Détection de l'activité de rétrotransposition des lignes-1 chaudes par PCR inverse à longue distance

Cette méthode peut détecter l’activité des rétrotranspositions appelées LINE-1. Ces éléments génétiques mobiles provoquent des insertions de novo dans les génomes du cancer et contribuent ainsi à l’instabilité génomique. L’avantage de cette technique basée sur le PCR est qu’elle est simple et rentable par rapport aux approches de séquençage à haut débit.

Nous démontrons ici son utilité dans la détection des insertions de novo qui proviennent d’une LIGNE-1 à l’intérieur du gène TTC28 sur le chromosome humain 22. L’activité LINE-1 peut servir de biomarqueur pour la malignité ou la pré-malignité, en particulier dans les types de tumeurs épithéliales, comme le cancer du côlon ou le cancer de l’ovaire serous de haut grade. Outre les insertions LINE-1, cette méthode peut détecter d’autres aberrations génomiques, telles que les réarrangements d’ADN qui ont toujours besoin d’être réarrangements pour une raison.

Afin de sélectionner une enzyme de restriction appropriée, et de concevoir des amorces inverses, Tout d’abord, téléchargez la séquence TTC28 LINE-1 en format FASTA à partir d’une base de données LINE-1, telle que L1Base. L’ID L1Base pour TTC28 Line-1 est de 135. Inclure cinq kilobases séquence, flanquant à la fois cinq premier et trois premier, fin de la séquence de ligne 1.

Exportez la séquence vers un traitement de texte. Ici, la séquence de flanc de la ligne 1 est annotée dans des séquences de police brune et de ligne 1 en police grise. Déterminer l’étiquette unique en une séquence kilobase en aval des trois premiers de la ligne TTC28 et dans l’un des outils de prédiction du signal de polyadnylation, tels que Polyadq ou Dragon PolyA Spotter.

Annotez tous les signaux de polyadenylation dans cette fenêtre kilobase. La séquence entre le signal de polyadenylation faible de TTC28 LINE-1 mis en évidence ici en rose et le signal de polyadenylation le plus fort en aval est l’étiquette unique de cette LIGNE-1 mise en évidence ici en jaune. Pour concevoir des amorces PCR inverses entrez la séquence de balise unique dans un outil de conception d’amorce basé sur le Web, comme Primer-BLAST de NCBI qui génère des amorces PCR spécifiques, gardez le paramètre de longueur du produit au minimum pour montrer que les paires d’amorce sont proches les unes des autres.

Sélectionnez la base de données du génome appropriée. Comme la sortie de Primer Blast génère des amorces PCR conventionnelles face à face, utilisez la fonction de complément inverse pour la paire d’amorce pour effectuer pcr inverse. Amorces inter-conception, correspondant au signal de polyadenylation est dans la mesure du possible.

Nous avons daigné trois paires d’amorce, mises en évidence en sarcelle et en vert, correspondant à trois signaux de polyadenylation forts dans l’étiquette unique de TTC28 LINE-1. Ensuite, pour sélectionner une enzyme de restriction appropriée, digérer la séquence LINE-1, ainsi que ses flancs de cinq kilobases en amont et en aval en silice à l’aide d’outils basés sur le Web, tels que RestrictionMapper. Cela donnera une liste complète des enzymes de restriction qui digère cette raison, générant différents fragments de restriction.

Sélectionnez les enzymes de restriction qui font une coupe de cinq premiers en amont des cinq extrémités principales de LINE-1 ou vers l’extrémité principale de cinq de la LIGNE-1 si elle est dans la LIGNE-1 elle-même. Et une carte de trois premiers en aval de l’étiquette unique. Le fragment de restriction natif avec séquence LINE-1 et son étiquette unique faite par des enzymes de restriction sélective, ne doit pas être plus long que 12 kilobases, car il pourrait ne pas être amplifié par PCR efficacement.

Notez que les enzymes de restriction sélective seraient insensibles à la méthylation de l’ADN, devraient être inactivables à la chaleur, et devraient générer des extrémités collantes qui sont complémentaires les unes aux autres. Afin de démontrer pcr inverse à longue distance, nous allons utiliser l’enzyme de restriction SacI qui coupe l’ADN sur les sites DAZCTC mis en évidence ici en vert clair. SacI remplit tous les critères du locus TTC28 LINE-1 et génère un fragment de restriction natif de 5 700 paires de base.

Extraire l’ADN génomique à partir d’échantillons à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN disponible dans le commerce qui est capable d’extraire de l’ADN moléculaire de bonne qualité et élevé nécessaire pour la PCR inverse à longue distance. Ici, nous avons extrait l’ADN génomique de la lignée cellulaire mcf7 cancer du sein et le sang humain normal en utilisant l’instruction de fabrication. Mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un fluoromètre.

