiane du bas-ventre et utiliser des forceps inclinés pour tirer soigneusement le caecum hors de la cavité péritonéale. Identifiez une zone de 2-3CM de l’intestin grêle qui contient le contenu fécal minimal, prenant soin de ne pas déchirer les vaisseaux sanguins mésentériques, et retournez soigneusement le caecum et l’intestin grêle restant à la cavité péritonéale, laissant le segment d’intérêt externalisé. En plaçant deux paires de forceps de chaque côté de la mesenterie de soulignement entre les vaisseaux sanguins, frottez doucement les extrémités des forceps ensemble pour créer un trou dans la membrane.

À l’aide de forceps inclinés et d’une aiguille à point fuselé incurvé fixée à une suture de 5 CM, pénétrer d’un côté du péritoine à travers le trou de la membrane, et de l’autre côté de la doublure péritonéale, en plaçant une suture en haut, et un autre près du bas de l’incision pour fermer l’incision, tout en gardant la boucle de l’intestin externalisé. Pour augmenter les chances de succès, ne pas attacher ou déchirer les vaisseaux sanguins tout en plaçant la suture abdominale et limiter toute manipulation extraneuse de l’intestin. Ensuite, fermez la peau sous la boucle intestinale de la même manière, en plaçant une suture au milieu de l’incision entre les sutures précédentes dans le péritoine de soulignement.

À l’aide d’une électrocauttérie, faire une ligne de perforation le long de la bordure antimesentrique et appliquer immédiatement quelques gouttes d’eau à la surface de l’intestin pour éviter d’autres dommages causés par la chaleur des tissus. Éponger avec un kimwipe pour enlever l’eau résiduelle. Utilisez des ciseaux vanna pour couper une fente horizontale d’environ 1,5 CM au bord distal du tissu cautérisé, le long de la longueur de la ligne cautérisée, vers l’extrémité proximale du segment des tissus externalisés.

Lorsque la surface muqueuse est exposée, couvrez l’abdomen d’un kimwipe humide pour garder le tissu hydraté. Pour spinning disk confoscopie confocale imagerie, transporter la souris au microscope dans un récipient couvert. Lancez le logiciel d’imagerie et inclinez la tête du microscope vers l’arrière, et ajoutez 150 microlitres de 1 micromolar flea Alexa Fluor colorant et Hank’s Buffered Saline Solution sur le fond glissé de la couverture de verre.

Placez la souris de sorte que la surface muqueuse ouverte entre directement en contact avec le coverslip. Placez la souris et le plat sur la scène de l’imagerie dans un incubateur préchauffé. Réglez l’intensité excitation et le temps d’exposition pour chaque laser à pas plus de 10-15 milliwatts et 120-150 millisecondes, respectivement, et ajuster la moyenne du cadre à 2.

Activez la fonction Gain multiplicant les électrons pour réduire le bruit de fond et sélectionnez l’étalonnage objectif 63X pour assurer une mesure correcte de la taille du pixel. À l’aide du laser à 405 nanomètres et de l’objectif d’air 20X, visualisez manuellement les noyaux pour localiser un champ de villosités qui manquent de mouvement ou de dérive notable, en évitant les zones de mouvement artifactual en raison de la respiration, de la péristalase ou du rythme cardiaque. À l’aide de l’analyse X-Y, enregistrez la coordination X-Y du champ d’intérêt et passez à l’objectif d’immersion de glycérol 63X.

Acquérir une image en direct sur le canal de 405 nanomètres pendant un jusqu’à 1 minute pour confirmer que les villosités dans le champ sélectionné sont stables, tout en ajustant la mise au point pour trouver le plan orthogonal juste sous la pointe villus. Puis acquérir z-stacks, à partir de juste en dessous de l’épithélium pointe villus, environ 15-20 micromètres jusqu’à ce qu’il soit difficile de résoudre les noyaux, en utilisant 1,5 micromètre-étapes. 3-5 minutes après le début de l’acquisition, confirmez la stabilité de l’image et la motilité des cellules intraepitheliales Gamma-delta, et continuez à acquérir des images pendant 30-60 minutes pour chaque champ de villosités.

Les lymphocytes intraepithelial gamma-delta présentent un comportement de surveillance dynamique, dans lequel ils patrouillent l’épithélium en migrant le long de la membrane du sous-sol et dans l’espace intercellulaire latéral à l’état d’étude. Dans ces images représentatives, les traces colorées indiquent les trajectoires migratoires des lymphocytes intraepithelial gamma-delta individuels au cours de 30 minutes. Bien que la fréquence des lymphocytes intraepithelial dans l’espace intercellulaire latéral ait été augmentée chez les souris traitées avec l’anticorps bêta de récepteur d’anti-interleukin-2, plus de 30% de ces lymphocytes intraepithelial gamma-delta ont exhibé un comportement de marche au ralenti.

Ce phénotype de marche au ralenti a été confirmé par une réduction significative de la vitesse instantanée et du rapport de confinement des lymphocytes intraepithelial gamma-delta, suivant le blocus interleukin-2-récepteur, par rapport aux contrôles. En outre, les lymphocytes intraepithelial gamma-delta inactifs ont eu des temps d’habitation plus longs, et ont été plus fréquemment localisés dans l’espace intercellulaire latéral, comparé aux lymphocytes intraepithelial de Gamma-delta motiles. Il peut être difficile d’identifier les champs de villosités qui manquent de mouvement excessif en raison de la péristase.

Le repositionnement de la souris peut aider à localiser un champ plus stable. Une analyse plus poussée des données de suivi cellulaire peut aider à identifier le comportement de motilité spécifique, ou à fournir des mesures supplémentaires pour mesurer les interactions cellulaires. L’imagerie intravitale et l’analyse de l’IEL-motilité sont devenues une lecture standard de la fonction IEL, fournissant un aperçu de la façon dont la signalisation immunitaire innée régule la fonction IEL gamma-delta.