Name: Reconstitution assistée par détergent de Recombinant Drosophila Atlastin en Liposomes pour des essais de mélange de lipides (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Découvrez la reconstitution assistée par détergent de l'atlastine de Drosophila dans des liposomes et l'essai de mélange lipidique basé sur FRET. Cette méthode permet d'étudier efficacement les protéines de fusion membranaire.

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Nous remercions le Dr Michael Stern et son laboratoire pour leurs idées et leurs commentaires sur les projets liés à l'atlastine. Ces travaux ont été soutenus par l'Institut national des sciences médicales générales [R01GM101377] et l'Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux [R01NS102676].

1. Purification de la TPS-DAtl-His8
<ol><li>
Expression protéique et préparation du lysate
	<ol>
<li>Transformez BL21 (DE3) E. coli avec la construction GST-DAtl-His8 en pGEX4-T32 et sélectionnez sur une plaque d'ampicilline.</li>
		<li>Sélectionnez un seul transformateur et inoculez 5 ml d'ampicilline LB (5 l d'ampicilline de 100 mg/mL) dans un tube de culture de 14 ml et incubez à 25 oC en secouant à 200 tr/min pendant 6 à 8 h. REMARQUE: En raison de l'expression qui fuit, il n'est pas recommandé d'incuber à des températures plus élevées. La croissance à 25 oC réduit l'agrégation des protéines pendant cette période de croissance.</li>
		<li>Inoculer 200 ml d'ampicilline lb-est avec 1 ml de culture de 5 ml et incuber pendant la nuit (15 à 18 h) à 25 oC.</li>
		<li>Le lendemain matin, récolter les cellules par centrifugation (2 000 x g pendant 10 min) et resuspendre en 5 ml de LB.</li>
		<li>Inoculer 4 L de LB et de l'ampicilline et mesurer OD600 (0,05 à 0,15). Incuber à 25 oC en secouant. REMARQUE: Réservez quelques supports pour servir de blanc pour les mesures OD600 avant d'ajouter des bactéries.</li>
		<li>Mesurez600 OD toutes les heures jusqu'à ce qu'il atteigne une OD entre 0.4-0.5. À ce stade, réduire la température à 16 oC.</li>
		<li>Induire avec 0,2 mM d'IPTG (800 oL de 1 M de stock), 10 min après que l'incubateur a atteint 16 oC. Incuber toute la nuit (15 à 18 h) à 16 oC. REMARQUE: La température inférieure améliore le rendement des protéines fonctionnelles en réduisant l'agrégation de l'atlastine.</li>
		<li>Le lendemain matin, récoltez les cellules en centrifugeant à 7 500 x g à 4 oC.</li>
		<li>Resuspendre les cellules dans 200 ml d'A200 (25 mM HEPES (pH 7,4) et 200 mM KCl).</li>
		<li>Centrifuger les cellules à 11 000 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
		<li>Resuspendre la pastille en 40 ml de tampon de rupture (A200 plus 10% de glycérol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 4% Triton X-100 (TX100), 40mM imidazole, et un comprimé de cocktail inhibiteur de protéase sans EDTA). REMARQUE: Ajouter le TX-100 après le ressurcage pour éviter de générer des bulles et de la mousse.</li>
		<li>Passer à travers une aiguille de 18 G et faire passer les cellules à travers un perturbateur cellulaire trois fois à 10 000 psi.</li>
		<li>Centrifuger l'extrait à 125 000 x g pour 1 h. REMARQUE: Dissoudre le granule 1:2 (w:v) dans 8 M Urea et nutate à température ambiante pendant la nuit. L'urée en tant que dénaturant dissoudra lentement toute protéine pastille insoluble pour l'analyse SDS-PAGE. Enregistrer 1 L pour l'analyse des taches SDS-PAGE et Coomassie.</li>
		<li>Filtrer l'extrait à travers un filtre à membrane stérile de nitrate de cellulose de 0,45 m pour éliminer les bactéries et les gros débris bactériens. REMARQUE : En option, enregistrez 1 L pour l'analyse des taches SDS PAGE et Coomassie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purification des protéines par chromatographie d'affinité
	<ol>
<li>Chargez le lysate filtré sur une chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC) chargée de Ni2,pré-équilibré avec un tampon faible en imidazole (A100 plus 10% de glycérol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 1% TX-100, 40 mM imidazole) à un taux de 1 mL/ min à 4 oC.</li>
		<li>Laver la colonne avec 25 mL d'A100 plus 10% de glycérol, 2 mM 2-mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100, 40 mM imidazole avec un taux de 1 ml/min à 4 oC. Élichez la protéine avec un gradient linéaire de 30 ml d'imidazole de 40 mm à 500 mM, et un lavage final de 5 ml à 500 mm.</li>
		<li>Mettre en commun les fractions de pointe et incuber pendant 1 h à 4 oC avec des perles gonflées de GSH-Agarose, auparavant gonflées dans l'eau et liblibées en A100 avec 10 % de glycérol, 2 mM 2-mercaptoéthanol, 0,1 % Anapoe X-100 et 1 mM EDTA. REMARQUE: Les perles de GSH-Agarose peuvent être gonflées dans 50 ml d'eau la veille et incubées pendant la nuit à 4 oC, ou pour 1 h à RT. Pour enlever l'eau et le tampon d'équilibre, centrifugeuse dans un rotor de seau oscillant à 500 x g pendant 1 min sans frein. Aspirez le supernatant avec une aiguille de 26 G.</li>
		<li>Pellet GSH-Agarose perles en centrifuge dans un rotor de seau oscillant à 500 x g sans frein et enlever le lysate supernatant par aspiration avec une aiguille de 26 G.</li>
		<li>Transférer les perles dans une colonne polypréparatoire de 10 ml et laver cinq fois avec 5 mL de tampon d'équilibre (A100 avec 10 % de glycérol, 2 mM 2-mercaptoéthanol, 0,1 % Anapoe X-100 et 1 mM EDTA) en centrifuant à 500 x g.
