Une nouvelle nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Méthode pour la mesure intracellulaire Ca2 avec Fura-2-Analog dans les cellules vivantes
20 septembre 2019
En raison du chevauchement spectral des longueurs d'onde d'excitation et d'émission des analogues NADH et fura-2, l'interférence du signal des deux produits chimiques dans les cellules vivantes est inévitable lors de la mesure quantitative de [Ca2']. Ainsi, une nouvelle méthode de correction en ligne de l'interférence du signal NADH pour mesurer [Ca2]a été développée.
Les sondes plurielles excitables UV, ont une contamination inhérente au signal, en raison des sons auto-pluriels. La plupart du problème avec NADH, est de limiter l’utilisation d’une sonde plurielle. Une méthode peut être utilisée, pour corriger avec précision la florescence externe du NADH, afin d’extraire un véritable signal de sonde pluriel non contaminé.
Jeong Hoon Lee, notre professeur adjoint de recherche de mon laboratoire, démontrera la procédure. Après avoir permis aux myocytes de s’installer au fond du tube, aspirer le surnatant. Étiquetez les cellules avec deux millilitres de solution de dilution diluante fura-2-FFAM fraîchement préparée pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, placer le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en position verticale avant d’enlever le supernatant. Ajouter ensuite quatre millilitres de milieu de culture de température ambiante pour le stockage à température ambiante. Pour in situ isobestic fura-2-ffa point d’identification monter les cellules diluées sur le stade du microscope et attendre trois minutes pour les cellules de couler vers le fond.
Profuse NADH-libre de 37 degrés Celsius solution sans calcium dans la culture cellulaire et de localiser une cellule cible. Profuse solution saponine pendant 60 secondes avant de ré-profusing avec la solution sans calcium SANS NADH. Mesurez simultanément les signaux émis fura-2-ff à 450 et 500 nanomètres, à l’aide d’un balayage d’excitation de 350 à 365 nanomètres avec une étape de 0,1 nanomètre et ré-profuse avec nadh-libre solution sans calcium.
Ensuite, soustrayez les signaux dans la solution saturée de calcium des signaux dans les conditions sans calcium. Calculez ensuite les écarts types de l’émission à chaque excitation et sélectionnez la longueur d’onde d’excitation montrant les valeurs minimales d’écart type en tant que points isobestic individuels. Pour utiliser un système de mesure multi-paramétrique pour détecter le signal d’arrière-plan et pour corriger le signal dans la zone cellulaire, monter des cellules sans colorant dans le bain microscope et permettre aux cellules de se contenter de trois minutes.
Profuse NADH solution sans calcium dans le bain pendant environ cinq minutes à une vitesse de deux à trois millilitres par minute et mettre le champ d’objet pour couvrir la cellule ciblée. Après avoir sorti la cellule du champ, mesurez les signaux de fond de la fenêtre sans cellule et réglez les signaux comme des décalages. Retournez ensuite la cellule à la position initiale et mesurez les signaux de fond cellulaire et la zone cellulaire.
Pour calculer le facteur R, utilisez le fond cellulaire acquis et les signaux de zone avant de remonter les cellules sans colorant sur le microscope et de profuser avec une solution sans calcium. Mesurez les signaux comme indiqué avant de profuser la suspension cellulaire avec une solution malate. Après avoir mesuré les signaux profuse les cellules avec la solution pyruvate suivie de profusion avec la solution malate-pyruvate et la solution de rotenone.
Calculez ensuite la pente pour chaque signal. Ici, les changements dans le calcium mitochondrial avant et après la correction sont montrés. Les résultats indiquent clairement des changements substantiels dans le calcium mitochondrial avec une concentration mitochondrique de calcium de repos sans calcium cytosolic de 1.03 plus ou moins 0.13 micromolar et calcium mitochondrique maximum à un micromolaire de calcium de 29.6 plus ou moins 1.61 micromolar.
Le potentiel transmembrane mitochondrial a été surveillé avec une profusion de deux nanomolaires TMRE. Le changement dans le potentiel mitochondrial a été calculé basé sur un potentiel initial supposé de membrane mitochondrique de moins 150 millivolts, démontrant une diminution de NADH en réponse à l’addition de calcium, avec un effet négligeable sur le potentiel mitochondrique de membrane. Le pH mitochondiral n’a pas été réalisé par l’augmentation du calcium mitochondrial induite par la charge carboxy SNARF-1.
Des points isobestiques incorrects entraînent une correction incorrecte de R et de NADH. Prenez donc soin de toujours mesurer correctement le fond sans cellule et la zone cellulaire. Cette technique est utilisée pour préparer des études dynamiques mitochondriques sur le calcium dans les déversements bioanalytiques.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cette étude aborde le défi des interférences de signal provenant du NADH et des analogues de la fura-2 lors de la mesure des concentrations de calcium dans des cellules vivantes. Une nouvelle méthode de correction en ligne a été mise au point pour améliorer la précision des mesures de [Ca2+] en présence d'une contamination par le signal du NADH.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Interférences du signal dans les mesures de fluorescence
- Mesure du calcium dans des cellules vivantes
- Développement de techniques de correction
Contexte
- Le recouvrement spectral des longueurs d'onde d'excitation et d'émission complique les mesures.
