Name: Un virus de la grippe Luciferase-fluorescent Reporter pour limagerie en direct et la quantification de linfection virale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Découvrez le système BIRFLU pour le suivi du virus Influenza A in vivo et in vitro. Cette méthode bi-reporter combinant luciférase et fluorescence permet d'évaluer l'efficacité des traitements antiviraux et les réponses immunitaires chez la souris.

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La recherche sur le virus de l'influenza dans le laboratoire LM-S est partiellement financée par le New York Influenza Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C), membre du contrat NO des Centres d'excellence pour la recherche et la surveillance de la grippe (CEIRS) du NIAID. HHSN272201400005C (NYICE) et par le Department of Defense (DoD) Peer Reviewed Medical Research Program (PRMRP) subvention W81XWH-18-1-0460.

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les chercheurs se sont appuyés sur les virus recombinants exprimant des journalistes comme outils moléculaires vitaux pour comprendre et développer la compréhension actuelle de la réplication virale et de la pathogénie26,27,28, 29 Ans et plus , 30 Ans, états-unis ( , 31 Ans, états-unis ( , 32 Ans, états-unis ( , 33 Ans, états-unis ( , 34 Ans, états-unis ( , 35 Annonces , 36 Annonces , 37 Ans, états-unis ( , 38 Annonces , 39 Ans et plus qu'ils , 40 ans, états-unis ( , 41 Ans, états-unis ( , 54. Les gènes de reporter les plus couramment favorisés sont les luciferases et les protéines fluorescentes, principalement en raison des progrès technologiques dans leur identification, le développement de variantes améliorées, et la détection par les technologies d'imagerie43 , 44 Ans, en est à qui , 45 Annonces , 46 Annonces , 47 Annonces , 48. Les virus reporterres sont souvent utilisés pour accélérer les essais virologiques, étudier la dynamique des virus in vitro et in vivo, et tester l'efficacité des approches vaccinales et thérapeutiques actuellement approuvées ou nouvelles26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Malheureusement, dans le cas de l'IAV, les études antérieures se limitaient à l'expression d'un gène reporter unique, ce qui entrave le type d'étude qui pourrait être menée 26,27,28,29 , 30 Ans, états-unis ( , 31 Ans, états-unis ( , 32 Ans, états-unis ( , 33 Ans, états-unis ( , 34 Ans, états-unis ( , 35 Annonces , 36 Annonces , 37 Ans, états-unis ( , 38 Annonces , 39 Ans et plus qu'ils , 40 ans, états-unis ( , 41 Ans, états-unis ( , 54. Pour éviter cette limitation, nous avons généré un IAV bi-reporter réplication-compétent qui exprime une luciferase de Nluc et une protéine fluorescente de Vénus (BIRFLU).
Dans ce rapport, nous décrivons la caractérisation in vitro de BIRFLU et les approches expérimentales pour employer BIRFLU pour suivre l'infection virale in vivo utilisant un modèle de souris de l'infection d'IAV. BirFLU Nluc et l'expression de Vénus se sont corrélées avec des titers viraux. En outre, BIRFLU est resté stable et a continué à exprimer les deux gènes de journaliste après avoir été récupéré des poumons des souris infectées. Cette approche offre aux chercheurs une excellente occasion d'étudier les iAV dans les cellules cultivées et dans les modèles animaux, y compris l'identification et le développement de nouvelles alternatives thérapeutiques pour le traitement des infections par le VIH.
Bien que BIRFLU ait été généré à l'aide de l'épine dorsale de PR8, d'autres IAV recombinants utilisant différents types, sous-types ou épines dorsales de souche virale pourraient être générés en utilisant la même approche expérimentale. De même, dans ce rapport, nous avons décrit les procédures expérimentales pour l'utilisation de BIRFLU dans un modèle de souris de la IAV. Cependant, BIRFLU pourrait être une technologie précieuse pour évaluer l'infection par le VI chez d'autres modèles animaux.

Le virus de la grippe A (IAV) est un virus d'ARN segmenté à sens négatif à un seul brin de la famille des Orthomyxoviridae 1,2,3. L'Organisation mondiale de la Santé (OMS) estime 3 à 5 millions de cas de grippe annuels et plus de 250 000 décès dus à la grippe dans le monde4,5,6. Les groupes particulièrement vulnérables à la grippe sont les personnes âgées, les personnes immunodéprimées et les enfants7,8,9,10,11. Bien que les vaccins soient disponibles et représentent l'intervention la plus courante et la plus efficace contre l'infection virale, le IAV est capable d'évoluer rapidement et d'échapper à l'immunité préexistante3,12,13, 14 (en) , 15. La réapparition d'une souche pandémique H1N1 en 2009 et l'émergence d'un IAV pathogène réitèrent la menace constante pour la santé publique humaine dans le monde4,16.
