Name: Formation de sphéroïdes cellulaires parodontaux humains sur Chitosan Films (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 14 s
Description: Découvrez la culture de sphéroïdes de cellules du ligament parodontal humain sur films de chitosane. Cette méthode 3D améliore l'auto-renouvellement et la différenciation ostéogénique pour la médecine régénérative.

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Cette étude a été parrainée par la National Natural Science Foundation of China (NSFC 81700978), les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (1504219050), la Natural Science Foundation of Shanghai (17ZR1432800) et le Shanghai Medical Exploration Project ( 17411972600).

Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité d'éthique de l'école et de l'hôpital de stomatologie de l'Université Tongji. Tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit.
1. Isolement cellulaire PDL
<ol><li>Faire le milieu de prolifération pour la culture des cellules de PDL : moyen de '-MEM complété avec 10% FCS et 100 stylo/streptocoque d'U/mL.</li>
	<li>Préparer un récipient avec de la glace pour transférer les troisièmes molaires isolées.</li>
	<li>Stériliser les instruments chirurgicaux à l'aide d'un autoclave.</li>
	<li>Extraire les troisièmes molaires humaines normales d'adultes (18-28 ans) à la clinique dentaire de l'école et de l'hôpital de stomatologie, Université tongji.</li>
	<li>Placer les troisièmes molaires dans le milieu de prolifération et les transférer en laboratoire à 4 oC.</li>
	<li>Placer la dent extraite dans un plat stérile de 100 mm de Petri, en travaillant dans une hotte à flux laminaire à risque biologique.</li>
	<li>Ajouter 10 ml de PBS pour laver la dent extraite. Répétez l'étape de lavage deux fois.</li>
	<li>En utilisant un scalpel stérile, séparer délicatement le PDL de la racine. REMARQUE : Le PDL doit être gratté à partir de la troisième partie moyenne de la racine pour éviter les contaminations par les tissus gingivals ou aphiles.</li>
	<li>Émincer la PDL en fragments de 1-2 mm à l'aide d'une lame de scalpel stérilisée.</li>
	<li>Placer les fragments de PDL dans un flacon de culture T-25, rempli de 3-4 mL de milieu de prolifération.</li>
	<li>Culture des échantillons dans un incubateur à 37 oC dans 5 % de CO2 avec de l'air humidifié.</li>
	<li>Changer le milieu de culture après que la croissance des cellules de PDL ait été observée. Il faut habituellement 1-2 semaines pour la excroissance des cellules PDL. Observez la excroissance des cellules PDL via un microscope de contraste de phase inverse.</li>
	<li>Changer le milieu de culture deux fois par semaine par la suite.</li>
	<li>Lorsque les cellules PDL ont atteint la confluence, les cellules de sous-culture à un rapport de 1:4 (passage 1).</li>
	<li>Observez la croissance cellulaire tous les jours et modifiez le milieu de culture deux fois par semaine.</li>
	<li>Effectuer chaque passage suivant à un rapport de 1:4 après que les cellules atteignent 80% de confluence. Utilisez la troisième à la cinquième génération de cellules PDL pour l'ensemencement cellulaire.</li>
</ol>2. Préparation de films chitosan
<ol><li>Pour la préparation d'une solution d'acide acétique de 1 % (v/v), ajouter 5 ml d'acide acétique à 495 ml d'eau double distillée dans un bécher en verre propre.</li>
	<li>Pour la préparation de 1% w/v solution chitosan, peser 5 g de poudre de chitosan (poids moléculaire moyen 400 kDa, 85% degré d'acétylation) et ajouter à 495 mL de 1% (v/v) solution d'acide acétique.</li>
	<li>Remuer la solution préparée pendant 24 heures avec la barre en remuant et la plaque de remuement magnétique à 60 oC.</li>
	<li>Autoclave la solution préparée pour assurer la dissolution complète du chitosan. REMARQUE : L'expérience peut être interrompue à ce stade.</li>
