Name: Analyse dactivité sans anticorps pour lanalyse de lactivité de méthyltransferase dARN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Découvrez une méthode sans anticorps pour analyser l'activité des méthyltransférases d'ARN in vitro. Cette technique utilise la S-adénosyl-méthionine tritiée pour quantifier et visualiser la méthylation de l'ARN avec précision.

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Les auteurs tient à remercier le Dr Turja Kanti Debnath pour son aide à ChemDraw. La recherche dans le laboratoire xhemalçe est soutenue par le ministère de la Défense - Congressionally Directed Medical Research Program - Breast Cancer Breakthrough Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 et des fonds de démarrage de l'Institut de cellulaire et Molecular Biology et le College of Natural Sciences de l'Université du Texas à Austin, États-Unis.

1. Transcription in vitro et purification de gel de l'ARN cible
<ol><li>Clonez la séquence d'intérêt en plasmides contenant des promoteurs T7 et/ou SP6 en utilisant des techniques de clonage moléculaire établies12 ou des kits.</li>
	<li>La linéarisation du modèle d'ADN pour la transcription in vitro
	<ol>
<li>Amplifiez la séquence d'intérêt par PCR du plasmide avec des amorces conçues pour inclure la région de promoteur T7 par l'insertion, 20-30 bp en amont et en aval comme décrit précédemment13.</li>
		<li>Vous pouvez également digérer 5 g de plasmide à l'aide d'un site de coupe en zymace (RE) disponible en aval de l'encart selon les instructions fournies par le fournisseur de l'ER. REMARQUE : N'oubliez pas de vérifier que l'insert n'est pas coupé par l'ER sélectionné. La sélection de l'ER utilisée dans cette étape peut avoir une incidence considérable sur le rendement de la transcription. De préférence, linéarisez-vous avec une extrémité émoussée ou 5'-surplombant produisant RE pour éviter la commutation de modèle de la polymérase d'ARN T7 sur le brin d'ADN opposé14. Essayez des RE différents si les rendements initiaux sont insuffisants.</li>
	</ol></li>
	<li>Purifez l'ADN résultant à l'aide du kit pour l'extraction et le nettoyage du gel d'algrose d'ADN. Élichez l'ADN avec 30 l'eau.</li>
	<li>Bien mélanger par vortex, pipet 1,5 l et mesurer la concentration d'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre à microvolume.</li>
	<li>Utilisez 250 ng d'ADN pour vérifier la qualité et la taille de l'ADN purifié sur une électrophorèse de gel d'agarose de 1% dans 1x tampon TBE migré pendant 1 h à 4 V/cm.</li>
	<li>Décongeler les réactifs congelés du kit de transcription in vitro. Placer le mélange de polymère d'ARN T7 sur la glace et les autres réactifs sur un nutator à température ambiante. Immédiatement après le dégel complet, faire tourner rapidement les tubes rNTP pendant 5 s pour recueillir la solution au fond des tubes et les placer sur la glace. Gardez le tampon de réaction 10x à température ambiante pour éviter les précipitations.</li>
	<li>Pipet dans un tube de 1,5 ml les composants suivants de la réaction de transcription de 20 l à température ambiante dans l'ordre indiqué : 6 l d'eau, 2 l (0,1 - 1 g) de modèle d'ADN linéaire, 2 l de 75 mM solution ATP, 2 l de 75 mM solution GTP , 2 l de 75 mM de solution CTP, 2 l de 75 mM de solution UTP, 2 l de 10x Reaction Buffer et 2 OL de T7 RNA Polymerase Mix. REMARQUE : Pour le modèle d'ADN généré par PCR, utilisez 100 à 200 ng d'ADN; pour le modèle d'ADN généré par le digest d'enzyme de restrictiond'un plasmide, utilisez 1 g. Recombinant actif Sa polymère d'ARN T7 6-étiquetée peut être purifiée dans E. coli15.</li>
	<li>Mélanger le tube à fond. Rotation rapide pour 5 s pour recueillir la solution de réaction au fond du tube, puis incuber à 37 oC pendant 2-4 h. REMARQUE : Chaque transcription se comportera différemment selon le modèle d'ADN, sa longueur, sa séquence ou sa structure. Optimiser les conditions de transcription in vitro en testant différents temps d'incubation jusqu'à 6 h; différentes concentrations de modèle d'ADN, T7 RNA Polymerase, ou NTP; ou l'ajout de MgCl2 supplémentaire à ce qui est présent dans le mélange de polymère d'ARN T7.</li>
	<li>À la fin de la période d'incubation, ajouter 1 l de DNase I par réaction de 20 L et incuber à 37 oC pendant 15 min. REMARQUE : La réaction de transcription peut être temporairement maintenue sur la glace jusqu'à ce que le gel de polyacrylamide soit prêt.</li>
	<li>Procéder à la purification par gel polyacrylamide. REMARQUE : Puisque l'ARN est sensible au pH et à la contamination par la NAD, utilisez de l'équipement dédié à l'ARN et des réactifs exempts de RNase.</li>
	<li>Déterminer le pourcentage de polyacrylamide pour le gel en fonction de la taille de la transcription d'intérêt: 3,5% pour 100-2000 nt (XC: 460 nt; BB: 100 nt), 5% pour 80-500 nt (XC: 260 nt; BB: 65 nt), 8% pour 60-400 nt (XC: 160 nt; BB: 45 nt), 12% pour 40-200 nt (XC: 70 nt; BB: 20 nt), 15% pour 25-150 nt (XC: 60 nt; BB: 15 nt), et 20% pour 6-100 nt (XC: 45 nt; BB: 12 nt).</li>
