Name: Analyse du contenu des gouttelettes lipidiques dans les levures de fission et les levures en herbe à laide du traitement automatisé de limage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Découvrez une méthode automatisée d'analyse quantitative des gouttelettes lipidiques dans Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicus et Saccharomyces cerevisiae par microscopie à fluorescence. Ce protocole standardisé permet des études comparatives à haut débit du métabolisme lipidique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par les subventions de l'Université Charles PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 et SVV 260310. Nous remercions Ondôej Ebesta pour son aide dans le développement de la microscopie et le développement du pipeline d'analyse d'images. Nous remercions le laboratoire ReGenEx pour les souches De Cervisiae, et le laboratoire de JapoNet et Hironori Niki pour les souches de S. japonicus. La souche ppc1-88 a été fournie par The Yeast Genetic Resource Center Japan. La microscopie a été réalisée dans le Laboratoire de microscopie Confocal et Fluorescence cofinancé par le Fonds européen de développement régional et le budget de l'Etat de la République tchèque (Projet no. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 et CZ.2.16/3.1.00/21515).

1. Préparation de solutions et de médias
<ol><li>
Préparer la solution de coloration lipidique.
	<ol>
<li>Pour préparer la solution de coloration lipidique de stock dissoudre 10 mg de BODIPY 493/503 dans 10 ml de DMSO anhydre (concentration finale 1 mg/mL). Dissoudre la teneur entière d'une flacon BODIPY 493/503 de 10 mg pour éviter la perte de matière pendant la pesée. MISE EN GARDE: DMSO peut passer à travers la peau. Portez l'équipement de protection individuelle approprié.</li>
		<li>Préparer la solution de coloration lipidique de travail en mélangeant 100 'L de la solution de 1 mg/mL BODIPY 493/503 stock et 900 'L de DMSO anhydre (concentration finale 0.1 mg/mL).</li>
		<li>Aliquot le stock et les solutions de travail, et stocker à -20 oC. REMARQUE: Le BODIPY 493/503 dissous est stable depuis plusieurs années à -20 oC. Cependant, la solution doit être protégée de l'humidité et de la lumière.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour préparer la solution de stock pour la visualisation de limite cellulaire, dissoudre 25 mg de dextran bleu de cascade (flacon entier) dans 2,5 ml d'eau déionisée (concentration finale 10 mg/mL). Aliquot la solution de stock et le stocker à -20 oC protégé de la lumière.</li>
	<li>Pour préparer la solution de revêtement de glissement de microscope, dissoudre 5 mg de lectine de soja dans 5 ml d'eau déionisée (concentration finale 1 mg/ml). Aliquot la solution de lectine et stocker à -80 oC. REMARQUE: La solution de lectine est stable depuis plusieurs années à -80 oC. Les Aliquots actuellement en service peuvent être stockés à -20 oC.</li>
	<li>
Préparer les supports de culture.
	<ol>
<li>Pour préparer 400 ml de milieu de culture OUI complexe pour S. pombe et S. japonicus, dissoudre 2 g d'extrait de levure et 0,1 g de suppléments SP (si nécessaire pour les mutants auxotrophiques) dans 340 mL d'eau déionisée dans une bouteille de 500 ml et autoclave. Ajouter 60 ml de 20 % (w/v) de glucose séparément autoclave ou stérilisé par filtre dans des conditions aseptiques.</li>
		<li>Pour préparer 400 ml de milieu de culture EMM défini pour S. pombe et S. japonicus, dissoudre 4,9 g de bouillon EMM sans dextrose dans 360 mL d'eau déionisée dans une bouteille de 500 ml et autoclave. Ajouter 40 ml de 20 % (w/v) de glucose séparément autoclave ou stérilisé par filtre dans des conditions aseptiques. REMARQUE: Pour les lignes directrices générales sur S. pombe et S. japonicus culture voir25 et26, respectivement.</li>
		<li>Préparer 300 ml de milieu de culture Complexe de YPAD pour Saccharomyces cerevisiae,dissoudre 3 g d'extrait de levure, 6 g de peptone et 30 mg de sulfate d'adénine dans 270 mL d'eau déionisée dans une bouteille de 500 ml et autoclave. Ajouter 30 ml de 20 % (w/v) de glucose séparément autoclave ou stérilisé par filtre dans des conditions aseptiques.</li>
		<li>Pour préparer 300 ml de milieu minimal défini pour S. cerevisiae, dissoudre 2 g de base d'azote de levure (sans acides aminés) dans 270 mL d'eau déionisée dans une bouteille de 500 ml et autoclave. Ajouter 30 ml de 20 % (w/v) de glucose séparément autoclave ou stérilisé par filtre dans des conditions aseptiques. REMARQUE: Pour les lignes directrices générales sur la culture S. cerevisiae voir27.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultivation cellulaire
<ol><li>
Croissance de S. pombe ou S. japonicus à la phase exponentielle ou stationnaire précoce.
	<ol>
<li>Le matin, inoculer 5 ml de OUI moyen avec de la biomasse de levure de fission fraîche. Incuber à 32 oC en secouant (180 tr/min) pendant plusieurs heures. REMARQUE: Pour toutes les cultures, utilisez des flacons Erlenmeyer ayant 10 fois le volume de culture pour assurer une bonne aération. Certains laboratoires préfèrent cultiver des levures de fission à 30 oC, mais la température de culture de 32 oC entraîne des temps de doublement plus courts sans effets néfastes sur les cellules, réduisant ainsi le temps total requis pour effectuer une expérience25,28 .</li>
		<li>En fin d'après-midi du même jour (après au moins 6 heures de culture), diluer la culture avec un oui frais moyen à un volume de culture final de 10 ml afin qu'il atteigne la densité optique désirée (OD) (ou le nombre de cellules/mL) le lendemain matin, et couver à 32 oC avec s haking (180 tr/min). Il est avantageux de connaître le temps de doublement de chaque souche utilisée pour déterminer avec précision le facteur de dilution (utiliser l'équation 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59889/59889eq01v3.jpg"> Là où laculture Vest le volume de préculture nécessaire à la dilution, Vfinal est le volume total de la nouvelle culture (10 ml pour les cultures standard), oDfinale est l'OD souhaitée à atteindre le le lendemain matin, lecourant oDest l'OD actuellement mesuré de la préculture, t est le temps de la croissance cellulaire jusqu'à la récolte, tlag est la durée de la phase de décalage (dépend des conditions de laboratoire, doit être empiriquement définies) et tDT est le temps de doublement de la souche. REMARQUE: Lorsque les cellules de phase exponentielle doivent être analysées, ne laissez pas les précultures atteindre la phase stationnaire, car cela modifie considérablement la physiologie cellulaire (y compris la teneur en LD) pour plusieurs générations suivantes.</li>
		<li>Le matin du jour de l'imagerie, si la culture atteint une OD légèrement plus élevée que nécessaire (en cas de cellules de phase exponentielle), diluez-la avec un OUI frais et continuez l'incubation pendant au moins deux fois de plus avant de les colorer. Autrement, procéder directement à coloration (section 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Croissance de S. cerevisiae à la phase exponentielle et stationnaire.