</li>
		<li>Éluter la protéine avec 1-1.5 ml de tampon d'équilibre complété avec 10 mM de glutathion réduit. Aliquot a éludé les protéines et le gel éclair dans l'azote liquide. Les protéines peuvent être stockées à -80 oC indéfiniment. REMARQUE: Ajuster le pH du tampon d'élution à 7,4.</li>
		<li>Quantifiez la concentration de protéines par l'amido test de protéines noires9 et évaluez la pureté par la coloration SDS-PAGE et Coomassie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Reconstitution de recombinant Atlastin en Liposomes
<ol><li>Production de Liposome par méthode d'extrusion 10 Ans et plus<ol>
<li>Faire des stocks de mélange lipidique dans le chloroforme (10 mM lipidique total). Les lipides nécessaires sont 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE), et 1,2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (Rh-DPPE). Les liposomes d'accepteur se composent de POPC : DOPS (85:15 molaire ratio) et liposomes de donneur de POPC:DOPS:RH-PE:NBD-PE (83:15:1.5:1.5 molaire ratio). REMARQUE: Tandis que les mélanges de lipides de POPC:DOPS ont été traditionnellement employés pour des essais in vitro de mélange de lipide, les compositions alternatives de lipide peuvent être adaptées pour différentes fins expérimentales. POPC:DOPS liposomes sont très stables et plus difficiles à fusionner, est donc un système très strict pour la fusion.</li>
		<li>Ajoutez 1 'Ci/mL de L-dipalmitoyl-phosphatidylcholine (méthylle choline-3H) aux mélanges lipidiques afin de déterminer les concentrations lipidiques à des étapes ultérieures par comptage de scintillation liquide. Réserver au moins 8 ll de ce stock.</li>
		<li>Transférer la quantité désirée de mélanges lipidiques dans des tubes en verre de silex.</li>
		<li>Séchez les mélanges lipidiques sous un flux doux de gaz N2 pendant 10 min jusqu'à ce qu'aucun chloroforme ne soit visible.</li>
		<li>Séchez le film lipidique plus loin dans un dessiccateur en passant l'aspirateur pendant 30 min.</li>
		<li>Ajoutez suffisamment d'A100 aqueuse avec 10 % de glycérol, 2 mM 2-mercaptoethanol et 1 mM EDTA au film lipidique et ramenez la concentration à 10 mM. Resuspendre le film lipidique en vortexant légèrement pendant 15 min à température ambiante. Un vortexer qui peut accueillir des tubes en verre de silex est recommandé.</li>
		<li>Congeler-dégel les lipides hydratés dans l'azote liquide dix fois. Après congélation dans l'azote liquide, décongeler les liposomes en laissant la solution s'asseoir à température ambiante pendant 30 s, puis transférer à l'eau pour une décongélation plus rapide. Ce cycle de gel-dégel minimisera les vésicules multilamellar. MISE EN GARDE: Les tubes peuvent se fissurer s'ils contiennent des volumes supérieurs à 0,5 ml et s'ils sont transférés directement sous forme d'azote liquide dans l'eau.</li>
		<li>Passer le lipide à travers des filtres en polycarbonate avec 100 nm pore taille 19 fois en utilisant mini-extrudeur.</li>
		<li>Déterminer la concentration totale de lipides des liposomes par comptage de scintillation REMARQUE: Une partie du lipide peut être laissée dans des tubes de verre et dans le mini-extrudeur.<ol>
<li>Ajouter 4 ll de stock lipidique et de liposomes dans 3 ml de cocktail de scintillation.</li>
			<li>Mesurer le nombre moyen par minute (CPMA) pour les stocks et les liposomes. Et calculer la concentration de liposomes avec la formule suivante:<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59867/59867equ01.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Conserver les liposomes à 4 oC jusqu'à une semaine. Le stockage plus long n'est pas recommandé car les liposomes peuvent s'agréger avec le temps, diminuant ainsi l'efficacité de la reconstitution.</li>
	</ol></li>
	<li>Reconstitution par détergent assisté incorporation en liposomes préformés
	<ol>
<li>Calculez la quantité de tampon, de protéines, de liposomes et de détergent supplémentaire à mélanger :<ol>