Lors d'une épidémie ou d'une pandémie, il est crucial de déterminer rapidement la pathogénicité et la transmissibilité des virus nouvellement isolés. Les techniques actuellement disponibles pour détecter le virus prennent beaucoup de temps et nécessitent parfois l'utilisation d'approches laborieuses, ce qui peut retarder l'achèvement de ces analyses17,18,19,20. En outre, les tests viraux actuels sont difficiles à intensifier, ce qui pourrait être nécessaire en cas d'éclosion. Enfin, l'utilisation de modèles animaux validés d'infection, tels que les souris, les cobayes et les furets, est couramment utilisée et est essentielle à l'étude des infections grippales, des réponses immunitaires et de l'efficacité de nouveaux vaccins et/ou antiviraux. Cependant, ces modèles sont restrictifs en raison de l'incapacité d'observer la dynamique virale en temps réel; cela limite les études à l'imagerie statique des infections virales21,22,23,24,25. Les animaux utilisés dans ces essais sont également euthanasiés afin de déterminer la charge virale, augmentant ainsi le nombre d'animaux nécessaires pour compléter ces études26. Pour contourner toutes ces limitations, de nombreux chercheurs s'appuient sur l'utilisation de recombinants réplication-compétents, journaliste-exprimant IAVs, qui sont capables d'accélérer les essais virologiques et de détecter la charge virale et la diffusion in vivo en temps réel26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Fait important, ces AIV exprimant des journalistes sont capables de se répliquer de la même façon que les AIV de type sauvage (WT) dans la culture cellulaire et dans les modèles animaux d'infection33,42.
Les protéines fluorescentes et bioluminescentes sont deux systèmes de reporter couramment utilisés par les chercheurs en raison de leur sensibilité, de leur stabilité et de leur facilité d'utilisation. En outre, il ya un soutien énorme et l'avancement dans les technologies de détection de protéines fluorescentes et bioluminescentes43,44,45,46,47,48 . Les protéines fluorescentes et la luciferase ont différentes propriétés qui leur permettent de briller, en particulier différentes dans la façon dont les états excités sont générés et comment l'émetteur est détecté43,44,45, 46,47,48. Les protéines fluorescentes sont d'abord excitées par l'absorption de l'énergie, qui est ensuite libérée sous forme de lumière à une longueur d'onde différente à mesure que les molécules diminuent à un état d'énergie inférieur43. D'autre part, la bioluminescence est dérivée d'une réaction chimique exothermic qui implique un substrat, l'oxygène, et parfois l'ATP afin de produire la lumière45. En raison des propriétés variables de ces deux types de protéines reporter, l'un peut-être plus avantageux que l'autre en fonction de l'étude de l'intérêt. Alors que les protéines fluorescentes sont largement utilisées pour observer la localisation cellulaire28,41, leurs signaux in vivo ont une intensité insuffisante et sont souvent obscurcis par l'autofluorescence dans les tissus vivants49. Par conséquent, les chercheurs s'appuient sur les luciferases pour évaluer la dynamique virale chez les organismes vivants, bien que les protéines fluorescentes peuvent être préférées pour les études ex vivo50,51,52,53. Contrairement aux protéines fluorescentes, les luciferases sont plus pratiques pour les études in vivo et plus applicables dans les approches non invasives26,27,28,29,30 , 31 Ans, états-unis ( , 32 Ans, états-unis ( , 33 Ans, états-unis ( , 34 Ans, états-unis ( , 35 Annonces , 36 Annonces , 37 Ans, états-unis ( , 38 Annonces , 39 Ans et plus qu'ils , 40 ans, états-unis ( , 41 Ans, états-unis ( , 54. En fin de compte, en fonction du type d'étude, les chercheurs doivent choisir entre l'utilisation d'une protéine fluorescente ou d'une protéine de journaliste de luciferase comme lecture, qui soumet leur étude à un compromis de fonctionnalités et de sensibilités, et sévèrement limite l'utilité des virus des journalistes recombinants. En outre, on s'inquiète de la corrélation entre l'expression de différents gènes de reporter utilisant des systèmes de fluorescence ou de luciferase et de réplication ou de diffusion virale, ce qui pourrait compromettre l'interprétation des données obtenues avec les VSI exprimant des journalistes.