	<ol>
<li>Dans l'après-midi, inoculer 10 ml de YPAD moyen avec une petite quantité de biomasse de levure fraîche en herbe et incuber toute la nuit à 30 oC avec des secousses (180 tr/min).</li>
		<li>Le matin du jour d'imagerie, diluer la culture à OD 0.1 dans 10 mL de milieu YPAD et de croître à l'OD requis (par exemple, OD 1 pour la phase exponentielle). Effectuer toutes les dilutions de culture telles que décrites à l'étape 2.1.2. Procéder à la coloration (section 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Taches de gouttelettes de lipide
<ol><li>Préparer un bordereau de couvercle de microscope pour chaque échantillon à être photographié. Étendre 1 ll de solution de revêtement coulissant sur un bordereau de couverture propre à l'aide du long côté d'une pointe de pipette positionnée horizontalement. Laissez sécher complètement la solution de revêtement et conservez les bordereaux de couverture dans un environnement sans poussière. REMARQUE: Les glissières et les lames de verre peuvent être nettoyés avant d'être utilisés si nécessaire. La procédure de nettoyage consiste à laver avec du détergent à vaisselle, le rinçant à l'eau, le trempage de nuit dans l'acide chlorhydrique de 3%, et le lavage avec de l'eau distillée. Les glissières et les couvercles nettoyés sont stockés dans de l'éthanol pur jusqu'à leur utilisation.</li>
	<li>Mesurer l'OD de la culture cellulaire ou le nombre de cellules/mL, au besoin. Essayez d'atteindre des valeurs similaires parmi toutes les souches testées pour assurer des conditions expérimentales comparables.</li>
	<li>Pipette 1 ml de chaque culture cellulaire à un tube microcentrifuge de 1,5 ml. Pour S. cerevisiae seulement, ajouter 5 l de la solution de revêtement de la diapositive, vortex brièvement, et incuber à 30 oC en secouant pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter brièvement 1 L de la solution de coloration lipidique à chaque culture aliquot et vortex. Ensuite, ajoutez brièvement 10 L de la solution de visualisation de la limite cellulaire et vortex. REMARQUE: Ne préparez pas de solutions prémélangées des deux taches, car cela conduit à l'étanchéité de la fluorescence de BODIPY 493/503.</li>
	<li>Recueillir les cellules par centrifugation (1 000 x g, 3 min, RT) et enlever presque tous les supernatants (950 l). Resuspendre les cellules du supernatant restant.</li>
	<li>Pipette 2 -L de la suspension cellulaire dense sur un couvercle enduit de lectine et placez-la sur une lame de microscope propre. Les cellules doivent former une monocouche. Procéder à la microscopie (section 4) le plus rapidement possible afin de minimiser les artefacts en imagerie; traiter un maximum de deux échantillons à la fois.</li>
</ol>4. Mise en place du microscope et de l'imagerie
<ol><li>
Optimiser les conditions d'imagerie. REMARQUE : La mise en place du microscope nécessite de longues expositions à de fortes sources de lumière qui pourraient endommager l'échantillon et fausser les résultats. Par conséquent, configurez les conditions d'imagerie à l'aide d'une diapositive d'échantillon dédiée qui ne sera pas utilisée pour la quantification de LD.<ol>
<li>Concentrez-vous sur les cellules à l'aide d'un contraste de phase ou d'un contraste d'interférence différentiel (DIC). REMARQUE: Les images de contraste de phase ou de DIC peuvent être prises pour référence, mais elles ne sont pas utilisées pendant l'étape automatisée d'analyse d'image.</li>
		<li>Définir les paramètres de la pile z pour couvrir l'ensemble du volume de la cellule. La distance verticale totale dépend de la taille de la cellule; le nombre de tranches optiques dépend de l'ouverture numérique de l'objectif (fonction de propagation de points dans l'axe Z). Définir la mise au point pour se déplacer par rapport au plan focal central. REMARQUE: Le nombre optimal de tranches est souvent fixé par le logiciel de contrôle au microscope et n'a pas besoin d'être calculé manuellement. Les largeurs de cellules typiques sont de 3-5 m pour S. pombe,4-7 'm pour S. japonicus, et 3-7 'm pour S. cerevisiae.</li>
		<li>Pour imager les LD, définir l'intensité lumineuse et le temps d'exposition dans le canal vert (les maxima d'excitation et d'émission de BODIPY sont respectivement de 493 et 503 nm). REMARQUE: BODIPY 493/503 est un fluorochrome très lumineux; cependant, il peut obtenir blanchi rapidement avec l'intensité lumineuse excessivement forte. En outre, les LD sont mobiles dans les cellules vivantes, minimisant ainsi le temps d'exposition et capturent d'abord la pile z à canal vert (avant de passer au canal bleu) pour éviter de brouiller les artefacts. En outre, prendre en compte la portée linéaire de la caméra pour l'intensité du signal pour éviter les pixels saturés.</li>
		<li>Pour imager les limites cellulaires, fixez l'intensité de la lumière et le temps d'exposition dans le canal bleu (les maxima d'excitation et d'émission de Cascade Blue dextran sont de 400 et 420 nm, respectivement). REMARQUE: L'intensité du signal dans le canal bleu est nécessaire pour la segmentation de l'image, mais elle n'est pas utilisée pour la quantification LD elle-même. Par conséquent, les paramètres optimaux dans ce canal ne sont pas cruciaux pour l'analyse.</li>
		<li>Si possible, créez un flux de travail expérimental automatisé dans le logiciel de contrôle au microscope pour faciliter l'imagerie de plusieurs échantillons dans des conditions normalisées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Une fois que les conditions d'imagerie ont été optimisées, des échantillons d'images doivent être utilisés pour la quantification. Concentrez-vous sur les cellules et imagez-les en canaux verts et bleus tels que décrits à l'étape 4.1. REMARQUE: Toutes les images doivent être acquises en utilisant les mêmes paramètres pour permettre la comparaison entre les échantillons. Imagez plusieurs champs de vue par échantillon pour obtenir des données fiables et représentatives.</li>
	<li>Enregistrez les images de z-stack de canaux bleus et verts sous forme de fichiers TIFF multicouches 16 bits (c.-à-d. deux fichiers par champ de vision). Inclure les mots « vert » ou « bleu » dans les noms de fichiers correspondants. Procéder à l'analyse d'image (section 5).</li>
</ol>5. Analyse d'image
<ol><li>
Vérifier visuellement la qualité des images acquises.
	<ol>
<li>Ouvrez des images microscopiques dans ImageJ29,30 ou tout autre logiciel d'analyse d'image approprié.</li>
		<li>Supprimer toutes les piles d'images contenant un nombre considérable de cellules qui se sont déplacées lors de l'acquisition (et ont ainsi créé des artefacts flous).</li>