<li>Déterminer le volume total souhaité. Ce volume est composé de tampon A100 avec 10% de glycérol, 2 mM 2-mercaptoethanol, et 1 mM EDTA. Les volumes de moins de 250 l ne se mélangent pas bien dans des tubes microcentrifuges de 0,5 ml.</li>
			<li>Calculer le volume de liposomes nécessaires pour donner une concentration lipidique finale d'environ 1 mM. Soustrayez le volume du volume tampon.</li>
			<li>Calculer le volume de protéines nécessaires pour donner le rapport protéine/molaire lipidique souhaité (habituellement 1:400). Diminuez le volume de mémoire tampon en conséquence.</li>
			<li>Déterminer la quantité de détergent supplémentaire à ajouter pour saturer les liposomes visant un ratio détergent/lipide efficace (Reff) entre 0,64 et 0,8. N'oubliez pas de considérer le détergent qui est ajouté avec la protéine. Le (Reff) est <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59867/59867equ02.jpg"> déterminé par l'équation Dtotal est la concentration totale de détergent et l'eau D est la concentration de détergent monomeric (0,18 mM pour TX-100 et Anapoe X-100 en présence de détergent)4 , 11.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mélanger les solutions dans un tube de 0,5 ml dans l'ordre suivant : tampon, détergent, protéines et liposomes. Ajouter les liposomes rapidement et vortex immédiatement pour 5 s pour homogénéiser le mélange.</li>
		<li>Incuber la réaction dans un nutator pendant 1 h à 4 oC.</li>
		<li>Faire 0,2 g/mL de lédre en polystyrène non polaire dans l'eau. REMARQUE: Faire la perle adsorbent en polystyrène " loue" au cours de l'incubation précédente de 1 h à l'étape 2.2.3.</li>
		<li>Peser 0,2 g de perles adsorbent en polystyrène et transférer dans un tube de microcentrifuge.</li>
		<li>Dégazer les perles en ajoutant 1 ml de méthanol au tube et mélanger pendant 1 min. Les perles de degassed couleront.</li>
		<li>Aspirer le méthanol et ajouter de l'eau aux perles. Laisser les perles se mélanger avec de l'eau pendant 5 min, puis aspirer l'eau. Répétez quatre fois, puis apportez la perle adsorbent en polystyrène "slurry" à 1 ml de volume avec de l'eau et une concentration finale de 0,2 g/mL. REMARQUE: Les perles doivent encore s'installer au fond du tube. S'ils ne le font pas, dégazez à nouveau. Utilisez une aiguille de 21 G ou plus pour aspirer le méthanol et l'eau des perles.</li>
		<li>Calculez la quantité de perles adsorbent en polystyrène nécessaires pour absorber tous les détergents de chaque échantillon. 1 g de perles adsorbent en polystyrène absorbe 70 mg de TX-100. Pour calculer le volume de boue de perles adsorbent en polystyrène nécessaire pour chaque réaction, divisez le détergent total dans la réaction (étape 2.2.1.4) par 70 mg, puis par la concentration de la boue de perle (0.2 g/mL (étape 2.2.7).</li>
		<li>Transférer la quantité calculée de lisière de perles en polystyrène dans un tube de 0,5 ml et aspirer l'eau. REMARQUE: Couper l'extrémité d'une pointe de 20 à 200 l pour transférer les perles, vortex le tube juste avant le tuyauterie pour resuspendre les perles réglées.</li>
		<li>Ajouter les échantillons au tube de 0,5 ml contenant des perles adsorbent en polystyrène et incuber l'échantillon en écroupendant pendant 1 h à 4 oC.</li>
		<li>Répétez deux fois en laissant de vieilles perles derrière et en transférant l'échantillon à des perles fraîches.</li>
		<li>Ajouter l'échantillon à un quatrième tube avec des perles fraîches et incuber toute la nuit (15 à 18 h) à 4 oC.</li>
	</ol></li>
	<li>Le matin, retirer l'échantillon des perles d'adsorbent en polystyrène et des agrégats de protéines insolubles en centrifuge pendant 10 min à 16 000 x g à 4 oC.</li>
	<li>Récupérer le supernatant et déterminer la concentration lipidique finale par comptage de scintillation liquide (voir l'étape 2.1.9.2). Optionnellement, la concentration de protéine peutêtre déterminée par l'assay noir de protéine amido 9. REMARQUE: Pour les protéoliposomes atlastin, les essais enzymatiques doivent être exécutés avec des liposomes frais. Un stockage long à 4 oC ou le gel entraîne une perte importante d'activité d'atlastine.</li>