	<li>Préparer le gel polyacrylamide dénaturant l'urée en combinant les réactifs suivants dans un tube conique de 50 ml : 9,6 g d'urée moléculaire, 2 mL de 10x TBE, x mL de mélange acrylamide:bis-acrylamide (29:1) et de l'eau jusqu'à la marque de 20 mL sur le tube , où x -20 mL/(40%/gel pourcentage %). CAUTION : Les gels de polyacrylamide contiennent souvent de l'acrylamide non polymérisé qui est un matériau toxique qui peut produire un danger lorsqu'il est introduit dans l'environnement. Éliminer les gels de polyacrylamide dans le cadre du programme de déchets chimiques de l'institution.</li>
	<li>Micro-ondes pour 15 s à 30% de puissance. Placer sur le discitor pendant 10 min à température ambiante ou jusqu'à ce que l'urée soit complètement dissoute.</li>
	<li>Pendant que le mélange de gel est en rotation, récupérez une cassette en gel (18 puits, 1 mm d'épaisseur; 13,3 x 8,7 cm (W x L)), retirez le peigne et placez la cassette pour la coulée de gel.</li>
	<li>Tournez rapidement le tube de 50 ml pendant 5 s pour recueillir la solution de gel au fond du tube. Ajouter 125 L de 10% de solution de persulfate d'ammonium (APS). Placer sur le discauor pendant 1 min. Tourner à nouveau pendant 5 s.</li>
	<li>Ajouter 25 l de téramethylènediamine (TEMED) et mélanger soigneusement en pipetting de haut en bas 5 fois avec une pipette de 25 ml en évitant les bulles.</li>
	<li>Pipette dans la fonte de gel et insérer soigneusement le peigne de gel en évitant les bulles.</li>
	<li>Resserrer le joint en ajoutant un grand clip de liant sur le dessus de la cassette.</li>
	<li>Laisser le gel polymériser pendant 1 h.</li>
	<li>Une fois le gel solidifié, retirez le clip de liant. Insérez la cassette dans la boîte d'électrophoresis. Ajouter 1x tampon TBE dans les réservoirs supérieurs et inférieurs.</li>
	<li>Récupérer la réaction de transcription. Ajouter de l'eau jusqu'à 100 l, puis ajouter 100 l de 2x Gel Loading Buffer. Préparer l'échelle en mélangeant la quantité recommandée avec de l'eau à 10 l et 10 L de 2x Gel Loading Buffer à un tube séparé de 1,5 ml.</li>
	<li>Incuber à la fois l'échelle et la réaction de transcription in vitro dans le thermomélangeur à 70 oC pendant 15 min.</li>
	<li>Pendant que les échantillons dénaturent à 70 oC, retirez soigneusement le peigne, nettoyez les puits en faisant monter et descendre chaque puits à l'eau avec une pipette P1000, et immédiatement pré-exécuter pendant 10 min à 100 V.</li>
	<li>Une fois les échantillons terminés, leur dénaturation de 15 min à 70 oC, retirez les tubes du thermomélangeur et placez-les immédiatement sur la glace.</li>
	<li>Nettoyez chaque puits du gel à nouveau avec la pipette P1000. Chargez 20 l l de l'échelle sur le premier puits à gauche, 20 l de l'échantillon d'ARN sur 10 puits distincts, et 20 l de tampon de chargement de gel 1x sur les puits inutilisés.</li>
	<li>Exécuter le gel à 100 V pendant 60 -240 min, selon le % de polyacrylamide du gel. REMARQUE : Les colorants du Gel Loading Buffer se sépareront en deux bandes lorsqu'elles traversent le gel, une bande bleue de Bromophenol Blue (BB) qui migre lentement et une bande cyande de Xylène Cyanol (XC) qui migre rapidement. La migration approximative de ces bandes dans différents gels de polyacrylamide en % est bien connue (voir l'étape 1.11) et peut être utilisée pour estimer la migration de l'ARN dans le gel.</li>
	<li>Une fois le gel arrêté, retirer soigneusement le gel de la cassette.</li>
	<li>Placer le gel dans une boîte propre contenant une solution de 50 ml de tampon 1x TBE avec 50 l de tache de gel d'acide nucléique et incuber pendant 5 min sur une berceuse pour tacher l'ARN.</li>
	<li>Prenez une photo avant et après l'excision de bande du gel sur le système d'imagerie de gel, de préférence en utilisant la lumière bleue au lieu de la transillumination UV.</li>
	<li>Accise chaque bande d'intérêt à l'aide d'une pointe de coupe de gel jetable sans nauséabonde. Après chaque puits, transférer la pointe contenant la tranche de gel dans un tube de 1,5 ml et faire tourner brièvement pour recueillir la tranche de gel. Répéter l'opération jusqu'à ce que toutes les bandes aient été recueillies dans le même tube de 1,5 ml.</li>
	<li>Une fois que toutes les tranches de gel ont été récoltées, ajouter 100 l d'eau sans nauséabonde ou tampon TE au tube de 1,5 ml. Conserver à 4 oC pour 48 h. Cela permet à l'ARN de sortir les tranches de gel dans la solution.</li>
	<li>Après 48 h, pipet l'eau ou tampon TE à un tube frais de 1,5 ml. Disposer des tranches de gel restantes. Purifie l'ARN par l'intermédiaire du kit de nettoyage comme suit.<ol>
<li>Équilibrez la colonne de spin à température ambiante pendant au moins 30 min.</li>
		<li>À la solution de 100 oL d'ARN dans le nouveau tube de 1,5 ml à partir de l'étape 1,32, ajouter 350 l de tampon RLT et bien mélanger pendant 2 min sur un écrou. Tourner pendant 1 s à 200 x g pour recueillir la solution au fond du tube.</li>