Nous avons surmonté cette limitation en générant une réplication recombinante-compétente bi-reporter IAV (BIRFLU) qui code à la fois pour une protéine fluorescente et une luciférase dans le même génome viral55 (Figure 1). Ici, NanoLuc luciferase (Nluc), une petite protéine bioluminescentebrillante 48, a été insérée en amont de la séquence d'hémagglutinine (HA) dans le segment viral HA de la grippe A/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. En outre, Vénus, une protéine fluorescente monomeric fréquemment utilisée, a été insérée dans le segment viral non structurel (NS)32,33,36,41,55. Puisque BIRFLU code pour les gènes de journaliste fluorescents et de luciferase, le signal de protéine de journaliste peut être employé comme readout pour déterminer la réplication et la diffusion viraleines in vitro ou in vivo55. Des informations supplémentaires concernant la génération et la caractérisation in vitro ou in vivo de BIRFLU peuvent être trouvées dans notre récente publication55. BIRFLU peut être utilisé pour tester l'efficacité des médicaments antiviraux ou neutraliser les anticorps par le biais d'un nouvel essai de microneutralisation fluorescente et bioluminescente55. En outre, BIRFLU peut également être utilisé pour évaluer la dynamique virale dans un modèle de souris de l'infection55. Dans ce manuscrit, nous décrivons les procédures pour caractériser BIRFLU55 in vitro et comment étudier l'infection DE BIRFLU chez les souris utilisant des systèmes in vivo d'imagerie de luminescence pour la détection de Nluc in vivo ou de Vénus ex vivo.
La combinaison de techniques de pointe en biologie moléculaire, en recherche animale et en technologie d'imagerie offre aux chercheurs l'occasion unique d'utiliser BIRFLU pour la recherche sur les IAV, y compris l'étude des interactions virus-hôtes, la dynamique de l'infection virale; l'élaboration de nouvelles approches vaccinales pour le traitement thérapeutique des infections à VIH ou l'utilisation potentielle du VI comme vecteur vaccinal pour le traitement d'autres infections pathogènes.

<table><tbody><tr><td>Plaque de culture cellulaire 12 puits</td><td>Greiner Bio-one</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire 24 puits</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire 6 puits</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire 96 puits</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS4</td><td>Adobe</td><td></td><td>Ce logiciel est utilisé dans 3.1.10 et 4.4.7</td></tr><tr><td>Solution d’albumine de Bovin (BA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7409</td><td>Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Bovin Serum Albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire 100mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie ChemiDoc MP</td><td>BioRad</td><td></td><td>Cet instrument est utilisé dans 4.4.7</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C581-100</td><td>Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinders</td><td>Thomas Scientific</td><td>7722-7</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>Se conserve à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Souris BALB/c femelles âgées de 5 à 7 semaines</td><td>National Cancer Institute (NCI)</td><td>555</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td>Cet instrument est utilisé pour l’imagerie in vivo (4.2 et 4.3)</td></tr><tr><td>IX81 Microscope inversé motorisé</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX81</td><td></td></tr><tr><td>Living Image 4.7.2 logiciel</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Cet instrument est utilisé pour l’imagerie in vivo (4.2 et 4.3)</td></tr><tr><td>Lumicount</td><td>Packard</td><td></td><td>Cet instrument est utilisé pour quantifier l’activité de la luciférase (3.2.6)</td></tr><tr><td>Cellules épithéliales Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-NP Virus de la grippe A HB-65</td><td>ATCC</td><td>H16-L10-4R5</td><td>Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Nano-Glo Luciférase Assay Reagent</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>Ce réactif est utilisé pour mesurer l’activité de Nluc. Conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Neutre Buffered Formalin 10 %</td><td>EMD</td><td>65346-85</td><td>Stocker chez RT</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell Microplaques à 96 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine (PS) 100x</td><td>Corning</td><td>30-00-CI</td><td>Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine/L-Glutamine (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Retiga 20000R Fast1394 Appareil photo</td><td>Qimaging</td><td>Retiga 2000R</td><td></td></tr><tr><td>Scanner</td><td>HP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red conjugué anti-souris -anticorps secondaires de lapin</td><td>Jackson</td><td>715-075-150</td><td>Stocker à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Trypsine traitée au tosylsulfonyl phénylalanyl chlorométhyl cétone (TPCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8802</td><td>Se conserve à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>Boutique chez RT</td></tr><tr><td>Vmax Lecteur de plaques cinétiques</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un virus de la grippe luciferase-fluorescent reporter pour l'imagerie en direct et la quantification de l'infection virale

