Caractérisation semi-automatique De MD-L1 et recensement des cellules tumorales circulantes de patients atteints d'immunofluorescence

D’après la technologie microfluidique, l’isolement et la caractérisation des CTC à partir des cellules sanguines normales ne nécessitent pas l’utilisation de biomarqueurs spécifiques de la CCT et sont compatibles avec la culture cellulaire. Ce protocole facilite un taux élevé d’extraction de la CCT et fournit une analyse cytologique approfondie des CTC, en évaluant les caractéristiques cytomorphologiques malignes. L’expression pd-L1 par les CTC a une valeur prédictive dans la gestion du cancer du poumon.

L’amélioration de sa détection à l’aide de ce test pourrait favoriser une meilleure prise en charge des patients à long terme. D’autres applications de ce protocole incluent la détection d’aberrations génétiques à l’aide de FISH, ou la réalisation d’analyses transcriptomiques sur les CTC, ainsi que l’isolement des cellules d’origine fœtale chez les mères. Julie Balandier, technicienne de notre laboratoire, démontrera la procédure.

Pour l’enrichissement pré-analytique de cellules tumorales circulant, recueillez d’abord 7,5 millilitres de sang dans un tube EDTA de potassium, et gardez l’échantillon sous agitation douce pour éviter la sédimentation cellulaire et la coagulation. Dans les six heures suivant la collecte, utilisez une pipette sérologique sous une armoire de sécurité microbiologique, pour transférer jusqu’à 7,5 millilitres de sang entier dans un nouveau tube centrifugeuse de 50 millilitres et centrifugez l’échantillon pendant 10 minutes à 1600 fois G, à température ambiante. À la fin de la centrifugation, utiliser une pipette de transfert pour recueillir la fraction plasmatique sans déranger la couche buffy, et diluer le plasma avec un volume équivalent de PBS, jusqu’à 7,5 millilitres.

Ensuite, ajoutez soigneusement le tampon de lyse des globules rouges à l’échantillon de sang, à un volume final de 30 millilitres, et inversez doucement le tube de collecte de sang trois fois, avant de placer le tube à température ambiante pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, recueillir les cellules par centrifugation, et retirer soigneusement tous sauf les quatre à cinq derniers millilitres de supernatant. Utilisez une micropipette filtrée pour enlever le supernatant restant et utilisez une micropipette P1000 avec une pointe filtrée pour ajouter un millilitre de tampon de resuspension sur la paroi du tube.

Pour éviter d’introduire des bulles, resuspendez la pastille cellulaire avec du pipetage doux, jusqu’à ce que l’échantillon soit homogène. Lorsque la pastille a été résuspendue, ajouter trois millilitres supplémentaires de tampon de resuspension à la paroi du tube, sans introduire de bulles, et mélanger doucement les cellules à nouveau. Pour l’enrichissement microfluidique en spirale de cellules tumorales, chargez d’abord une nouvelle puce microfluidique spirale sur l’appareil et chargez un tube de centrifugeuse vide de 50 millilitres dans chacun des ports d’entrée et de sortie.

Cliquez sur premier pour amorce de l’appareil microfluidique spirale pendant trois minutes. Suppression des tubes d’entrée et de sortie à la fin du cycle. Chargez l’échantillon de sang résuspendé dans le port d’entrée et chargez un tube conique clair de 15 millilitres dans le port de sortie.

Cliquez ensuite sur exécuter, et sélectionnez le programme trois pour lancer le programme d’enrichissement cellulaire tumoral circulant de 31 minutes. À la fin du cycle transférer le tube de sortie à la centrifugeuse, et utiliser une pipette sérologique de cinq millilitres pour enlever tous sauf les deux derniers millilitres du supernatant. Ensuite, utilisez une micropipette pour enlever tous sauf les 100 derniers microlitres de supernatant.

Pour la coloration de l’immunofluorescence, comptez les cellules dans un hémocytomètre et diluez l’échantillon enrichi à une fois dix à cinq cellules par 100 microlitres de concentration de solution anti-liaison de 0,2 %. Ensuite, utilisez un coton-tige imbibé de 50 microlitres de solution anti-liaison pour humidifier le contour de la chambre échantillonnée, et placez une glissière en verre polylysine dans la chambre d’échantillon. Fermez la chambre, et pipette de haut en bas trois fois pour enrober une pointe de micropipette avec la solution de liaison avant de résuspendre l’échantillon dans les 100 derniers microlitres du supernatant.