		<li>Enlever toutes les piles d'images contenant des particules non cellulaires très fluorescentes dans le canal bleu (p. ex., saleté sur la glissière ou le glissement de couverture au microscope, impuretés dans le milieu de culture). REMARQUE: Les objets non cellulaires très brillants dans le canal bleu peuvent créer des artefacts de détection cellulaire ou interférer avec la détection des cellules dans leur voisinage.</li>
		<li>Enlevez toutes les piles d'images contenant une grande proportion de cellules mortes (c.-à-d. cellules avec fluorescence bleue accrue par rapport aux cellules vivantes). REMARQUE: Bien que la présence d'une petite proportion de cellules mortes dans l'échantillon ne soit généralement pas un problème et que ces cellules soient automatiquement rejetées au cours de l'analyse, certaines cellules mortes ou mourantes peuvent parfois être reconnues comme cellules vivantes par l'algorithme de segmentation et biaiser les résultats rapportés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analysez les images dans le logiciel MATLAB.
	<ol>
<li>Créez un dossier principal et copiez tous les scripts MATLAB à cet emplacement.</li>
		<li>Créez un sous-dossier ("pombe", "cerevisiae" ou "japonicus") et copiez les fichiers d'images TIFF à cet endroit.</li>
		<li>Démarrer MATLAB, ouvrir le script MAIN.m et l'exécuter. Dans le menu, sélectionnez les espèces de levures à analyser et commencez le traitement de l'image. REMARQUE: Certains des paramètres requis pour la détection cellulaire et LD sont pré-réglés pour l'espèce particulière, d'autres sont déterminés automatiquement pendant le traitement de l'image. Les valeurs préétablies ont été déterminées empiriquement et dépendent de plusieurs facteurs tels que le grossissement objectif, le type et la sensibilité de la caméra, et les paramètres d'imagerie. Si nécessaire, les utilisateurs peuvent modifier les fichiers de script pour modifier les préréglages spécifiques à l'organisme afin de mieux refléter leur configuration expérimentale. À savoir, lors de la reconnaissance cellulaire, les tailles d'objets acceptables sont données par les paramètres "minArea" et "maxArea", et la fraction minimale du volume rempli dans les limites de l'objet est donnée par le paramètre "Solidity". Pour la reconnaissance LD, le seuil de luminosité est donné par le paramètre "th" (sa valeur est principalement affectée par la profondeur du bit d'image et l'intensité du signal de fluorescence), et la taille maximale acceptable LD est donnée par le paramètre "MaxArea".</li>
		<li>Inspecter et traiter les fichiers de sortie au besoin à l'aide d'un éditeur de feuilles de calcul ou d'un paquet statistique; le flux de travail produit des fichiers CSV séparés par les points-virgules et segmenté les fichiers TIFF avec des objets cellulaires et des LD détectés. REMARQUE: Le flux de travail segmente les images en arrière-plan et en objets cellulaires, où chaque objet cellulaire peut être composé de plusieurs cellules adjacentes. Par conséquent, la sortie dans les fichiers "xxxx-cells.csv" ne représente pas les données unicellulaires et ne doit être utilisée que pour calculer les métriques par unité de volume de cellule.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+lipids+of+yeasts%3A+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%2C+Pichia+pastoris%2C+and+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li>
<li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+fat%3A+lipid+droplets+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li>
<li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li>
<li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li>
<li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+deletion+collection%3A+a+decade+of+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li>
<li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast%2C+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+%28Seoul%2C+Korea%29%22%5BJournal%5D)">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li>
<li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li>
<li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li>
<li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8(2016).</li>
<li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC%2FC+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+To+Cells%3A+Devoted+To+Molecular+%26+Cellular+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li>
<li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+%28BODIPY%29+Derivatives+in+Liquids%2C+Lipid+Membranes%2C+and+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li>
<li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692(2010).</li>
<li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li>
<li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li>
<li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li>
<li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li>
<li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast%3A+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li>
<li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li>
<li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1%2C6-diphenylhexatriene%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li>
<li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+Red+Quantifier%3A+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li>
<li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-content%2Fhigh-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li>
<li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li>
<li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta.+Molecular+and+Cell+Biology+Of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li>
<li>Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+%E2%80%9Ccut%E2%80%9D+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li>
<li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li>
<li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizosaccharomyces+japonicus%3A+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li>
<li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis%2C+quiescence-exit+failure%2C+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117(2012).</li>
<li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li>
<li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li>
<li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li>
<li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape%2C+microtubule+organization%2C+and+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La compréhension du métabolisme des lipides et de sa régulation est importante à la fois pour la biologie de base et pour les applications cliniques et biotechnologiques. Le contenu de LD représente une lecture commode de l'état de métabolisme de lipide de la cellule, avec la microscopie de fluorescence étant l'une des méthodes principales employées pour la détermination de contenu de LD. Le protocole présenté permet la détection automatisée et la description quantitative des LD individuels chez trois espèces de levures ...