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Les virus de la grippe A (IvIV) causent des maladies respiratoires humaines qui sont associées à des conséquences économiques et sanitaires importantes. Comme pour d'autres virus, l'étude de la LUTTE anti-I nécessite l'utilisation d'approches secondaires laborieuses pour détecter la présence du virus dans les cellules infectées et/ou dans les modèles animaux d'infection. Cette limitation a été récemment contournée avec la génération de IAV recombinants exprimant facilement traçablefluorescent ou bioluminescent (luciferase) protéines reporter. Cependant, les chercheurs ont été forcés de sélectionner des gènes de reporter fluorescents ou de luciferase en raison de la capacité restreinte du génome de l'IAV pour inclure des séquences étrangères. Pour surmonter cette limitation, nous avons généré une réplication recombinante-compétente bi-reporter IAV (BIRFLU) exprimant de façon stable à la fois un gène fluorescent et un journaliste luciferase pour suivre facilement les infections par le VI in vitro et in vivo. À cette fin, les segments viraux non structuraux (NS) et hémagglutinine (HA) de la grippe A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) ont été modifiés pour coder la Vénus fluorescente et les protéines bioluminescentes de luciférase Nanoluc, respectivement. Ici, nous décrivons l'utilisation de BIRFLU dans un modèle de souris de l'infection par le VI et la détection des deux gènes reporter à l'aide d'un système d'imagerie in vivo. Notamment, nous avons observé une bonne corrélation entre les expressions des journalistes et la réplication virale. La combinaison de techniques de pointe en biologie moléculaire, en recherche animale et en technologie d'imagerie offre aux chercheurs l'occasion unique d'utiliser cet outil pour la recherche sur la grippe, y compris l'étude des interactions virus-hôtes et la dynamique des infections virales. Fait important, la faisabilité de modifier génétiquement le génome viral pour exprimer deux gènes étrangers provenant de différents segments viraux ouvre la possibilité d'utiliser cette approche pour : (i) le développement de nouveaux vaccins anti-IAV, (ii) la génération de IAV recombinants qui peuvent être utilisés comme vecteurs vaccinaux pour le traitement d'autres infections pathogènes humaines.

Génération et caractérisation de BIRFLU in vitro (figure 1 et figure 2)
Un IAV recombinant réplication-compétent exprimant deux gènes différents de journaliste (BIRFLU) a été construit utilisant la biologie moléculaire de l'état de l'art et les techniques de génétique inverse plasmides-basées (figure1). Ici, nous avons choisi d'utiliser Nluc en raison de plusieurs avantages par rapport à d'autres luciferases, y compris sa petite taille, ATP-indépendance, une plus grande intensité, et le substrat optimisé48,60. Nluc a été cloné dans le segment HA de l'IAV PR8, suivi du site de clivage porcin teschovirus (PTV) 2A (2A) devant le cadre de lecture ouvert (ORF) de HA (Figure 1). L'ORF de HA comprenait des mutations silencieuses pour enlever les signaux d'emballage d'origine et éviter toute recombinaison possible. Le signal complet d'emballage HA a été ajouté devant Nluc pour permettre l'incorporation appropriée du segment HA modifié dans la virion et l'expression Nluc et HA du même segment d'ARN viral (Figure 1). En outre, la protéine fluorescente Vénus a été clonée dans un segment modifié IAV PR8 NS qui code les deux protéines virales NS1 et NEP à partir d'une transcription unique32,36,41,54, 57. À cette fin, Vénus a été fusionnée au terminal C de NS1 et l'ensemble du NEP ORF a été cloné en aval du site de clivage PTV 2A qui a été placé entre les séquences NS1-Venus et NEP (Figure 1). En fin de compte, ces deux constructions modifiées de plasmide viral HA et NS ont été utilisées en combinaison avec le reste des plasmides de génétique inverse iAV PR8 pour générer BIRFLU (Figure 1). La caractérisation in vitro et in vivo de BIRFLU a été décrite précédemment55.
