Un virus de la grippe Luciferase-fluorescent Reporter pour l'imagerie en direct et la quantification de l'infection virale

Les chercheurs ont déjà généré des virus grippaux recombinants qui expriment des reporters de protéines fluorescentes ou bioluminescentes. Une partie de notre expression unique des gènes des reporters dans le virus de la grippe limite considérablement son utilisation dans les expériences. Notre protocole décrit l’utilisation du virus de la grippe bireporter qui exprime à la fois les gènes fluorés et bioluminescents des journalistes, et surmonte donc sa limitation.

Le principal avantage de cette technique est l’utilisation d’un seul virus grippal recombinant pour des études in vitro et in vivo. Lors de l’exécution de cette technique, l’injection rapide du substrat de luciferase et la bonne planification de la manipulation des souris est importante, parce que le substrat est rapidement métabolisé. En outre, le rasage des souris est recommandé pour améliorer la détection du signal bioluminescent.

Pour infecter les souris, commencez par préparer le BIRFLU en 1X PBS. Maintenir le virus sur la glace jusqu’à l’inoculation. Vérifiez l’absence du réflexe de pincement des orteils pour vous assurer que la souris est anesthésiée et inoculez-la intranasally avec la dilution BIRFLU préparée.

Assurez-vous que toutes les souris respirent correctement avant de les retourner dans leurs cages. Ouvrez le logiciel d’imagerie et appuyez sur Initialiser, puis définissez les paramètres qui seront utilisés pour l’imagerie. Pour surveiller les souris infectées par BIRFLU, rasez-leur la poitrine pour améliorer la détection du signal bioluminescent.

Une fois que les souris sont anesthésiées, utilisez une aiguille de calibre 22 pour administrer rétro-orbitalement 100 microlitres du substrat de luciferase de Nluc, dilué un à 10 dans PBS. Immédiatement après l’injection, placez les animaux dans la chambre d’isolement avec leur poitrine face vers le haut. Ensuite, placez la chambre d’isolement dans l’instrument d’imagerie, fermez la porte et acquérez des images.

Après l’imagerie, retournez les souris dans leurs cages et surveillez-les jusqu’à ce qu’elles se soient complètement rétablies. Utilisez l’outil de retour sur investissement logiciel d’imagerie pour analyser les données de bioluminescence acquises en dénudant une région d’intérêt et en cliquant sur la mesure. Pour effectuer l’imagerie ex vivo des poumons de souris, recueillez les poumons selon les instructions manuscrites, démarrez le logiciel d’acquisition d’images et définissez les paramètres de l’imagerie.

Une fois que la machine est paramé paraisée, placez les poumons dans un plateau noir et assurez-vous que les tissus sont séparés les uns des autres. Introduisez le plateau dans l’imageur, fermez la porte et acquérez des images. Après l’imagerie, retirez immédiatement les tissus et rangez-les sur de la glace à quatre degrés Celsius si les échantillons seront traités le même jour.

S’ils seront traités plus tard, congelez-les rapidement dans un tube sur de la glace sèche et conservez-les à 80 degrés Celsius. Pour traiter les images, sélectionnez l’outil roi, dessinez les régions d’intérêt autour de chacun des poumons individuels et cliquez sur mesurer. BIRFLU a été caractérisé in vitro en déterminant les niveaux d’expression de Vénus, Nluc et NP dans les cellules infectées.

L’expression Vénus et Nluc n’est détectée que dans les cellules infectées par BIRFLU, tandis que la PN est exprimée dans les cellules infectées par le PR8 et le BIRFLU de type sauvage. Aucune expression n’est observée dans les cellules simulées infectées. En outre, l’activité de Nluc a été mesurée dans les supernatants de culture tissulaire à 24, 48, 72, et 96 heures après l’infection.

Il est détecté dès 24 heures après l’infection, et les niveaux d’expression augmentent à 96 heures. Il peut également être démontré que la cinétique de réplication de BIRFLU sont comparables au virus PR8 de type sauvage. BIRFLU a la capacité d’exprimer à la fois les gènes fluorescents et bioluminescents reporter, et la corrélation entre les deux peut être évaluée à l’aide de l’imagerie in vivo et ex vivo d’un poumon de souris.

Les poumons des souris infectées par BIRFLU présentaient une bioluminescence élevée in vivo et une fluorescence ex vivo. Des titres viraux et la stabilité génétique de BIRFLU in vivo ont également été déterminés. Les analyses de plaque sur les virus des poumons de souris ont montré que le virus peut former des plaques et exprimer les deux gènes de reporter.

Birflu pourrait également être utilisé pour évaluer l’efficacité des anticorps antiviraux et neutralisants contre la grippe. La sortie de ces analyses ont toutes été corrélées les unes avec les autres et sont rapides et faciles à faire.