Les lipides jouent un rôle crucial dans l'énergie cellulaire et le métabolisme du carbone, la synthèse des composants membranaires et la production de substances bioactives. Le métabolisme des lipides est affiné en fonction des conditions environnementales, de la disponibilité des nutriments et de la phase1du cycle cellulaire. Chez l'homme, le métabolisme des lipides a été relié à des maladies telles que l'obésité, le diabète de type II et le cancer2. Dans l'industrie, les lipides produits par les micro-organismes, comme les levures, représentent une source prometteuse de carburants diesel renouvelables3. Les cellules stockent les lipides neutres dans ce qu'on appelle les gouttelettes lipidiques (LD). Ces corps conservés de façon évolutive sont composés de triacylglycérols, d'esters de stéroyles, d'une monocouche phospholipide externe et de protéines associées1. Les LD proviennent du réticulum endoplasmique, exercent une dynamique du cycle cellulaire ou de la phase de croissance, et sont importants pour l'homéostasie lipidique cellulaire1. Le nombre De LD et la morphologie peuvent être utilisés comme un proxy commode en assérant le métabolisme de lipide dans diverses conditions de croissance ou en examinant un panneau de mutants. Compte tenu de leur nature dynamique, les techniques capables d'analyser les propriétés des LD individuels sont d'un intérêt particulier dans les études du métabolisme des lipides.
Diverses espèces de levures ont été utilisées pour décrire les voies métaboliques liées aux lipides et leur régulation, ou utilisées en biotechnologie pour produire des composés ou des carburants intéressants1. En outre, pour les levures modèles, telles que la levure en herbe Saccharomyces cerevisiae ou la levure de fission lointaine ment liée Schizosaccharomyces pombe, bibliothèques de souches de suppression à l'échelle du génome sont disponibles qui peuvent être utilisés pour le haut débit écrans4,5. Récemment la composition et la dynamique de LD ont été décrites dans S. pombe6,7,8,9, et les mutants liés au métabolisme de lipide ont été isolés dans la levure modèle émergente Schizosaccharomyces japonicus10.
De nombreuses techniques sont disponibles pour étudier le contenu et la dynamique LD. La plupart emploient une sorte de coloration de LD avec des colorants lipophiles tels que nile Red ou BODIPY 493/503. Ce dernier montre des spectres d'excitation et d'émission plus étroits, et une plus grande spécificité vers les lipides neutres (LD) par opposition aux phospholipides (membranes)11. Les méthodes fluormétriques et de flux-cytométrie ont été utilisées avec succès dans diverses espèces fongiques pour découvrir des gènes et des conditions de croissance qui affectent la teneur en lipides de stockage12,13,14,15. Bien que ces méthodes conviennent aux applications à haut débit, elles ne peuvent pas mesurer le nombre et la morphologie des LD individuels dans les cellules, qui peuvent différer considérablement entre les conditions de croissance et les génotypes. La diffusion cohérente de Raman ou la microscopie holographique numérique sont des méthodes sans étiquette qui produisent des données de niveau LD, mais exigent l'équipement coûteux spécialisé16,17,18. La microscopie fluorescence, d'autre part, peut fournir des données détaillées sur le contenu LD, tout en utilisant des instruments couramment disponibles et des outils logiciels d'analyse d'images. Plusieurs workflows d'analyse existent qui comportent divers degrés de sophistication et d'automatisation dans la détection de cellules/LD à partir des données d'image, et sont optimisés pour différents types de cellules, tels que les cellules métazoaires avec de grands LD19,20 , 21, ou levures en herbe17,22,23. Certaines de ces approches ne fonctionnent qu'en 2D (p. ex., sur des images de projection maximale), ce qui peut ne pas décrire de façon fiable le contenu LD cellulaire. À notre connaissance, aucun outil n'existe pour déterminer le contenu et la morphologie de LD à partir des données microscopiques de levure de fission. Le développement d'analyses automatisées et robustes au niveau de la LD apporterait une sensibilité accrue et une puissance statistique accrue, et fournirait des informations riches sur la teneur en lipides neutres, idéalement chez plusieurs espèces de levures.
Nous avons développé un flux de travail pour l'analyse du contenu LD à partir d'images de microscopie de fluorescence 3D de cellules de levure. Les cellules vivantes sont tachées de BODIPY 493/503 et de Dextran Cascade Blue pour visualiser les LD et déterminer les limites cellulaires, respectivement. Les cellules sont immobilisées sur des lames de verre et soumises à l'imagerie par la pile z à l'aide d'un microscope à épifluorescence standard. Les images sont ensuite traitées par un pipeline automatisé mis en œuvre dans MATLAB, un paquet (commercial) largement utilisé pour les analyses statistiques. Le pipeline effectue le prétraitement de l'image, la segmentation (cellules par rapport à l'arrière-plan, l'élimination des cellules mortes) et l'identification LD. Les données riches au niveau LD, telles que la taille du LD et l'intensité de la fluorescence, sont ensuite fournies dans un format tabulaire compatible avec les principaux outils logiciels de feuilles de calcul. Le flux de travail a été utilisé avec succès pour déterminer l'impact de la disponibilité des sources d'azote sur le métabolisme des lipides dans S. pombe24. Nous démontrons maintenant la fonctionnalité du flux de travail dans S. pombe, S. japonicus et S. cerevisiae, en utilisant des conditions de croissance ou des mutants qui affectent le contenu lD cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Caméra CCD monochromatique 12 bits Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td><td>Hamamatsu</td><td>&nbsp ;</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Sel d’hémisulfate d’adénine, &ge ; 99 %</td><td>Merck</td><td>A9126-25G</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentaméthyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3922</td><td>pour coloration lipidique neutre</td></tr><tr><td>D-(+) - Glucose, &ge ; 99.5 %</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10 000 MW, anionique, fixable à la lysine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1976</td><td>pour la coloration négative des cellules</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde, &ge ; 99,5 %</td> <td>de pureté Merck</td><td>D4540</td><td>ou supérieure, conserver anhydre sur tamis moléculaires</td></tr><tr><td>Bouillon EMM sans dextrose</td><td>Pour un milieu</td><td>PMD0405</td><td>peut également être préparé à partir de composants individuels</td></tr><tr><td>Logiciel Fiji/ImageJ</td><td>NIH&</td><td>nbsp ;</td><td>ou l’équivalent ; pour l’inspection visuelle de données microscopiques</td></tr><tr><td>Lunettes de protection de haute précision, 22 mm x 22 mm, n° 1.5</td><td>VWR</td><td>630-2186</td><td>utilisez n’importe quel verre de protection # 1.5</td></tr><tr><td>Image Processing Toolbox pour MATLAB, version 10.0</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp ;</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lectine de Glycine max (soja)</td><td>Merck</td><td>L1395</td><td>pour l’immobilisation cellulaire sur lames</td></tr><tr><td>logiciel MATLAB, version 9.2</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp ;</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lame de microscope, 26 mm x 76 mm, 1 mm d’épaisseur</td><td>Knittel Glass</td><td>L762601.2</td><td>utilisez n’importe quelle lame de microscope adaptée à votre platine de microscope, nettoyez soigneusement avant de charger les cellules</td></tr><tr><td>Microscope Olympus CellR avec mouvement automatique de l’objectif sur l’axe z</td><td>Olympus</td><td>&nbsp ;</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Le jeu de filtres Pentaband</td><td>Semrock</td><td>F66-985</td> en <td>fond clair, vert et bleu suffisent</td></tr><tr><td>Boîte à outils de traitement du signal pour MATLAB, version 7.4</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp ;</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Suppléments</td><td>SP Formedium</td><td>PSU0101</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ordinateur de bureau standard capable d’exécuter MATLAB.</td><td></td><td>&nbsp ;</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Statistics and Machine Learning Toolbox pour MATLAB, version 11.1</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp ;</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Peptone universel M66 pour la microbiologie</td><td>Merck</td><td>1070431000</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Objectif UPLSAPO 60XO</td><td>Olympus</td><td>&nbsp ;</td><td>ou équivalent</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Formedium</td><td>YEA03</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Base azotée de levure sans acides aminés</td><td>Formedium</td><td>CYN0405</td><td>&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