</ol>3. Tests de mélange de lipides
<ol><li>Amener les protéoliposomes donneurs et accepteurs à une concentration de 0,15 mM chacun en A100 avec 10 % de glycérol, 2 mM d'éthanol, 1 mM EDTA et 5 mM MgCl2. Chaque réaction (50 l) doit être ajoutée à un puits dans une plaque de puits blanche plate de 96 propice aux lectures de fluorescence. Préparer au moins 4 réactions, y compris un triplicate, et un contrôle négatif sans GTP.</li>
	<li>Placer la plaque dans un lecteur de plaque préchauffé à 37 oC. Mesurer la fluorescence DENB (excitation 460 nm et émission 535 nm) pendant 5 min par min.</li>
	<li>Induire la fusion en ajoutant 5 mM GTP (5 l de 50 mM GTP).</li>
	<li>Mesurer la fluorescence de la DNB chaque minute pendant 1 h.</li>
	<li>Ajouter 5 'L de 2,5% w/v n-Dodecyl '-D-maltoside pour dissoudre les protéoliposomes et mesurer la fluorescence maximale de la DNB. Lisez la fluorescence NBD pendant 15 min chaque min.</li>
</ol>4. Flottation liposome sur le gradient discontinu d'Iohexol12
<ol><li>(facultatif) Analyser l'efficacité de la reconstitution par des essais de flottaison13.</li>
	<li>Préparer un iohexol de 80 % et 30 % w/v en A100 avec 10 % de glycérol, 2 mM 2-mercaptoethanol et 1 mM EDTA. L'iohexol ne se dissout pas facilement, donc cela doit être préparé la veille en ditant pendant la nuit à 4 oC.</li>
	<li>Mélanger soigneusement 150 l de 80 % de stock d'iohexol avec 150 ll d'échantillon de protéoliposomes pour l'amener à un iohexol de 40 %. Ajoutez ceci à un tube ultra-clair de 5 x 41 mm2 évitant les bulles.</li>
	<li>Couche 250 'L de 30% de stock d'iohexol lentement sur le dessus de l'échantillon pour faire une couche moyenne. Évitez les bulles et perturbant la couche inférieure. Au-dessus de la couche médiane, ajoutez lentement 50 oL d'A100 avec 2 mM 2-mercaptoethanol et 1 mM EDTA.</li>
	<li>Centrifuger le gradient dans un rotor de seau oscillant à 220 000 x g pour 4 h à 4 oC avec une accélération lente et sans rupture.</li>
	<li>Récoltez les couches du gradient et analysez par sDS-PAGE et la tache de Coomassie, la quantification peut être faite par densitométrie. Les protéines reconstituées devraient flotter vers la couche supérieure, tandis que les agrégats protéiques et lipidiques se sédimenteront au fond ou dans la couche moyenne.</li>
</ol>5. Analyse de l'orientation des protéines reconstituées par thrombin proteolyse
REMARQUE: La construction d'atlastine rapportée ici a un site de coupe de thrombine entre la fin de l'étiquette de TPS N-terminal e et le début de l'atlastine. Atlastin dans la bonne orientation aura ce site de coupe accessible à la protéase, tandis que la protéine dans la mauvaise orientation sera protégée par la bicouche lipidique.
<ol><li>Pour essayer d'essayer l'orientation protéoliposome atlastine, réservez au moins 8 'L de protéoliposomes reconstitués frais.</li>
	<li>Ajouter 8 ll de protéoliposomes et 1 l de 1 U/L de thrombine. Incuber à 37 oC pendant 1 h.</li>
	<li>Désinguer la protéase avec 1 l de 5 mg/mL de cocktail inhibiteur de protéase sans EDTA et incuber pendant 30 min à 37 oC.</li>
	<li>Analyser l'échantillon par SDS-PAGE et Coomassie tache. La proportion de protéines clivées et non clivées peut être déterminée par densitométrie.</li>
</ol>

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<li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407(2016).</li>
<li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li>
<li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les méthodes ici délimiter une méthode efficace pour purifier, reconstituer, et mesurer l'activité de fusion de l'atlastine recombinante. Pour assurer des rendements élevés de l'atlastine fonctionnelle, certaines étapes critiques doivent être prises en considération. L'expression de l'atlastine doit être faite à basse température (16 oC) pour éviter l'agrégation et il faut viser une concentration finale entre 0,4 et 1,5 mg/mL. Les protéines très diluées ne seront pas reconstituées de manière optimale à un rapport protéin...