		<li>Ajouter 675 'L de 100% EtOH et bien mélanger pendant 2 min sur le diateur. Faites tourner pendant 1 s à 200 x g et passez immédiatement à l'étape suivante.</li>
		<li>Transférer 565 l de l'mélange sur la colonne de spin et tourner pendant 1 min à 15 000 x g. Videz le tube de collecte par aspiration.</li>
		<li>Répétez l'étape précédente avec la deuxième moitié de l'échantillon.</li>
		<li>Ajouter 500 l de tampon RPE à la colonne et tourner pendant 1 min à 15 000 x g. Videz le tube de collecte par aspiration.</li>
		<li>Ajouter 750 l'éthanol de 80 % à la colonne et tourner pendant 1 min à 15 000 x g. Videz le tube de collecte par aspiration.</li>
		<li>Placez la colonne dans un nouveau tube de collecte de 2 ml avec le couvercle ouvert et tournez à 15 000 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Transférer la colonne dans un nouveau tube de 1,5 ml.</li>
		<li>Ajouter 17 l'eau au centre de la colonne et tourner à 15 000 x g pendant 1 min pour s'élituer. Elute à nouveau en utilisant un autre 17 L d'eau. Le volume total récupéré doit être de 32 l.</li>
	</ol></li>
	<li>Bien mélanger par vortex, pipet 1,5 l et mesurer la concentration de l'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre à microvolume.</li>
	<li>Vérifiez la qualité de la purification de l'ARN par l'urée dénaturant le gel polyacrylamide comme dans les étapes 1.11-1.29.</li>
</ol>2. L'ARN in vitro de méthyltransferase
<ol><li>Mettre en place l'essai de méthyltransferase de 100 l'ARN dans un tube de 1,5 ml sur la glace comme suit : 23 l d'eau, 10 L de 10x TBS (500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1,5 M NaCl), 2 'L de 0,05 M EDTA, 5 'L de 100 mM TNtT , 40 l de 50 % de glycérol, 4 l de 58 M 3H-SAM, 5 l de 20x Protease Inhibitor Cocktail, 1 L de RNaseOUT (facultatif), 5 l d'ARN et 5 l de Méthyltransferase. CAUTION : Les matières tritiated radioactives sont dangereuses et ne doivent être manipulées que lorsqu'elles portent des gants, une blouse de laboratoire et tout autre EPI nécessaire. Tous les bouts de pipette et les tubes en contact avec des matières radioactives sont considérés comme des déchets radioactifs solides. Éliminer tous les déchets radioactifs solides et liquides selon le protocole approuvé par le laboratoire sur les déchets radioactifs. REMARQUE : Inclure des échantillons témoins sans méthyltransferase et sans ARN. Les concentrations de réactifs peuvent nécessiter une optimisation et/ou l'inclusion de sels de cation divalents, tels que mgCl2, ou SAM non étiqueté. La plage optimale de concentration finale d'ARN est de 50 nM à 1 M, tandis que la concentration de méthyltransferase est de 25 nM à 300 nM.</li>
	<li>Bien mélanger en faisant un vortex en tourbillonnant doucement le tube. Spin 5 s à 200 x g pour recueillir la solution au fond du tube. Incuber le tube (s) à 37 oC pendant 2 h.</li>
	<li>Nettoyez la réaction à l'aide de la purification de la colonne comme à l'étape 1.32. CAUTION: Soyez très prudent pour éliminer correctement les matières radioactives, en particulier pendant les lavages de colonne (pipette au lieu d'aspirater les déchets des tubes de collecte).</li>
	<li>Effectuer le nombre de scintillation liquide<ol>
<li>Configurez le support de comptage de scintillation avec une fiole par échantillon, une fiole pour la mesure de fond et une fiole pour le test de balayage. Remplissez les flacons de 5 ml de solution de comptage de scintillation.</li>
		<li>Ajouter 10 l de chaque échantillon d'ARN radioactif élucidé en 1 flacon, serrer le couvercle et mélanger délicatement.</li>
		<li>Préparer les flacons de test de balayage. Frotter soigneusement les cotons-tiges sur toutes les surfaces et l'équipement utilisés pendant le protocole. Ajouter des écouvillons aux flacons remplis de 5 ml de solution de scintillation et serrer le couvercle.</li>
		<li>Exécuter les échantillons sur le compteur de scintillation comme suit. Ouvrez le capot du comptoir, insérez la grille dans la machine et fermez le capot. Sélectionnez Count Single Rack. Sélectionnez Select User Program. Sélectionnez ou créez un programmequi mesure le tritium (3 H) pour 60 s. Hit Count Rack. Répétez le nombre de scintillation trois fois. REMARQUE : L'équipement mesurera le nombre de scintillation de chaque échantillon et de la sortie à la fois à l'écran et à une impression. Protocole peut être mis en pause ici si désiré. Les échantillons d'ARN restants de l'étape 2.3 doivent être congelés à -80 oC pour une utilisation ultérieure.</li>
	</ol></li>
	<li>Procéder avec l'autoradiogramme<ol>
<li>Préparer et pré-exécuter l'urée dénaturant gel polyacrylamide comme dans les étapes 1.11-1.20.</li>
		<li>Pipette 20 l de matière d'ARN radioactif dans un nouveau tube de 1,5 ml contenant 20 l de tampon de chargement de gel 2x. Bien mélanger. Préparer l'échelle comme dans l'étape 1.21. Incuber les échantillons à 70 oC pendant 15 min.</li>