	<li>Pour former des films de chitosan, ajoutez 1% de solution de chitosan w/v dans les plats de polystyrène de culture tissulaire (TCPS) à 0.25 mL/cm2. Par exemple, ajoutez 0,5 mL de 1% de solution de chitosan w/v à un puits de 24 assiettes de puits.</li>
	<li>Sécher les plats TCPS dans un four à 60 oC pendant 24 heures pour former des films de chitosan.</li>
	<li>Préparer l'hydroxyde de sodium de 0,5 N (NaOH). Remuer 10 g de NaOH, un peu à la fois, dans un grand volume d'eau double distillée à l'aide de la barre magnétique, puis diluer la solution pour faire 0,5 L. REMARQUE : Ajoutez NaOH à l'eau - n'ajoutez pas d'eau à NaOH solide. Ne touchez pas à NaOH ! Il pourrait causer des brûlures chimiques.</li>
	<li>Neutraliser les films chitosan avec 0.5 NaOH. Ajouter 0,5 mL de solution NaOH de 0,5 N à un puits de 24 puits pendant 2 heures.</li>
	<li>Laver les films de chitosan trois fois avec de l'eau double distillée. REMARQUE : L'expérience peut être interrompue à ce stade.</li>
	<li>Avant l'ensemencement cellulaire, stériliser les plaques de 24 puits recouvertes de chitosan dans 70 % d'alcool pendant la nuit à température ambiante.</li>
	<li>Rincer les assiettes recouvertes de chitosan trois fois avec PBS à température ambiante.</li>
	<li>Stériliser les plaques enduites de chitosan par traitement sous la lumière ultraviolette pendant la nuit à température ambiante.</li>
</ol>3. Ensemencement cellulaire
<ol><li>Solution PBS de prolifération pré-chaude et solution trypsine/EDTA à 37 oC.</li>
	<li>Jeter le supernatant du flacon de culture cellulaire T-75.</li>
	<li>Laver les cellules PDL confluentes avec 10 mL de solution PBS.</li>
	<li>Jetez la solution PBS.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de solution trypsine/EDTA au flacon de culture cellulaire T-75.</li>
	<li>Incuber les cellules avec la solution trypsine/EDTA pendant 3 min à 37 oC.</li>
	<li>Terminer le processus de digestion de la trypsine en ajoutant 3 mL de milieu de prolifération à T-75 flacon de culture cellulaire.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire préparée dans un tube de centrifugeuse conique de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugelant la suspension pendant 5 min à 300 x g et température ambiante.</li>
	<li>Jetez le supernatant du tube conique de 15 ml de centrifugeuse et suspendez de nouveau le granule de cellule dans 500 L de milieu de prolifération.</li>
	<li>Comptez les cellules PDL avec un hémocytomètre.</li>
	<li>Cellules de PDL de graine aux densités de 0.5 x 104, 1 x 104, 3 x 104, et 6 x 104 cellules/cm2.</li>
	<li>Culture PDL cellules sur les films de chitosan dans un incubateur à 37 oC dans 5% CO2 avec de l'air humidifié.</li>
	<li>Changer le milieu de culture deux fois par semaine par la suite.</li>
	<li>Les jours 1, 2, 3, 4 et 5, observez la morphologie cellulaire quotidiennement par l'intermédiaire d'un microscope de contraste de phase inverse.</li>
</ol>4. Survie cellulaire
<ol><li>Après 1, 3 et 6 jours de culture, déterminer la survie des cellules à l'aide d'un kit de viabilité commerciale/cytotoxicité.</li>
	<li>Dans un tube de 15 ml, préparer 2 ml d'une solution fraîche de 2 mM de calcéine-AM et 4 mM d'homodimère d'éhidium en PBS en vortexant pendant 5 s. REMARQUE : Maintenez le processus dans l'obscurité.</li>
	<li>Retirez le milieu de culture et lavez les sphéroïdes dans le PBS.</li>
	<li>Incuber les sphéroïdes dans de PBS contenant 2 mM calcein-AM et 4 mM d'homodimère d'éthidium pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité.</li>
	<li>Rincer les sphéroïdes deux fois dans PBS. Pour les sphéroïdes d'un puits de 24 puits, utiliser 2 mL de PBS pour chaque fois.</li>
	<li>Observez les échantillons à l'aide d'un microscope à fluorescence à l'aide d'un grossissement de 10x ou de 20x.</li>
</ol>