La fusion de membrane est un processus critique dans beaucoup de réactions biologiques. Dans des conditions biologiques, la fusion de la membrane n'est pas spontanée et nécessite des protéines de fusion spécialisées pour catalyser ces réactions1. ER fusion de membrane homotypic est médiée chez les animaux par le dynamin liés GTPase atlastin2. Le rôle d'Atlastin dans la fusion homotypique est fondamental pour les jonctions à trois voies dans les urgences périphériques, qui constituent un grand réseau interconnecté de tubules qui s'étendent dans toute la cellule. Les atlastines ont une morphologie de domaine conservée composée d'un grand GTPase, d'un domaine intermédiaire de faisceau detrois hélices, d'une ancre hydrophobe de membrane, et d'une courte queue Cytoplasmique C-terminal 3. Des études in vitro avec recombinant Drosophila atlastin ont montré que lorsqu'il est reconstitué en liposomes, il maintient ses propriétés fusogéniques. D'autres atlastines, y compris les homologs humains n'ont pas été en mesure de récapituler la fusion in vitro. Nous décrivons ici une méthodologie pour purifier une TPS et poly-histidine étiquetée recombinante Drosophila atlastin, la reconstituer en liposomes, et d'essayer la fusion.
L'étude de la fusion de membrane in vitro présente un défi car les protéines fusogéniques ont habituellement une ancre de membrane. Pour les étudier, il est nécessaire de les reconstituer en bicouches lipidiques modèles. Les grandes vésicules unilamellaires (LUV) sont un outil utile pour étudier les interactions entre protéines lipidiques. Nous présentons ici un système pour faire des VUS de différentes compositions lipidiques pour la reconstitution des protéines et les analyses de fusion. La reconstitution des protéines intégrales en JV peut être réalisée par une variété de méthodes, y compris,la reconstitution organique de solvant-négocié, les mécanismes mécaniques, ou la reconstitution assistée de détergent 4. Nous présentons ici une méthode pour reconstituer d'atlastin de Drosophila en liposomes préformés par l'enlèvement de détergent. Les avantages de cette méthode de reconstitution incluent des rendements élevés de reconstitution et l'orientation appropriée de l'atlastine dans la bicouche de lipide. En outre, grâce à cette méthode, la protéine n'est pas séchée ou exposée à des solvants organiques, maintenant ainsi la structure et la fonction. Parmi ses inconvénients, la présence de détergents peut ne pas être idéal pour toutes les protéines et les protéoliposomes finaux peuvent avoir un certain détergent incorporé dans la bicouche lipidique. D'autres dialyses peuvent être utilisées pour éliminer davantage le détergent. Cependant, la dialyse peut prendre beaucoup de temps et peut donc entraîner une perte d'activité protéique.
L'évaluation de l'activité de fusion de l'atlastine peut être déterminée par des essais de mélange de lipides comme décrit précédemment2. Ici, nous délinons une méthode pour mesurer la fusion médiée par N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine) lipides étiquetés. Cet test nécessite la fusion de protéoliposomes donneurs (étiquetés) et de protéoliposomes accepteurs (non étiquetés). Une libération de FRET peut être mesurée au cours de la réaction comme la dilution d'une paire donneur-acceptant de liposomes « étiquetés » à des liposomes « non étiquetés » à la suite du mélange de lipides pendant la fusion de membrane (figure 1)5. Bien que cet assay serve de proxy pour la fusion de membrane, il est limité dans la distinction entre la fusion de membrane et l'hémifusion, un état où seuls les folioles extérieures se mélangent. Pour résoudre ce problème, une alternative est l'étanchéité externe de la DNB par la dithionite. Suivant la même méthodologie que NBD/rhodamine lipides mélangeant des essais, lors de l'étanchéité du dépliant externe toute libération NBD FRET par fusion sera due à la foliole interne mélange8.
Des essais alternatifs de fusion par le contenu aqueux intérieur mélangeant l'adresse pleine fusion seulement5. Des exemples de ceci sont le terbium (Tb)/acide dipicolinique (DPA) essais et l'acide trisulfonic aminonaphthalene (ANTS)/p-xylène bis (pyridinium) bromure (DPX) essais. Dans tb/DPA, un pool de liposomes avec tb encapsulé sont mélangés et fusionnés avec des liposomes avec dPA encapsulé; lors de la fusion, la fluorescence est augmentée par transfert d'énergie interne de DPA à Tb dans le [Tb(DPA)3]3- chelation complexe6. En revanche, pour les essais ANTS/DPX, la fluorescence ANTS est étanchée par DPX7. Bien que ces systèmes traitent du mélange de contenu interne, une préparation plus approfondie des liposomes est nécessaire pour l'élimination des réactifs non encapsulés, ainsi que l'interaction involontaire des fluorophores.