analyse du contenu des gouttelettes lipidiques dans les levures de fission et les levures en herbe à l'aide du traitement automatisé de l'image

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Le métabolisme des lipides et sa régulation sont d'intérêt pour les sciences de la vie de base et appliquées et la biotechnologie. À cet égard, diverses espèces de levures sont utilisées comme modèles dans la recherche métabolique lipidique ou pour la production industrielle de lipides. Les gouttelettes lipidiques sont des corps de stockage très dynamiques et leur contenu cellulaire représente une lecture pratique de l'état métabolique des lipides. La microscopie fluorescence est une méthode de choix pour l'analyse quantitative des gouttelettes lipidiques cellulaires, car elle repose sur un équipement largement disponible et permet l'analyse des gouttelettes lipidiques individuelles. En outre, l'analyse microscopique de l'image peut être automatisée, ce qui augmente considérablement le débit global de l'analyse. Ici, nous décrivons un flux de travail expérimental et analytique pour la détection automatisée et la description quantitative des gouttelettes lipidiques individuelles dans trois espèces différentes de levure modèle : les levures de fission Schizosaccharomyces pombe et Schizosaccharomyces japonicus, et la levure en herbe Saccharomyces cerevisiae. Les gouttelettes lipidiques sont visualisées avec BODIPY 493/503, et le dextran fluorescent à l'imperméabilité cellulaire est ajouté au support culturel pour aider à identifier les limites cellulaires. Les cellules sont soumises à une microscopie d'épifluorescence 3D dans des canaux verts et bleus et les images z-stack qui en résultent sont traitées automatiquement par un pipeline MATLAB. La procédure produit de riches données quantitatives sur la teneur en gouttelettes lipidiques cellulaires et les caractéristiques individuelles des gouttelettes lipidiques dans un format tabulaire adapté aux analyses en aval dans les principaux paquets de tabletur ou statistiques. Nous fournissons des analyses d'exemple de la teneur en gouttelettes lipidiques dans diverses conditions qui affectent le métabolisme des lipides cellulaires.