		<li>Laver les puits du gel une fois de plus immédiatement avant le chargement de l'échantillon. Chargez 20 l l de l'échelle préparée, 20 'L des échantillons, et 20 'L de 1x Gel Loading Buffer sur les voies restantes. Exécuter le gel à 100 V pendant 60-180 min, selon le pourcentage de polyacrylamide.</li>
		<li>Une fois que le gel finit de fonctionner, retirez le gel de la cassette et placez-le dans une boîte contenant 50 ml de tampon 1x TBE avec 5 L de tache de gel d'acide nucléique ultrasensible.</li>
		<li>Incuber pendant 5 min sur le rocker pour tacher l'ARN.</li>
		<li>Sortez soigneusement le gel de la boîte et placez-le sur le transilluminateur UV du système d'imagerie gel avec les puits vers le haut et l'échelle sur la gauche.</li>
		<li>Concentrez la caméra sur le gel, allumez la lumière UV, puis prenez une image du gel en exposant de 50 ms à 1 s selon l'intensité du signal.</li>
		<li>Éteignez l'exposition aux UV et enregistrez l'image sous forme de fichier Tiff.</li>
		<li>Remettre le gel dans la boîte. Supprimer TBE. Fixer le gel avec 50 ml de solution de fixation (50% de méthanol, 10% d'acide acétique, 40% d'eau ultra-pure) pendant 30 min à température ambiante sur un rocker.</li>
		<li>Déplacez doucement le gel à nouveau dans une boîte noire fraîche contenant 25 ml de la solution d'amélioration de l'autoradiographie. En l'absence d'une boîte noire, recouvrir la boîte de papier d'aluminium pour protéger la solution de la lumière.</li>
		<li>Incuber 30 min à température ambiante sur le rocker.</li>
		<li>Soulevez délicatement le gel et placez-le face cachée sur une feuille de pellicule plastique avec les puits vers le haut et l'échelle sur le côté droit. Déposer deux feuilles de papier chromatographique sur le dos du gel. Retournez doucement toute la pile.</li>
		<li>Préchauffer le séchoir à gel à 80 oC. Reculez le couvercle en plastique sur le séchoir à gel. Insérez l'enveloppe, le gel et la pile de papier chromatographique sous le couvercle en plastique et déplacez le couvercle en plastique vers le bas pour créer un joint.</li>
		<li>Sécher pendant 1 h à 80 oC dans le séchoir à gel.</li>
		<li>Éteignez le séchoir à gel et retirez délicatement la pile. Retirer l'enveloppe et le deuxième papier chromatographique. Tapez le reste du papier chromatographique avec le gel séché dans une cassette autoradiogramme.</li>
		<li>Ajouter 1 feuille de film d'autoradiographie dans la pièce sombre.</li>
		<li>Placez la cassette à -80 oC et développez le film après 1 h à 4 semaines en fonction de l'intensité du signal, qui peut être jugé en fonction des comptes de scintillation précédemment mesurés : 1-4 semaines pour 250-1 000 cpm, 24 h à 1 semaine pour 1 000 à 10 000 cpm et 1 h à 24 h pour le cp de l'année. m.</li>
		<li>Une fois le film développé, placez le film sur le dessus de la cassette et marquez soigneusement avec un marqueur de laboratoire les 4 bords du gel, chacun puits, et la position des colorants XC et BB.</li>
		<li>Scannez le film à 300 ou 600 pixels par pouce de résolution et enregistrez l'image comme fichier Tiff.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+histones+to+RNA%3A+role+of+methylation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li>
<li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+Watches+the+Watchmen%3A+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139(2016).</li>
<li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+methylation+of+m%286%29Am+in+the+5%27+cap+controls+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li>
<li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U6+snRNA+m%286%29A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27+UTR+m%286%29A+Promotes+Cap-Independent+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%286%29-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li>
<li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li>
<li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li>
<li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998(2012).</li>
<li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protocols%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li>
<li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li>
<li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82(2003).</li>
<li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li>
<li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+%28rRNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ici, une méthode simple et robuste pour la vérification in vitro de l'activité de méthyltransferase d'ARN vers des transcriptions spécifiques est rapportée. L'analyse profite du fait que la méthionine de S-adenosyl peut être tritiaté sur le donneur de groupe méthyle (figure 1), permettant que l'ARN méthylé soit détecté avec précision sans l'utilisation d'anticorps. Cependant, il est important de noter que cet essai ne peut pas indiquer quel résidu ou groupe chimique est méthylé par l'enzyme....