<table><tbody><tr><td>Colonnes de chromatographie poly-prep 10 mL</td><td>Biored</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>10 mm x 75 mm Tubes en verre blanc</td><td>VWR</td><td>608225-402</td><td></td></tr><tr><td>47 mm de diamètre, 0,45 &mu ; m pore whatman filtres à membrane stérile</td><td>Whatman</td><td>7141 104</td><td></td></tr><tr><td>96 puits plaque blanche</td><td>NUNC</td><td>437796</td><td></td></tr><tr><td>Anapoe X-100</td><td>Anatrace</td><td>9002-931-1</td><td></td></tr><tr><td>Perturbateur cellulaire</td><td>Avestin</td><td>Avestin Emulsiflex C3</td><td></td></tr><tr><td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sel de sodium))</td><td>Avanti</td><td>840035P-10mg</td><td>DOPS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Recherche organiques inc.</td><td>6381-92-6</td><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Extrudeuse complète d’inhibiteurs de protéase</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z373400&nbsp ;</td><td>Extrudeuse de base Liposofast</td></tr><tr><td>Système de chromatographie liquide GE Akta Prime</td><td>GE Pharmacia</td><td>8149-30-0006</td><td></td></tr><tr><td>Perles d’agarose au glutathion</td><td>Sigma aldrich</td><td>G4510-50ml</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>EMD</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>36051-31-7</td><td>Guanosine 5' triphosphate sel sodique hydraté</td></tr><tr><td>HEPES, sans acide</td><td>Omnipur</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>fluka</td><td>5670</td><td></td></tr><tr><td>Colonne résine de chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC)</td><td>GE Healthcare</td><td>17040801</td><td>1 mL HiTrap Chelating Colonnes de chromatographie d’affinité métallique immobilisée HP</td></tr><tr><td>Iohexol</td><td>Société chimique et scientifique précise</td><td>AN 7050 BLK</td><td>Accudenz/Nycodenz</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Produits de recherche international corp.</td><td>I56000-100.0</td><td>IPTG, sans dioxane</td></tr><tr><td>L-Glutathion réduit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251-5g</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Fisher</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Omnisolv</td><td>MX0488-1</td><td></td></tr><tr><td>NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (sel d’ammonium))</td><td>Avanti</td><td>236495</td><td>NBD-DPPE</td></tr><tr><td>n-Dodecyl &beta ;-D-maltoside</td><td>Chem-Impex International</td><td>21950</td><td></td></tr><tr><td>Billes adsorbantes en polystyrène non polaire</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td>SM2 Biobilles</td></tr><tr><td>Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 &mu ; m membrane poreuse</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>Optima LE80K Ultra centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylcholine, L-&alpha ;-dipalmitoyl [choline méthyl-3H]</td><td>ARC</td><td>ART0284</td><td>Lipides titriés</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>TECAN</td><td>TECAN infinite M200</td> lecteur de plaques <td></td></tr><tr><td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td><td>Avanti</td><td>850457C-25mg</td><td>POPC</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>MP</td><td>151944</td><td></td></tr><tr><td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine, rhodamine B sulfonyle) (sel d’ammonium))Avanti</td><td></td> <td>236495</td><td>Rh-DPPE</td></tr><tr><td>Scintillation Cocktail</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-272</td><td>Ecoscint XR Solution de scintillation pour échantillons aqueux ou non aqueux</td></tr><tr><td>Scintillation flacons</td><td>Beckman</td><td>592928</td><td>Bouchon à rotation rapide Mini Poly-Q Vial</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T1063-1kU</td><td>Thrombine à partir de plasma humain</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger ultra-clairs 5 mm x 41 mm</td><td>Beckman</td><td>344090</td><td></td></tr><tr><td>Vortex 9 à 13 mm Porte-tube</td><td>VWR</td><td>58816-138</td><td>Insert pour tube</td></tr> <tr><td>en verre blanc vortexVortex Insert Retainer</td><td>VWR</td><td>58816-132</td><td>Dispositif de retenue nécessaire pour le support de tube vortex</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>2.235074</td><td>Vortex Genie 2 modèle G560</td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol biologie moléculaire grade</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitution assistée par détergent de recombinant drosophila atlastin en liposomes pour des essais de mélange de lipides

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

La fusion de membrane est un processus crucial dans la cellule eucaryotique. Des protéines spécialisées sont nécessaires pour catalyser la fusion. Les atlastines sont des protéines réticulum-endoplasmiques (ER) impliquées dans la fusion homotypique de l'ER. Nous détaillons ici une méthode pour purifier un glutathion S-transferase (GST) et poly-histidine marqué Drosophila atlastin par deux séries de chromatographie d'affinité. L'étude des réactions de fusion in vitro nécessite l'insertion de protéines de fusion purifiées dans une couche lipidique. Les liposomes sont des membranes modèles idéales, car la composition et la taille des lipides peuvent être ajustées. À cette fin, nous décrivons une méthode de reconstitution par l'enlèvement de détergent pour drosophila atlastin dans les liposomes préformés. Tandis que plusieurs méthodes de reconstitution sont disponibles, la reconstitution par l'enlèvement de détergent a plusieurs avantages qui le rendent approprié pour des atlastins et d'autres protéines semblables. L'avantage de cette méthode comprend un rendement de reconstitution élevé et une orientation correcte de la protéine reconstituée. Cette méthode peut être étendue à d'autres protéines membranaires et à d'autres applications qui nécessitent des protéoliposomes. En outre, nous décrivons un test de mélange de lipides basé sur FRET des protéoliposomes utilisés comme mesure de la fusion de membrane.