L'ensemble de la procédure est résumé e à la figure 1 pour les levures de fission (le flux de travail de levure en herbe est analogue), et ci-dessous nous fournissons des exemples de la façon dont le flux de travail peut être utilisé pour étudier la teneur en LD dans trois espèces de levures différentes dans diverses conditions connues d'affecter le contenu LD cellulaire. Chaque exemple représente une seule expérience biologique.
<...

Ici, nous présentons une implémentation de MATLAB de la détection automatisée et de la description quantitative des gouttelettes de lipide dans les images de microscopie de fluorescence des cellules de fission et de levure en herbe.

Analyse du contenu des gouttelettes lipidiques dans les levures de fission et les levures en herbe à l'aide du traitement automatisé de l'image

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Ce protocole facilite les analyses quantitatives à petite et à grande échelle de la teneur en lipides de stockage cellulaire chez une variété d’espèces de levure et le fait d’une manière impartiale et normalisée. La technique permet le traitement rapide des images microscopiques et fournit des extrants quantitatifs détaillés pour comparer facilement des échantillons tels que divers mutants et cellules cultivés dans diverses conditions. Pour commencer, suivez le protocole texte qui l’accompagne pour préparer les solutions de coloration, les médias culturels et les cellules.Assurez-vous que les cellules sont en bonne santé et dans la phase de croissance souhaitée avant d’exécuter l’expérience. Ensuite, préparez un coverslip microscope pour chaque échantillon à l’image. Étendre un microlitre de solution de revêtement de glissière sur un couvercle propre à l’aide du côté long d’une pointe de pipette positionnée horizontalement.Laissez sécher complètement la solution de revêtement, puis rangez les couvercles dans un environnement exempt de poussière. Ensuite, mesurez les densités optiques des cultures cellulaires et, pour que les cultures soient analysées dans la même phase de croissance, essayez d’atteindre des valeurs similaires parmi toutes les cultures testées afin d’assurer des conditions expérimentales comparables. Ensuite, pipette un millilitre de la culture cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Pour les cellules S.cerevisiae seulement, ajoutez cinq microlitres de la solution de revêtement de glissière au tube aussi bien. Puis, brièvement vortex tous les tubes de microcentrifugeuse, et les incuber à 30 degrés Celsius avec des secousses pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez un microlitre de la solution de coloration lipidique à chaque culture aliquot, et vortex brièvement.Ensuite, ajoutez 10 microlitres de la solution de visualisation des limites cellulaires et vortexez-les brièvement une deuxième fois. Recueillir les cellules en les centrifugant à 1000 fois la gravité pendant trois minutes à température ambiante. Une fois la filature terminée, retirer 950 microlitres du surnatant et resuspendre les cellules dans le supernatant restant à l’aide d’une pipette.Ensuite, pipette deux microlitres de la suspension cellulaire dense sur un coverslip enduit de lectine. Ensuite, placez le coverslip sur une lame de microscope propre pour former un monocouche cellulaire, et passez à la microscopie aussi rapidement que possible pour minimiser les artefacts dans l’imagerie. La mise en place du microscope nécessite de longues expositions à de fortes sources de lumière qui pourraient endommager l’échantillon et fausser les résultats.Par conséquent, configurer les conditions d’imagerie à l’aide d’une diapositive d’échantillon dédiée qui ne sera pas utilisée davantage pour la quantification des gouttelettes lipidiques. Placez l’échantillon dédié sur la scène d’un contraste de phase ou d’une configuration différentielle de microscope à contraste d’interférence, et concentrez-vous sur les cellules. Dans le logiciel du microscope, définissez les paramètres de la pile Z de sorte qu’ils couvrent l’ensemble du volume cellulaire.La distance verticale totale dépend de la taille de la cellule, et le nombre de tranches optiques dépend de l’ouverture numérique de l’objectif. Ensuite, mettez l’accent sur le déplacement par rapport au plan focal central. Pour imager les gouttelettes lipidiques, réglez expérimentalement l’intensité lumineuse et le temps d’exposition dans le canal vert.Soyez prudent lors de l’imagerie, car BODIPY est un fluorochrome très lumineux qui peut être rapidement photobleached. En outre, réduisez au minimum le temps d’exposition pour éviter la sursaturation. Capturez d’abord le canal vert complet Z-stack avant de passer au canal bleu pour éviter de brouiller les gouttelettes mobiles de lipides.Pour les limites des cellules d’image, réglez expérimentalement l’intensité lumineuse et le temps d’exposition dans le canal bleu. Si possible, configurez et utilisez un workflow expérimental automatisé dans le logiciel de contrôle au microscope pour faciliter l’imagerie de plusieurs échantillons dans des conditions normalisées. Fait important, toutes les images doivent être acquises en utilisant les mêmes paramètres pour permettre une comparaison