L'ADN, l'ARN et les protéines sont sujets à des modifications qui régulent étroitement l'expression des gènes1. Parmi ces modifications, les méthylations se produisent sur les trois biopolymères. L'ADN et les protéines méthylations ont été très bien étudiés au cours des trois dernières décennies. En revanche, l'intérêt pour la méthylation de l'ARN n'a été relancé que récemment à la lumière des rôles importants que les protéines qui écrivent, effacent ou lient les méthylations de l'ARN jouent dans le développement et la maladie2. En plus de fonctions mieux connues dans l'abondante ribosomal et le transfert RNAs, voies de méthylation ARN réguler la stabilité spécifique de l'ARN messager3,4, épissage5 et traduction6,7, traitement miRNA8,9 et pause transcriptionnelle et la libération10,11.
Ici, une méthode simple et robuste pour la vérification in vitro de l'activité de méthyltransferase d'ARN dans le cadre d'un laboratoire de biologie moléculaire est rapportée (résumée dans la figure 1). Beaucoup d'études évaluent l'activité d'un méthyltransferase d'ARN par le point-blot avec un anticorps contre la modification d'ARN de l'intérêt. Cependant, point-blot ne vérifie pas l'intégrité de l'ARN lors de l'incubation avec le méthyltransferase d'ARN. Ceci est important parce que même les contaminations mineures des protéines recombinantes avec des nucléases peuvent conduire à une dégradation partielle de l'ARN et des résultats confondants. En outre, même les anticorps très spécifiques de modification d'ARN peuvent reconnaître les ARN non modifiés avec des séquences ou des structures spécifiques. L'analyse in vitro de méthyltransferase d'ARN rapportée ici tire parti du fait que la méthionine de S-adenosyl peut être tritiated sur le donneur de groupe méthyle (figure 1), permettant que l'ARN méthylé soit détecté avec précision sans l'utilisation des anticorps . Des instructions sont fournies pour la transcription in vitro et la purification d'une transcription d'intérêt et de l'essai de la méthylation de ladite transcription par l'enzyme d'intérêt. Cette méthode est flexible et robuste, et peut être ajustée en fonction des besoins de n'importe quel projet donné. Par exemple, les ARN transcrits et purifiés in vitro, les ARN synthétisés chimiquement, mais aussi les ARN cellulaires peuvent être utilisés. Cet essai fournit l'information quantitative sous forme de compte de scintillation, aussi bien que l'information qualitative en montrant où exactement l'ARN méthylé fonctionne sur un gel. Cela peut fournir un aperçu unique de la fonction d'un ARN méthyltransferase, en particulier lors de l'utilisation des ARN cellulaires comme substrat, car il fournit une méthode pour observer directement la taille de l'ARN ou des ARN qui sont ciblés pour la méthylation.