L'efficacité de la reconstitution de l'atlastine est présentée à la figure 2. Des protéoliposomes reconstitués ont été flottés dans un gradient discontinu d'iohexol. Les protéines non incorporées ont été sédimentées dans la couche inférieure (B) ou dans la couche moyenne (M). La protéine reconstituée flotterait vers la couche supérieure (T). Des échantillons du gradient ont été récoltés et analysés par SDS-PAGE et Coomassie coloration. La quantification du gel par densitométrie montre une tr...

La fusion des membranes biologiques est catalysée par des protéines de fusion spécialisées. La mesure des propriétés fusogéniques des protéines peut être obtenue par des essais de mélange de lipides. Nous présentons une méthode pour purifier l'atlastine recombinante de Drosophila, une protéine qui médiatise la fusion homotypique de l'ER, la reconstituant aux liposomes préformés, et testant la capacité de fusion.

Reconstitution assistée par détergent de Recombinant Drosophila Atlastin en Liposomes pour des essais de mélange de lipides

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Le protocole de reconstitution et de fusion détaillé ici est un moyen efficace d’étudier les protéines liées à la membrane dans une cale lipidique modèle et le mélange lipidique par des protéines de fusion. Ici nous décrivons une reconstitution détergent-aidée de l’atlastin recombinant de Drosophila, une protéine de fusion d’ER, dans les liposomes préformés de phosphatidylcholine. La fusion des protéoliposomes d’atlastine est alors mesurée par un essai de mélange lipidique fret-basé.L’un des principaux avantages de la reconstitution assistée par détergent est que la protéine dans le détergent n’est pas exposée au séchage ou aux solvants. Nous montrons également ici que l’orientation de reconstitution de l’atlastine est très efficace. Un autre avantage de l’analyse de mélange de lipides à base de FRET est que les liposomes n’ont pas besoin d’être chargés avec n’importe quel colorant, et il n’y a pas besoin d’étapes supplémentaires de dialyse.Pour commencer cette procédure, préparer les stocks de mélange lipidique en chloroforme, tel que décrit dans le protocole de texte. Ajouter un microcourard par millilitre de DPPC aux mélanges lipidiques, en s’assurant de réserver au moins huit microlitres de ce stock. Transférer la quantité désirée des mélanges lipidiques dans des tubes en verre à silex.Ensuite, séchez les mélanges lipidiques sous un doux flux de gaz azoté pendant environ 10 minutes jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de chloroforme visible. Séchez le film lipidique résultant plus loin dans un dessiccator en aspirant pendant 30 minutes. Après cela, ajouter suffisamment d’A100 avec 10% glycérol, deux millimolaire 2-mercaptoéthanol, et un millimolaire EDTA au film lipidique pour ramener la concentration à 10 millimolar.Resuspendez le film lipidique en tourbillonnant légèrement pendant 15 minutes à température ambiante. Congeler les lipides hydratés dans de l’azote liquide. Pour décongeler les liposomes, laissez reposer la solution à température ambiante pendant 30 secondes, puis transférez-les à l’eau pour une décongélation plus rapide.Répétez ce cycle gel-dégel un total de 10 fois. Après cela, utilisez un mini-extrème pour passer les lipides à travers des filtres en polycarbonate, avec une taille de pore de 100 nanomètres, 19 fois. Pour déterminer la concentration totale de lipides des liposomes, ajouter quatre microlitres de bouillon lipidique et de lysosomes à trois millilitres de cocktail de scintillation.Mesurez le nombre moyen par minute pour le stock et les liposomes, et calculez la concentration liposome, telle qu’décrite dans le protocole de texte. Conserver les liposomes à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Tout d’abord, mélanger la quantité appropriée de tampon, de détergent supplémentaire et de protéines dans un tube de 0,5 millilitre, tel que décrit dans le protocole de texte.Ajouter rapidement les liposomes, et immédiatement vortex pendant cinq secondes pour homogénéiser le mélange. Incuber la réaction dans un nutator à quatre degrés Celsius pendant une heure. Pendant cette incubation, peser 0,2 gramme de perles adsorbents de polystyrène et les transférer dans un tube de microcentrifugeuse.Ajouter un millilitre de méthanol au tube et mélanger pendant une minute pour dégazer les perles. Ensuite, aspirez le méthanol à l’aide d’une aiguille de calibre 21 ou plus. Pour commencer à laver les perles, ajoutez-y de l’eau.Laisser les perles se mélanger avec l’eau pendant cinq minutes, puis aspirer l’eau. Répétez ce processus de lavage de l’eau quatre fois. Après cela, ajouter de l’eau pour