appropriée entre les échantillons.Une fois que les conditions d’imagerie ont été optimisées, concentrez-vous sur les cellules et imagez-les dans les canaux verts et bleus. Imagez plusieurs champs de vision par échantillon pour obtenir des données robustes et représentatives. Enregistrez les images Z-stack du canal bleu et vert sous forme de fichiers TIFF multicouches 16 bits.Assurez-vous d’inclure les mots vert ou bleu dans les noms de fichiers correspondants. Ouvrez des images microscopiques dans ImageJ et supprimez toutes les piles d’images contenant un nombre considérable de cellules qui se sont déplacées lors de l’acquisition. Ceux-ci apparaissent à différentes positions dans les sections Z individuelles.Ensuite, retirez toutes les piles d’images contenant des particules non cellulaires hautement fluorescentes dans le canal bleu. Ceci est souvent causé par la saleté sur la surface d’imagerie ou les impuretés dans le milieu de culture et peut interférer avec la détection des cellules dans leur voisinage. En outre, retirez toutes les piles d’images contenant une grande proportion de cellules mortes.Ces images afficheront des cellules avec une fluorescence bleue accrue par rapport aux cellules vivantes. Bien que la présence de quelques cellules mortes dans l’échantillon ne soit généralement pas un problème et que ces cellules soient automatiquement jetées au cours de l’analyse, certaines cellules mortes ou mourantes peuvent parfois être reconnues comme cellules vivantes par l’algorithme de segmentation et ainsi fausser les résultats rapportés. Pour commencer l’analyse dans MATLAB, créez d’abord un dossier principal et copiez tous les scripts MATLAB à cet endroit.Ensuite, créez des sous-rôles avec les noms des différentes espèces de levure, et copiez les images respectives du TIFF à ces endroits. Maintenant, commencez MATLAB, ouvrez le script PRINCIPAL. m, et exécuter le script.Dans le menu, sélectionnez les espèces de levure à analyser et commencez le traitement d’image. Inspectez et traiter les fichiers de sortie au besoin à l’aide d’un éditeur de feuille de calcul ou d’un paquet statistique. Le flux de travail produit des fichiers CSV séparés par des points-virgules et des fichiers TIFF segmentés avec des objets cellulaires détectés et des gouttelettes lipidiques.On y voit des cellules S.pombe de type sauvage qui ont été cultivées dans le milieu complexe YES ou dans le milieu défini de l’EMM. Par rapport aux cellules cultivées dans le milieu YES, moins de gouttelettes lipidiques et une intensité de coloration plus élevée par unité de volume cellulaire ont été détectées dans le milieu emm. En outre, les gouttelettes individuelles de lipide formées dans le milieu d’EMM étaient plus grandes et ont montré une intensité totale accrue de coloration.Ceci est en accord avec les résultats précédents de l’augmentation de la teneur en lipides stockés dans les cellules cultivées en EMM. Ensuite, ces images montrent des cellules S.japonicus provenant de cultures exponentielles et stationnaires précoces cultivées dans le milieu YES. Les cellules entrant dans la phase stationnaire ont montré un nombre nettement diminué de gouttelettes de lipide par unité de volume cellulaire tandis que l’intensité de fluorescence de gouttelette de lipide volume-normalisée a diminué légèrement entre les deux conditions.Les gouttelettes de lipides de phase stationnaire précoce étaient généralement de taille modérément plus grande et avaient une intensité totale de fluorescence modérément plus élevée que les gouttelettes provenant de cellules à croissance exponentielle. Dans les cellules S.cerevisiae cultivées en phase exponentielle par rapport à la phase stationnaire, les cellules stationnaires contenaient un peu moins de gouttelettes lipidiques par unité de volume par rapport aux cellules en croissance exponentielle. Cependant, leur intensité de fluorescence de gouttelettes normalisée en volume a presque doublé.Cette forte augmentation de la teneur globale en gouttelettes lipidiques est due à l’intensité et au volume beaucoup plus élevés de fluorescence et de volume de gouttelettes de lipides individuelles en phase stationnaire. Après cette procédure, les données de sortie peuvent être agrégées dans un ensemble statistique tel que R pour créer des parcelles de résultats résumés et exécuter des tests statistiques sur toutes les différences observées dans la teneur en gouttelettes lipidiques. En principe, le pipeline de traitement d’image peut être utilisé pour l’analyse de la teneur en gouttelettes lipidiques dans d’autres micro-organismes ou pour analyser d’autres structures subcellulaires similaires à des points.

analysis-lipid-droplet-content-fission-budding-yeasts-using-automated

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons une nouvelle méthode quantitative lipidomique pour identifier les espèces de lipides dans la levure à l'aide de nombreuses enquêtes-scan spectrométrie de masse electrospray ionisation (ESI / MS). Cette méthode dépasse actuellement les méthodes disponibles pour l'identification et la quantification des lipides dans la capacité à résoudre les diverses formes moléculaires de lipides, la sensibilité et la vitesse.