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<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 9176357(2016).</li>
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<li>Miyagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+scaffold+induces+the+spheroid+formation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+progenitor+cells+and+promotes+efficient+adipogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).</li>
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<li>Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+as+antimicrobial+agent%3A+applications+and+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action.</a> Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La présente étude a introduit un système de culture de cellules 3D pour surmonter certaines limitations liées à la culture cellulaire monocouche 2D conventionnelle. Selon le protocole, les sphéroïdes cellulaires de PDL ont été avec succès formés par des cellules de culture sur des films de chitosan. Notre étude précédente a rapporté que la formation de sphéroïdes a augmenté les capacités d'auto-renouvellement et de différenciation ostéogénique des cellules de PDL14. Au lieu d'utiliser une enzyme p...

La parodontite, paraphée principalement par la plaque dentaire1, est caractérisée par les dommages des tissus parodontaux comprenant le ligament parodontal (PDL), l'os alvéolaire, et le ciment. Les traitements actuels pour la parodontite sont habituellement réussis à empêcher le progrès de la maladie active, mais la régénération des tissus parodontaux perdus demeure un défi clinique. Récemment, des progrès importants ont été réalisés dans les approches cellulaires pour la régénération des tissus parodontaux pour surmonter les inconvénients des traitements actuels2,3,4.
Notre examen systématique précédent a indiqué que les cellules dePDL ont montré le grand potentiel pour la régénération parodontale 5. Traditionnellement, les cellules PDL sont cultivées sur des substrats bidimensionnels (2D) tels que le polystyrène de culture tissulaire (TCPS). Cependant, des changements caractéristiques des cellules dePDL ont été observés pendant la culture in vitro 6. Ce phénomène est probablement dû au fait que le TCPS 2D diffère du microenvironnement tridimensionnel in vivo (3D)7. Comparé aux cellules cultivées sur des substrats 2D, les cellules cultivéesdans un microenvironnement 3D présentent plus de similitudes aux cellules in vivo 8. Par conséquent, les modèles de culture de cellules 3D fournissent une alternative prometteuse pour la culture cellulaire 2D conventionnelle de monocouche.
La méthode conventionnelle de culture 3D consiste à encapsuler les cellules dans des biomatériaux 3D. Comparé aux cellules encapsulées dans les biomatériaux 3D, les sphéroïdes cellulaires imitent la situation in vivo plus étroitement parce que les sphéroïdes sont des agrégats des cellules se développant exemptes des matériaux étrangers9,10,11, 12.Il est rapporté que les sphéroïdes cellulaires ont favorisé des bioactivités de MSC par la conservation des composants extracellulaires de matrice (ECM) comprenant la fibronectine et la laminin1. Pour améliorer les modèles conventionnels de culture cellulaire De PDL, nous avons récemment développé une méthode de culture de cellules 3D PDL, qui est basée sur la formation sphéroïde des cellules de PDL sur des films de chitosan14. La formation de Sphéroïdes a augmenté les capacités d'auto-renouvellement et de différenciation ostéogénique des cellules de PDL14. Ici, nous présentons les protocoles détaillés de culture sphéroïde de cellules de PDL basés sur des films de chitosan. Le système de culture 3D des sphéroïdes cellulaires de PDL surmontent quelques-unes des lacunes liées à la culture conventionnelle de cellules de TCPS, et ainsi peut être approprié pour produire des cellules de PDL avec une efficacité thérapeutique augmentée pour la régénération parodontale future de tissu.

<table><tbody><tr><td>&alpha ;-MEM</td><td>Gibco</td><td>11900-073</td><td></td></tr><tr><td>acide acétique&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64197</td><td></td></tr><tr><td>Gourde de culture cellulaire 25 cm2</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Gourde de culture cellulaire 75 cm2</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Heppe Medical&nbsp ; Chitosan GmbH</td><td>/</td><td>poids moléculaire 500 kDa, degré de désacétylation 85 %</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilité/cytotoxicité Vivant/mort</td><td>Moléculaire&nbsp ; Sondes</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310732</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>KeyGen Biotech&nbsp ;</td><td></td><td></td>KGB5001</tr><tr><td>stylo/streptocoque</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA&nbsp ;</td><td>KeyGen Biotech&nbsp ;</td><td></td><td></td>KGM25200</tr><tr><td>tube de centrifugation conique de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 24 puits</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr></tbody></table>

formation de sphéroïdes cellulaires parodontaux humains sur chitosan films

Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Les cellules parodontales de ligament (PDL) tiennent la grande promesse pour la régénération parodontale de tissu. Traditionnellement, les cellules PDL sont cultivées sur des substrats bidimensionnels (2D) tels que le polystyrène de culture tissulaire (TCPS). Cependant, des changements caractéristiques des cellules de PDL ont été observés pendant la culture in vitro. Ce phénomène est probablement dû au fait que le TCPS 2D diffère du microenvironnement tridimensionnel in vivo (3D). Comparées aux cellules cultivées sur des substrats 2D, les cellules cultivées dans un microenvironnement 3D présentent plus de similitudes aux cellules in vivo. Par conséquent, les modèles de culture de cellules 3D fournissent une alternative prometteuse pour la culture cellulaire 2D conventionnelle de monocouche. Pour améliorer les modèles conventionnels de culture cellulaire PDL, nous avons récemment développé une méthode de culture cellulaire 3D, qui est basée sur la formation sphéroïde de cellules PDL sur les films chitosan. Ici, nous présentons les protocoles détaillés de culture sphéroïde de cellules basés sur des films de chitosan. Le système de culture 3D des sphéroïdes cellulaires de PDL surmontent quelques-unes des limitations liées à la culture cellulaire conventionnelle de monocouche 2D, et peut ainsi être approprié pour produire des cellules de PDL avec une efficacité thérapeutique augmentée pour la régénération parodontale future de tissu.