amener le lisier de perles adsorbents en polystyrène à un volume d’un millilitre, avec une concentration finale de 0,2 grammes par millilitre.Calculez la quantité de perles adsorbentes en polystyrène nécessaires pour adsorb tout le détergent de chaque échantillon, tel que décrit dans le protocole texte. Couper une pointe de pipette pour ramasser le lisier de perles. Transférez la quantité calculée de boue de perle dans un tube de 0,5 millilitre et aspirez l’eau.Ajouter les échantillons au tube contenant les perles, et incuber dans un nutator à quatre degrés Celsius pendant une heure. Transférer les échantillons dans un tube frais contenant de nouvelles perles, en s’assurant de laisser les vieilles perles derrière. Incuber à nouveau en utilisant les mêmes conditions.Répétez ce processus de transfert et d’incubation des perles deux fois. Après cela, transférez l’échantillon dans un nouveau tube contenant des perles fraîches et incubez en noix pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez l’échantillon des perles et de la centrifugeuse à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour granuler les agrégats de protéines insolubles.Récupérez le supernatant, et déterminez la concentration finale de lipide par le comptage liquide de scintillation, tel que décrit dans le protocole de texte. Pour commencer, amener le donneur et l’accepteur protéoliposomes à une concentration de 0,15 millimlaire chacun dans A100 contenant du glycérol, du bêta-mercaptoéthanol, de l’EDTA et du chlorure de magnésium. Transférez chaque réaction à un puits dans une plaque plate de 96 puits adaptée à la lecture de fluorescence, en vous assurant de préparer au moins quatre réactions, y compris un triplicate et un contrôle négatif sans GTP.Placez la plaque dans un lecteur de plaque préchauffé à 37 degrés Celsius. Mesurer la fluorescence NBD toutes les minutes pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez cinq millimolar GTP pour induire la fusion.Mesurez la fluorescence NBD chaque minute pendant une heure en utilisant la même excitation et les mêmes émissions qu’auparavant. Après cela, ajouter cinq microlitres de 2,5%n-Dodecyl bêta-D-maltoside aux puits pour dissoudre les protéoliposomes, et mesurer la fluorescence maximale NBD chaque minute pendant 15 minutes en utilisant la même excitation et l’émission. Dans cette étude, l’atlastine recombinante de Drosophila est purifiée et reconstituée en liposomes préformés.L’efficacité de la reconstitution de l’atlastine est déterminée par des protéoliposomes reconstitués flottants dans un gradient discontinu iohexol. Des échantillons des couches de gradient supérieur, moyen et inférieur sont récoltés et analysés par la coloration SDS-PAGE et Coomassie. La quantification du gel par densitométrie montre une efficacité très élevée de reconstitution avec des pertes négligeables, avec 96% de la protéine totale trouvée comme protéoliposomes qui flottaient à la couche supérieure.Moins de 1 % des protéines ne sont pas reconstituées et se trouvent dans la couche moyenne, et seulement 3 % ne sont pas reconstituées, agrégées et sédimentées jusqu’à la couche inférieure. L’orientation de l’atlastine après reconstitution est quantifiée par des analyses de clivage de thrombine. Les échantillons sont analysés avec SDS-PAGE et Coomassie colorant et quantifiés par densitométrie.La plupart des protéines reconstituées sont fendues, avec seulement 7% étant protégés de la protéase. La cinétique et l’étendue de la fusion protéoliposome à médiation atlastine sont analysées par des analyses de mélange de lipides. Une incubation de cinq minutes est effectuée avant d’induire la fusion avec GTP au point zéro temps.Après une heure, n-Dodecyl beta-D-maltoside a été ajouté pour solubiliser les protéoliposomes et obtenir la libération maximale de transfert de résonance fluorescente. Le maximum de fusion dans la course est considéré comme 11% de la fluorescence maximale. Les lipides sont dissous dans le chloroforme.Lors de la préparation des mélanges lipidiques, assurez-vous de le faire rapidement, sur un capot chimique, et sur la glace pour éviter toute évaporation. Il est possible d’analyser les protéoliposomes d’atlastine par microscopie pour visualiser les effets d’une ancre membranaire sur la forme et la taille liposome. Cette méthode a été étendue pour étudier d’autres protéines ancrés dans la membrane et comment le comportement dans une bicouche lipidique modèle.Ce protocole utilise des lipides titrés pour quantifier les mélanges lipidiques. Assurez-vous de prendre les précautions nécessaires lorsque vous travaillez avec des matières radioactives.

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