Une évaluation quantitative du lipidome levure en utilisant la spectrométrie de masse électrospray ionisation

Deux techniques pour isoler des gouttelettes lipidiques cellulaires à partir de 1) cellules de levure et 2) placentas humains sont présentés. L'élément central de ces deux procédés est centrifugation en gradient de densité, où la couche flottante résultant contenant les gouttelettes peuvent être facilement visualisés à l'oeil nu, on extrait et quantifié par analyse par transfert de Western pour la pureté.

Isolation des gouttelettes lipidiques cellulaires: deux techniques de purification partir de cellules de levure et placentas humains

Nous décrivons ici un protocole pour obtenir l’index de gouttelettes de lipides (index LD) pour étudier la dynamique des triacylglycérols dans les cellules cultivées dans des expériences de haut débit. L’essai d’index LD est une méthode simple et fiable qui utilise BODIPY 493/503. Ce test n’a pas besoin dispendious extraction de lipides ou d’analyse de la microscopie.

Lipides Index détermination par Fluorescence liquide de récupération dans le champignon pathogène Ustilago Maydis

Ce protocole décrit l'analyse des compartiments intracellulaires étiquetés fluorescents dans la levure en herbe utilisant la microscopie confocale 4D multicolore (time-lapse 3D). Les paramètres d'imagerie sont choisis pour capturer des signaux adéquats tout en limitant les dégâts photo. Les plugins Custom ImageJ permettent de suivre et d'analyser quantitativement les structures étiquetées.

Microscopie 4D de levure

Ici, nous présentons l'imagerie à cellules vivantes qui est une méthode de microscopie non toxique qui permet aux chercheurs d'étudier le comportement des protéines et la dynamique nucléaire dans les cellules vivantes de levure de fission pendant la mitose et la méiose.

Examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence Microscopie à cellules vivantes

Nous présentons un protocole utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem pour identifier et quantifier les lipides cellulaires principaux dans saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite pour une évaluation quantitative des classes lipidiques majeures dans une cellule de levure est polyvalente, robuste et sensible.

Analyse quantitative du lipidome cellulaire de Saccharomyces Cerevisiae à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem

Ici, nous démontrons un protocole optimisé basé sur la fluorescence BODIPY 493/503 pour la caractérisation des gouttelettes lipidiques dans le tissu hépatique. Grâce à l’utilisation de projections orthogonales et de reconstructions 3D, le fluorophore permet une discrimination réussie entre la stéatose microvésiculeuse et macrovésiculeuse et peut représenter une approche complémentaire aux protocoles histologiques classiques pour l’évaluation de la stéatose hépatique.

Analyse de gouttelettes lipidiques colorées par fluorescence avec reconstruction 3D pour l’évaluation de la stéatose hépatique

La présente étude décrit des méthodologies basées sur la décellularisation pour visualiser et quantifier le dépôt de tissu adipeux intramusculaire (IMAT) à travers le volume musculaire intact, ainsi que la quantification des mesures des adipocytes individuels qui composent l’IMAT.

Quantification basée sur la décellularisation de l’infiltration graisseuse des muscles squelettiques

La levure de fission est utilisée ici comme hôte hétérologue pour exprimer des protéines cytosquelettiques bactériennes telles que FtsZ et MreB en tant que protéines de fusion translationnelle avec GFP pour visualiser leur polymérisation. De plus, les composés qui affectent la polymérisation sont identifiés par imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence.

La levure de fission comme plate-forme pour le criblage de médicaments antibactériens ciblant les protéines du cytosquelette bactérien

La lipophagie est une forme sélective d’autophagie qui implique la dégradation des gouttelettes lipidiques. Les dysfonctionnements dans ce processus sont associés au développement du cancer. Cependant, les mécanismes précis ne sont pas encore entièrement compris. Ce protocole décrit des approches d’imagerie quantitative pour mieux comprendre l’interaction entre l’autophagie, le métabolisme des lipides et la progression du cancer.

Explorer la régulation du catabolisme des gouttelettes lipidiques par la lipophagie

Ce protocole détaille deux méthodes d’arrêt du cycle cellulaire de levure et de libération facultative, et développe l’utilisation de la microscopie à fluorescence pour étudier les processus dépendants du cycle cellulaire chez S. cerevisiae.

Manipulation et analyse des processus dépendants du cycle cellulaire chez les levures bourgeonnantes

Découvrez une méthode automatisée d'analyse quantitative des gouttelettes lipidiques dans Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicus et Saccharomyces cerevisiae par microscopie à fluorescence. Ce protocole standardisé permet des études comparatives à haut débit du métabolisme lipidique.

Analyse du contenu des gouttelettes lipidiques dans les levures de fission et les levures en herbe à laide du traitement automatisé de limage (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse du contenu des gouttelettes lipidiques dans les levures de fission et les levures en herbe à l'aide du traitement automatisé de l'image

Explorer plus de vidéos