Utilisant le protocole actuel, les sphéroïdes viables de cellules de PDL ont été avec succès formés. La figure 1 a montré que les cellules suspendues ou les sphéroïdes au lieu des cellules attachées étaient principalement observées sur des films de chitosan. Pour la densité d'ensemencement de 0,5 x 104 cellules/cm2, des cellules PDL attachées ont été occasionnellement trouvées le jour 1 et 3, et des sphéroïdes de cellules de PDL ont été ...

Ici, nous présentons des protocoles de culture des sphéroïdes cellulaires du ligament parodontal humain (PDL) par des films chitosan. La culture des sphéroïdes cellulaires tridimensionnels (3D) offre une alternative au système de culture de polystyrène de culture de tissu conventionnel (TCPS).

Formation de sphéroïdes cellulaires parodontaux humains sur Chitosan Films

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

Il s’agit d’un protocole détaillé de la culture des sphéroïdes des cellules ligamentaires parodontale par des films chitosan. Comparé au système conventionnel de culture, le système de culture sphéroïde produit des cellules parodontales de ligament avec des capacités accrues d’auto-renouvellement et de différenciation ostéogénique. Pour commencer, préparez une solution chitosan de 1 % de poids par rapport au volume, tel que dirigé dans le manuscrit.Ajouter 0,5 millilitres de solution chitosan dans chaque puits d’une plaque de polystyrène de culture tissulaire de 24 puits. Séchez la plaque dans un four à 60 degrés Celsius pendant 24 heures pour former des films chitosan. Pour neutraliser les films chitosan, ajouter 0,5 millilitres d’hydroxyde de sodium normal à chaque puits de la plaque de 24 puits et incuber à température ambiante pendant deux heures.Ensuite, lavez les films chitosan trois fois avec de l’eau double-distillée. Stériliser la plaque de 24 puits recouverte de chitosan dans 70% d’alcool pendant la nuit à température ambiante. Rincez la plaque trois fois avec du PBS puis laissez-la sous la lumière ultraviolette pendant la nuit.Avant l’ensemencement cellulaire, le milieu de prolifération préchauffé, la solution PBS et la solution trypsine EDTA à 37 degrés Celsius. Jetez le supernatant de la fiole de culture cellulaire et lavez le ligament parodontal confluent, ou cellules PDL, avec 10 millilitres de PBS. Jetez le PBS et ajoutez un millilitre de solution trypsine EDTA au flacon.Incuber le flacon à 37 degrés Celsius pendant trois minutes, puis ajouter trois millilitres de milieu de prolifération pour mettre fin à la digestion de la trypsine. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres, puis la centrifuger pendant cinq minutes à 300 fois g. Jetez le supernatant et suspendez les cellules en 500 microlitres de milieu de prolifération.Comptez les cellules avec un hémocytomètre et ensemencez-les sur la plaque à cinq, 10, 30 et 60 mille cellules par centimètre carré. Culture des cellules PDL dans un incubateur à 37 degrés Celsius dans 5% de dioxyde de carbone et d’air humidifié, en changeant le milieu de culture deux fois par semaine. Observez la morphologie cellulaire quotidiennement pendant cinq jours au moyen d’un microscope à contraste de phase inverse.Des sphéroïdes cellulaires PDL viables sont formés avec succès à l’aide de ce protocole. Les sphéroïdes sont rarement observés pour la densité d’ensemencement inférieure les jours un et trois. Mais aux deux densités plus élevées, différentes tailles de sphéroïdes sont présentes dès le premier jour.La densité optimale d’ensemencement est de 30 mille cellules par centimètre au carré parce qu’elle entraîne des sphéroïdes homogènes. Après cinq jours de culture, de plus grands sphéroïdes sont observés pour toutes les densités d’ensemencement. Un test de viabilité démontre que la majorité des cellules PDL sont vivantes les jours un, trois et six, mais le nombre de cellules mortes augmente le sixième jour.Une limitation de ce protocole est la prolifération diminuée des cellules après formation de sphéroïdes. Ainsi, d’autres études visant à promouvoir la prolifération des cellules après la formation de sphéroïdes sont nécessaires.

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