<table><tbody><tr><td>Échelle d’ADN 10 bp</td><td>Invitrogen</td><td>10821-015</td><td>Kit d’échelle d’ADN 10 pb.</td></tr><tr><td>10 % de persulfate d’ammonium (APS)</td><td>S.O.</td><td>S.O</td>. <td>Pour un gel de polyacrylamide dénaturant l’urée (Pour 10 mL, dissoudre 1 g dans 8 mL d’eau milliQ ; ajuster le volume à 10 mL avec de l’eau milliQ ; filtrer la solution à l’aide d’une seringue de 10 mL munie d’un molleton de 0,45 & m filtre).</td></tr><tr><td>10X Tampon TBE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pour le gel de polyacrylamide dénaturant l’urée (Pour 1L, ajouter 108 g de Tris Base, 55 g d’Acide Borique dans un cylindre muni d’un agitateur ; ajouter 800 mL d’eau distillée et laisser dissoudre ; ajouter 40mL de 0,5 M de Na2EDTA (pH 8,0) ; ajuster le volume à 1L avec de l’eau milliQ ; filtrer la solution à l’aide d’un 0,22&micro ; m filtre).</td></tr><tr><td>10X TBS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pour 1L, ajouter 60,5 g de Tris Base, 87,6 g de NaCl dans un cylindre muni d’un agitateur ; ajouter 800 mL d’eau distillée et laisser dissoudre ; ajuster le pH à 7,5 avec du HCl concentré ; ajuster le volume à 1L avec de l’eau milliQ ; filtrer la solution à l’aide d’un 0,22 &micro ; m filtre.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acrylamide : Bis-Acrylamide 29:1 (solution à 40 %/électrophorèse), Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1408-1</td><td>Pour gel de polyacrylamide dénaturant l’urée.</td></tr><tr><td>L’ADÉNOSYL-L-MÉTHIONINE, S-[MÉTHYL-3H] ; (SAM[3H])</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155V250UC</td><td>Pour la méthylation in vitro de l’ARN ; Concentration = 1,0 mCi/mL ; Activité spécifique = 17,1 Ci/mmol ; Molarité= (1,0 Ci/L)/(83,2 Ci/mmol) = 0,0584 mmol/L = 58,4 &micro ;M.&nbsp ; &nbsp ; À la réception du tube 3H-SAM congelé, décongelez-le à 4&deg ; C, faire 20 & micro ; L aliquotes, et congelez-les à -30&deg ;C. Ne jamais recongeler et réutiliser une aliquote partiellement utilisée.</td></tr><tr><td>Amersham Hypercassette Cassettes d’autoradiographie</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN11649</td><td>Pour l’exposition au gel d’autoradiogramme.</td></tr><tr><td>Amersham Hyperfilm MP</td><td>GE Healthcare</td><td>28906846</td><td>Pour l’exposition au gel d’autoradiogramme.</td></tr><tr><td>Compteur de scintillation</td><td>Beckman</td><td>LS6500</td><td>Pour le comptage de scintillation liquide.</td></tr><tr><td>Biorad Mini système d’électrophorèse horizontale</td><td>Biorad</td><td>1704466</td><td>Mini système d’électrophorèse horizontale.</td></tr><tr><td>cOmplete Mini Inhibiteur de protéase sans EDTA Cocktail</td><td>Roche Applied Science</td><td>4693159001</td><td>Pour une solution 20X, dissoudre 1 comprimé dans 0,525 mL d’eau sans nucléase.</td></tr><tr><td>Criterion Cell</td><td>Biorad</td><td>345-9902</td><td>Cassette vide sans RNase pour gel de polyacrylamide.</td></tr><tr><td>Cassettes vides Criterion Biorad</td><td></td><td>1656001</td><td>Cellule d’électrophorèse verticale au format midi.</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre microvolume DeNovix DS-11 Spectrophotomètre</td> microvolume <td>DeNovix</td><td>DS-11-S</td><td>pour mesurer la concentration d’ADN et d’ARN.</td></tr><tr><td>Ecoscint Original</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-271</td><td>Pour le comptage par scintillation liquide.</td></tr><tr><td>Fisherbrand 7 mL Flacons à scintillation en PEHD</td><td>Fisher</td><td>03-337-1</td><td>Pour le comptage par scintillation liquide.</td></tr><tr><td>Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer</td><td>RPI CORP</td><td>112600</td><td>Pour le prétraitement du gel d’autoradiogramme.</td></tr><tr><td>Séchoir à gel</td><td>Biorad</td><td>1651745</td><td>Pour le séchage du gel.</td></tr><tr><td>Gel Loading Buffer II</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td>Pour le chargement de l’ARN dans un gel d’urée polyacrylamide dénaturant (composition : 95 % de formamide, 18 mM d’EDTA et 0,025 % de SDS, de xylène cyanol et de bleu de bromophénol).</td></tr><tr><td>Conseils d’excision de gel jetable GeneCatcher</td><td>Gel Company</td><td>NC9431993</td><td>Pour retirer les bandes des gels d’agarose et de polyacrylamide.</td></tr><tr><td>Kit Megascript</td><td>Ambion</td><td>AM1333</td><td>Pour la transcription in vitro avec l’ARN polymérase T7.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Perfectwestern Extralarge Container</td><td>Genhunter Corporation</td><td>NC9226382 (transparent)/ NC9965364 (noir)</td><td>Boîte de coloration en gel.</td></tr><tr><td>pRZ</td><td>Addgene</td><td>#27663</td><td>Plasmide pour la production de transcrits in vitro avec des extrémités homogènes</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Pour le nettoyage de l’ARN, utilisez le protocole modifié fourni dans le protocole.</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Kit pour l’extraction sur gel et le nettoyage de fragments d’ADNdb utilisés pour la transcription in vitro.</td></tr><tr><td>Saran Premium Plastic Wrap Saran</td><td>Wrap</td><td>Amazon</td><td>Pour le gel de séchage.</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>Colorant gel d’acide nucléique ultra sensible.</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Colorant de gel d’acide nucléique.