- Le NADH peut limiter l'utilité de plusieurs sondes en microscopie de fluorescence.
- Des mesures précises de [Ca2+] sont cruciales dans les études cellulaires.
Méthodes utilisées
- Mesure de la fluorescence avec le fura-2
- Essais cellulaires avec des myocytes
- Techniques de correction du signal et mesure du fond
Résultats principaux
- Des changements importants des concentrations calciques mitochondriales observés.
- Développement d'une approche systématique pour corriger l'interférence de la NADH.
- Validation de la technique par des procédures expérimentales rigoureuses.
Conclusions
- L'étude démontre avec succès une méthode permettant d'améliorer la précision des mesures de fluorescence.
- Cela a des implications pour les analyses quantitatives en biologie cellulaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La mesure précise du calcium intracellulaire est essentielle pour la validation de cibles en découverte pharmaceutique, notamment pour les voies de signalisation mitochondriales. L'autofluorescence du NADH introduit une interférence importante dans les dosages fondés sur le fura-2, compromettant la fiabilité des données et augmentant les taux de faux positifs lors du criblage précoce. Cette méthode de correction du NADH améliore la confiance prédictive en isolant les véritables signaux calciques, soutenant ainsi la détection des mécanismes à risque dans les programmes ciblant les affections cardiovasculaires et métaboliques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier le rôle du calcium mitochondrial comme hypothèse thérapeutique dans les modèles de maladie.
- Valeur opérationnelle : Réduit l'ambiguïté mécanistique en séparant l'autofluorescence de la NADH des signaux réels de la fura-2.
- Valeur prédictive : Améliore la confiance dans la cible grâce à des mesures quantitatives des flux de calcium sans interférence.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l'essai : Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage de composés en aval en établissant une fluorescence corrigée de NADH.
- Reproductibilité : Normalise le choix de la longueur d'onde d'excitation par la détermination d'un point isobestique, réduisant ainsi la variabilité entre les essais.
- Capacité de multiplexage : Permet la mesure simultanée de NADH, du calcium et du pH ou du potentiel membranaire à l’aide de jeux distincts d’excitation/émission.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Directement applicable aux modèles de dysfonctionnement mitochondrial dans les troubles neurodégénératifs et métaboliques.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre les observations de flux calcique en phase de découverte et la validation préclinique à l’aide de signaux corrigés de fura-2-FF.
- Progrès ajusté au risque : Permet des décisions plus fiables d’aller/arrêt en réduisant les signaux faux dans les dosages du calcium mitochondrial.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur une cible à l'identification d'un composé précurseur, jusqu'à la validation mécanistique préclinique, spécifiquement pour les cibles mitochondriales.
- Biologie de la découverte : Facilite l'élucidation des voies biologiques en isolant les signaux dépendants du calcium des interférences métaboliques dans les tests sur cellules vivantes.
- Criblage : Améliore la prête-disposition des tests grâce à la soustraction du fond et à la correction du décalage, augmentant ainsi le rapport signal/bruit pour l'évaluation des composés.
- Analytique : Permet des mesures quantitatives ratiométriques par le calcul du facteur R à l’aide des émissions corrigées à 450 nm et 500 nm.
- Recherche translationnelle : S’inscrit dans les travaux précliniques par la surveillance simultanée du calcium et du potentiel de membrane mitochondriale à l’aide de TMRE.
- Réutilisation en entreprise : Met en place un cadre de correction réutilisable, applicable à différents types cellulaires et sondes fluorescentes sujettes aux interférences de NADH.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en éliminant les faux positifs induits par le NADH dans la signalisation calcique.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à l'identification systématique du point isobestique et à la soustraction du fond.
- Valeur stratégique : Permet de prendre de meilleures décisions d'orientation (go/no-go) en réduisant le bruit biologique dans les cascades de criblage précoce.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles mitochondriales grâce à des lectures fonctionnelles fiables et exemptes d'interférences.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie à fluorescence et en manipulation de sondes ratiométriques.
- Exige un instrument capable de balayer les longueurs d'onde d'excitation (350–365 nm) et de détecter une émission double (450 nm, 500 nm).
- Implique une standardisation interéquipes des mesures du signal de fond et des protocoles de correction de décalage.
- Suppose des adaptations lors de l'application de la méthode à différents protocoles de préparation de cellules sans colorant.
- Dépend d'une mesure minutieuse des signaux de fond sans cellules et de la surface cellulaire afin d'éviter une sélection incorrecte du point isobestique.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Mitochondrial Fluoroprobe Loading
1:22
In Situ Isosbestic Fura-2-FF Point Identification
2:40
Background Signal Detection and Cell Area Correction
3:30
R Factor Measurement
4:12
Results: Representative Intracellular Ca2+ Measurement
5:15
Conclusion