Transférez la solution cellulaire dans la chambre de l’échantillon et cytospinez l’échantillon dans une centrifugeuse dédiée à 400 rotations par minute pendant quatre minutes, à une faible accélération. À la fin de la centrifugation, placez un isolateur en silicone autour de la zone de dépôt et laissez sécher la glissière sous une armoire de sécurité microbiologique pendant deux minutes, puis fixez l’échantillon de cytospun avec 100 microlitres de 4 % de paraformaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante, suivis de trois lavages de deux minutes avec 200 microlitres de PBS par lavage, à température ambiante. Après le dernier lavage, bloquer toute liaison non spécifique avec incubation de 30 minutes dans le blocage du réaccente à température ambiante, suivie de l’étiquetage avec 100 microlitres de la solution anticorps d’intérêt.

Placez la lame étiquetée dans une boîte de Pétri de 100 x 15 millilitres sur un morceau de papier absorbant humidifié avec deux millilitres d’eau stérile, et placez le plat fermé, à quatre degrés Celsius pendant la nuit, à l’abri de la lumière. Le lendemain matin, lavez l’échantillon trois fois avec pbs comme démontré, et montez l’échantillon avec 10 microlitres d’une solution de montage appropriée et d’un glissement de couverture en verre. Sceller ensuite le bordereau de couverture avec du vernis à ongles clair.

Pour l’image des échantillons de cytospun, chargez la diapositive sur un microscope fluorescent droit avec une plate-forme motorisée X Y, et sélectionnez un objectif 20x et les canaux appropriés en fonction des fluorophores utilisés pour l’étiquetage des anticorps. Allumez la lampe au mercure et adaptez le microscope et les logiciels associés à une pousse semi-automisée. Lorsque la lampe est prête, dans le menu d’acquisition, définissez les quatre canaux, définissez le temps d’exposition et définissez les tuiles à numériser.

Cliquez sur les tuiles, et l’expérience avancée, et définir la zone à numériser. Ajustez ensuite l’accent sur l’écran et cliquez sur démarrer l’expérience. À la fin de l’expérience, exportez les fichiers TIF pour chaque canal, et nommez spécifiquement le fichier pour inclure l’échantillon, le nombre de fois, le colorant et le nombre de sous-tuiles.

Pour l’analyse d’images, ouvrez le logiciel d’analyse d’image à partir du site Web du Broad Institute et cliquez sur fichier, pipeline à partir du fichier et analyse de quatre canaux CTC. Déposez les fichiers dans la liste des fichiers et mettez à jour les métadonnées pour regrouper les fichiers par vignettes. Cliquez ensuite pour analyser les images pour ouvrir le fichier de feuille de calcul correspondant aux paramètres d’intensité de la mesure.

Sans le protocole optimisé de décontamination, une contamination bactérienne élevée est observée dans les cultures tissulaires des lignées cellulaires A549 enrichies après seulement 24 heures, causant la mort et des changements cytomorphologiques dans les cellules eucaryotes. En revanche, après le protocole de nettoyage, les cellules vivantes d’A549 sont obtenues dans les cultures 2D après 10 heures de culture de tissu et d’enlèvement moyen, dans des conditions de culture 3D, et dans des échantillons de patient. À l’aide d’un test de coloration immunofluorescent liquide ou d’un test de coloration immunofluorescent sur des diapositives recouvertes de polylysine avec cytospin, une distinction claire dans le nombre de noyaux énumérés entre les deux analyses peut être observée.

Sans l’étape de cytospin, il est difficile de différencier les globules blancs des cellules de tumeur, en raison des contours flous dans les préparations de cellules non-cytospin. Ici, différents résultats représentatifs de différents échantillons de patients peuvent être observés, avec le nombre résiduel des globules blancs en particulier déterminé pour être fortement variable, et dépendant de l’échantillon de sang entier. Une variabilité élevée a été également observée dans les sous-populations circulantes de cellules de tumeur obtenues.

Chaque cellule sur le cytospin est identifiée par le logiciel d’analyse d’image, et permet le suivi des cellules et manuellement pour confirmer les résultats si nécessaire. En effet, une analyse pilote a démontré une concordance entre l’énumération manuelle et l’énumération des logiciels d’analyse d’images. La configuration de la boîte de Pétri humide conçue à l’interne pour l’hybridation protéine-anticorps est essentielle, car l’appareil reste suffisamment humide pendant toute la durée d’incubation.