</td></tr><tr><td>TE</td><td>Sigma</td><td>93283-100ML</td><td>10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA disodique, pH 8,0</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>110-18-9</td><td>Pour gel de polyacrylamide dénaturant l’urée.</td></tr><tr><td>Thermomélangeur avec SMARTBLOCK 24X 1,5 mL TUBES</td><td>eppendorf</td><td>5382000023/5361000038</td><td>Pour l’incubation à température contrôlée de tubes de 1,5 mL.</td></tr><tr><td>TOPO TA Cloning Kit</td><td>life technologies</td><td></td><td>Kits pour le clonage rapide de la Taq polymérase&ndash ; produits de PCR amplifiés en vecteurs contenant des promoteurs T7 et/ou SP6 pour la transcription in vitro de l’ARN.</td></tr><tr><td>TURBO DNase (2 U&frasl ; et micro ; L)</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>Pour l’élimination de l’ADN des réactions de transcription in vitro.</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456-500G</td><td>Pour gel de polyacrylamide dénaturant l’urée.</td></tr><tr><td>Papier Whatman 3MM</td><td>GE Healthcare</td><td>3030-154</td><td>Papier de chromatographie pour gel de séchage.</td></tr></tbody></table>

analyse d'activité sans anticorps pour l'analyse de l'activité de méthyltransferase d'arn

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

Il y a plus de 100 modifications chimiquement distinctes de l'ARN, dont les deux tiers se composent de méthylations. L'intérêt pour les modifications de l'ARN, et en particulier les méthylations, est réapparu en raison des rôles importants joués par les enzymes qui les écrivent et les effacent dans les processus biologiques pertinents à la maladie et au cancer. Ici, un analyse in vitro sensible pour l'analyse précise de l'activité d'auteur de méthylation d'ARN sur les ARN transcrits synthétiques ou in vitro est fourni. Cet exemple utilise une forme tritiée de S-adenosyl-méthionine, résultant en l'étiquetage direct de l'ARN méthylé avec du tritium. La faible énergie du rayonnement tritium rend la méthode sûre, et les méthodes préexistantes d'amplification du signal de tritium, permettent de quantifier et de visualiser l'ARN méthylé sans l'utilisation d'anticorps, qui sont généralement sujettes aux artefacts. Bien que cette méthode soit écrite pour la méthylation de l'ARN, peu de réglages le rendent applicable à l'étude d'autres modifications de l'ARN qui peuvent être étiquetées radioactivement, comme l'acétylation d'ARN avec 14C coenzyme acétyle A. Dans l'ensemble, cet essai permet d'évaluer rapidement l'ARN conditions de méthylation, l'inhibition avec les inhibiteurs de petites molécules, ou l'effet de l'ARN ou des mutants enzymatiques, et fournit un outil puissant pour valider et élargir les résultats obtenus dans les cellules.

Réaction de transcription in vitro Figure 2 A représente une course typique d'une réaction de transcription in vitro avec la polymérase d'ARN T7 du snRNA 7SK, qui est un ARN relativement court (331 nt) et très structuré. Comme le montre cette image brute, il existe plusieurs bandes indésirables, à la fois plus courtes et plus longues que 7SK, résultant probablement d'événements aléatoires d'initiation transcriptionnelle ou de terminaison. Pour cette raiso...

Ici, un analyse in vitro sans anticorps pour l'analyse directe de l'activité de méthyltransferase sur l'ARN synthétique ou in vitro transcrit est décrit.

Analyse d'activité sans anticorps pour l'analyse de l'activité de méthyltransferase d'ARN

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Il y a plus de 100 modifications distinctes de l’ARN, dont deux tiers sont des méthylations. Ce protocole fournit une méthode pour l’analyse sensible et précise de l’activité d’auteur de méthylation d’ARN. Cette technique facile à utiliser nous permet de quantifier et de visualiser l’ARN méthylé sans l’utilisation d’anticorps, qui sont généralement sujets aux artefacts.Samantha Shelton, une étudiante diplômée de mon labo, démontrera la procédure. Pour commencer cette procédure, installez l’essai de méthyltransferase d’ARN de 100 microlitres dans un tube de glace de 1,5 millilitre, tel que décrit dans le protocole de texte. Vortex le tube pour bien mélanger, et centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq secondes pour recueillir la solution au fond du tube.Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, nettoyez la réaction à l’aide de la purification de la colonne, tel que décrit dans le protocole de texte. Pour effectuer le compte de scintillation liquide, configurez le rack de comptage de scintillation avec un flacon par échantillon, un flacon pour une mesure de fond, et un flacon pour le test de balayage.Remplissez les flacons de cinq millilitres de solution de comptage de scintillation. Ajouter 10 microlitres de chaque échantillon d’ARN radioactif élut dans un flacon. Serrer le couvercle et mélanger délicatement.Pour préparer les flacons d’essai de balayage, frottez soigneusement les cotons-tiges sur toutes les surfaces et équipements utilisés pendant la procédure. Ajoutez ces écouvillons aux flacons remplis de solution de scintillation et serrez le couvercle. Pour faire fonctionner les échantillons sur le comptoir de scintillation, ouvrez le capot du comptoir, insérez le support dans la machine et fermez le capot.Sélectionnez Count Single Rack. Choisissez select user program. Sélectionnez ou créez un programme qui mesure le tritium pendant 60 secondes