100 cents nanogrammes d’ADN sur un gel d’agarose de personne à côté d’un marqueur de poids moléculaire d’ADN pour vérifier la qualité et la quantité d’ADN. Pour faire des modèles circulaires d’ADN, digérer d’abord l’ADN avec l’enzyme de restriction appropriée. Ici, nous utilisons SacI pour digérer MCF7 et l’ADN génomique du sang Faire un mélange de réaction de digestion selon le protocole de texte.

Mélanger la solution en faisant glisser brièvement le tube et la centrifugeuse. Incuber le mélange de réaction à 37 degrés Celsius pendant une heure suivi de l’inactivation thermique, selon les instructions du fabricant. Ensuite, faire une solution de mélange maître de réaction de ligature selon le protocole de texte pour auto-ligate l’ADN digéré.

Pour chaque réaction, ajouter 30 microlitres de ce mélange maître de réaction de ligature directement à 50 microlitres de solution d’ADN digérée de l’étape précédente. Mélanger la solution en faisant glisser brièvement le tube et en centrifugant le tube. Incuber ce mélange de réaction dans un cycleur thermique à 22 degrés Celsius pendant 10 minutes, terminant par une étape d’inactivation thermique à 60 degrés Celsius pendant encore 10 minutes.

Ce modèle d’ADN circulaire sera utilisé dans l’étape PCR inverse ultérieure. Réglez un gradient de température annealing dans un cycleur thermique pour déterminer la température optimale d’annealing d’amorce par PCR de gradient. Préparez un mix maître pour le PCR en combinant et en mélangeant tous les composants selon le protocole de texte.

Configurer une réaction pour chaque température d’annealage dans le gradient. Pour chaque réaction, allouer 19 microlitres du mélange principal tubes PCR et ajouter un microlitre de modèle d’ADN circulaire, généré à partir de l’ADN génomique du sang. Exécutez le programme PCR gradient.

Exécutez six microlitres de produit PCR, chauffez-le à une température d’annealage différente en un seul cours en gel agarose. Pour détecter l’activité de rétrotransposition de novo TTC28 LINE-1 dans le génome de la lignée cellulaire MCF7, effectuez la PCR à l’aide d’une paire d’amorce inverse sur des modèles d’ADN circulaires, générés à partir de la lignée cellulaire MCF-7. Suivez les mêmes instructions que pour le gradient PCR, mais cette fois en remplaçant le gradient de température par une température d’annealing optimale, qui est de 64 degrés Celsius.

Analyser les produits PCR inverses longue distance par gel d’agarose pour les résultats. Cette image de gel d’agarose prise après une électrophoreses montre l’ADN génomique extrait de MCF7 et les échantillons de sang ont le poids moléculaire élevé, le rendant approprié pour pcr inverse de longue distance. Cette image de gel agarose prise après électrophoreses montre que la paire inverse d’amorce que nous avons conçue amplifie le modèle circulaire correct à toutes les températures d’annealing dans le gradient comme observé par la portée intense entre 5 kilobase et marqueur d’ADN de sept kilobase.

Cependant, diverses bandes sont également observées à des températures plus basses, ce qui indique une faible spécificité de l’amorce et de mauvaises températures d’annealing. Ainsi, pour cette paire d’amorce, 64 degrés Celsius est la température d’annealing optimale. Cette image de gel d’agarose montre le produit de PCR obtenu après exécution du PCR inverse de longue distance sur l’ADN extrait de la ligne cellulaire de MCF7 et du sang normal.

Un produit PCF de 5 700 paires de base, marqué par un astérisque, représente le PCR indigène correspondant à la ligne 1 à son locus indigène. Ce produit PCR indigène est visible dans MCF7 et l’ADN sanguin normal. La rétrotransposition De novo LINE-1 et le génome de MCF7 sont détectables en tant que produit PCR de différentes tailles, ainsi que le produit PCR indigène dans le gel agarose.

Le séquençage du produit PCR inverse à longue distance par des technologies de séquençage à longue lecture monolé moléculaires peut permettre d’identifier l’identification des cibles dans une résolution à étanchéité nucléaire. Bien qu’il soit également possible d’avoir une approche lourde, le clonage et le séquençage du produit PCR inverse à longue distance sont également possibles. Dans cette vidéo, l’activité d’un LINE-1 sur le chromosome 22 a été détectée.

Le même flux de travail peut être adapté pour surveiller d’autres LINE-1 qui sont actifs dans différents types de tumeurs.