et frappez Count Rack.Répétez le compte de scintillation trois fois. Après cela, préparez et réexédez un gel de polyacrylamide dénaturant l’urée, tel que décrit dans le protocole de texte. Transférer 20 microlitres de matière radioactive ARN dans un nouveau tube de 1,5 millilitre contenant 20 microlitres de tampon de chargement de gel 2X.Après avoir préparé l’échelle, incuber les échantillons à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes. Lavez les puits du gel une fois de plus immédiatement avant le chargement de l’échantillon par tampon de pipetting des réservoirs de gel vers le bas dans les puits du gel. Ensuite, chargez 20 microlitres de l’échelle préparée, 20 microlitres des échantillons et 20 microlitres de tampon de chargement de gel 1X dans les voies du gel.Faire fonctionner le gel à 100 volts pendant 60 à 180 minutes, selon le pourcentage de polyacrylamide. Une fois le gel terminé, retirez le gel de la cassette et placez-le dans une boîte contenant 50 millilitres de tampon 1X TBE avec cinq microlitres de tache de gel nucléique ultrasensible. Incuber sur un rocker pendant cinq minutes pour tacher l’ARN.Après cela, prenez soigneusement le gel hors de la boîte, et placez-le sur le transilluminateur UV du système d’imagerie par gel avec les puits vers le haut et l’échelle sur la gauche. Concentrez la caméra sur le gel, allumez la lumière UV et prenez une image du gel. Ensuite, éteignez l’exposition aux UV et enregistrez l’image sous forme de fichier TIFF.Remettre le gel dans la boîte, retirer le TBE et fixer le gel avec 50 millilitres de solution de fixation sur un rocker à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, déplacez doucement le gel vers une boîte noire fraîche contenant 25 millilitres de la solution d’amélioration de l’autoradiographie. Incuber sur le rocker à température ambiante pendant 30 minutes.Soulevez doucement le gel et placez-le face contre terre sur une feuille de pellicule plastique avec les puits en place et l’échelle sur le côté droit. Placez deux feuilles de papier chromatographie sur le dos du gel et retournez toute la pile. Préchauffer le séchoir à gel à 80 degrés Celsius.Déplacez le couvercle en plastique sur le séchoir à gel. Insérez toute la pile sous le couvercle en plastique et déplacez le couvercle en plastique vers le bas pour créer un joint. Séchez le gel à 80 degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, éteignez la sécheuse à gel et retirez doucement la pile. Retirer l’enveloppement et le deuxième papier chromatographie. Tapez le reste du papier chromatographie avec le gel séché dans une cassette autoradiogramme.Dans une pièce sombre, ajouter une feuille de film autoradiographie. Rangez la cassette à 80 degrés Celsius négatif et développez le film au moment opportun, selon l’intensité du signal. Une fois que le film est développé, placez-le sur le dessus de la cassette et utilisez un marqueur de laboratoire pour marquer soigneusement les quatre bords du gel, chaque puits, et la position des dyes XC et BB.Numérisez le film à une résolution de 300 ou 600 pixels par pouce, et enregistrez l’image sous forme de fichier TIFF. Dans cette étude, un essai anticorps-libre est démontré pour analyser l’activité de méthyltransferase d’ARN. Une course typique d’une réaction in vitro de transcription avec le polymésase d’ARN T7 du petit ARN nucléaire de 7SK montre l’ARN relativement court et fortement structuré.Il existe plusieurs bandes indésirables, à la fois plus courtes et plus longues que 7SK, probablement résultant d’événements d’initiation transcriptionnelle aléatoire ou de terminaison. Pour cette raison, la purification du gel après la réaction de transcription in vitro est importante pour obtenir un échantillon d’ARN propre. À ce stade, l’ARN d’intérêt peut être identifié par son emplacement par rapport à l’échelle et purifié par la purification du gel.Un essai représentatif de méthyltransferase d’ARN utilisant la limite inférieure des concentrations recommandées d’ARN et de protéine est montré ici. Cet essai permet à la fois des résultats quantitatifs des comptes de scintillation, ainsi que des résultats qualitatifs de l’autoradiogramme. Ici, un méthyltransferase ARN connu sous le méthylate 7SK est montré pour être en mesure de méthyliquer U6. En outre, comme récemment montré pour 7SK, la liaison de l’histone H4 à MePCE inhibe également la méthylation U6.Ceci peut être observé dans le compte de scintillation et l’autoradiogramme, montrant la robustesse de ce protocole. L’ARN est susceptible d’être dégradation, alors assurez-vous d’utiliser des reagents sans RNase et de nettoyer soigneusement toutes les surfaces et tout l’équipement. L’ARN étiqueté radioactivement obtenu à partir de cet essai de méthyltransferase peut être directement utilisé pour évaluer l’activité de déméthylase de l’ARN ou l’activité liant l’ARN par essai électrophoretic de décalage de mobilité, par exemple.Cette méthode permet aux chercheurs de tester l’effet de différents facteurs sur l’activité de méthyltransferase arn, y compris les mutations ponctuelles et les traitements inhibiteurs de petites molécules. Cette méthode utilise des matières radioactives, alors assurez-vous de porter l’EPI approprié, et soyez prudent lors de la manipulation et l’élimination des matières radioactives.

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