Dans la figure 2, nous avons caractérisé le BIRFLU in vitro en déterminant les niveaux d'expression de Vénus, de Nluc et de NP en utilisant des approches de fluorescence et d'immunofluorescence indirecte (figure2A,B). Les monocouches de confluents des cellules MDCK ont été soit simulées ou infectées (MOI 0.1) avec des virus WT ou BIRFLU PR8 et, à 18 h après l'infection, l'expression de Vénus a été directement évaluée à l'aide de la microscopie à fluorescence (figure 2A,B). L'expression Nluc (Figure 2A) et NP (Figure 2B) ont été visualisées par immunofluorescence indirecte à l'aide d'anticorps spécifiques pour chaque protéine. Comme prévu, l'expression de Vénus et de Nluc n'a été détectée que dans les cellules infectées par BIRFLU et non dans les cellules infectées par le virus WT PR8. En outre, la microscopie indirecte d'immunofluorescence a indiqué l'expression de NP dans les cellules WT et BIRFLU PR8-infectées. Aucune expression de Vénus, De Nluc ou de NP n'a été détectée, comme prévu, dans des cellules simulées infectées (figureA,B).
Pour évaluer les niveaux d'expression de Nluc in vitro, les cellules MDCK ont été infectées (MOI 0.001) avec des virus WT ou BIRFLU PR8 et l'activité de Nluc dans les supernatants de culture tissulaire a été évaluée à 24, 48, 72 et 96 h après l'infection (figure 2C). Seule l'activité de Nluc a été détectée chez les supernatants de culture tissulaire des cellules MDCK infectées par BIRFLU (figure 2C). L'activité de Nluc dans les supernatants de culture de tissu a été détectée dès 24 h après l'infection avec des niveaux d'expression plus élevés à 96 h après l'infection, probablement parce que l'effet cytopathique (CPE) induit pendant la libération virale d'infection la protéine de Nluc a conservé dans la cellule. Pour évaluer l'aptitude du BIRFLU dans les cellules cultivées, la cinétique de croissance des virus WT et BIRFLU PR8 a également été évaluée (Figure 2D) et la présence de virus infectieux dans les supernatants de culture tissulaire a été déterminée par l'analyse du foyer immunitaire (figure2D ). Notamment, la cinétique de réplication de BIRFLU était comparable à ceux du virus de PR8 de WT, bien que la réplication de BIRFLU ait été légèrement retardée et n'ait pas atteint les mêmes titers viraux que WT PR8. Cependant, BIRFLU a été en mesure d'atteindre des titreleurs de 5 x 107 PFU/mL (Figure 2D), ce qui indique que l'expression de deux gènes reporteurs dans le génome viral n'interfère pas de façon significative avec la réplication du BIRFLU dans les cellules MDCK.
Suivi de l'infection À BIRFLU chez la souris(figure3 et figure 4)
La figure 3 est un diagramme de flux schématique pour l'évaluation de la dynamique BIRFLU dans un modèle de souris de l'infection par le VI. Des souris femelles de CINQ à sept semaines de BALB/C ont été simulées-infectées avec 1x PBS ou infectées avec 1 x 106 PFU de BIRFLU intranasally. À 3 jours après l'infection, des souris ont été anesthésiées avec l'isoflurane et puis injectées avec le substrat de Nluc rétro-orbitalement. Toutes les souris ont été immédiatement placées dans l'instrument IVIS et le signal de Nluc a été évalué in vivo à l'aide de l'IVIS. Ensuite, les souris ont été euthanasiées et les poumons ont été récoltés. Les poumons excisés ont ensuite été analysés ex vivo à l'aide de l'imageur in vivo pour déterminer l'intensité de fluorescence par l'expression de Vénus. Enfin, les poumons de souris ont été homogénéisés, et les titres et la stabilité virales ont été déterminées par l'analyse de plaque. Les plaques ont été évaluées par la fluorescence directe de Vénus, par immunostaining utilisant des anticorps spécifiques pour Nluc et par la coloration de violette cristalline.
Les IAV exprimant des iAVs qui expriment des informations de réplication précédemment, qui expriment des iAV, expriment un seul gène de journaliste, le plus souvent une protéine fluorescente ou bioluminescente, comme substitut de l'infection virale et de la réplication. Cependant, BIRFLU, est capable d'exprimer les deux types de gènes reporter sur l'infection virale. Pour évaluer la corrélation entre la bioluminescence (imagerie in vivo) et la fluorescence (imagerie ex vivo) après l'infection BIRFLU, des souris balb/c femelles de cinq à sept semaines ont été simulées infectées par 1 x PBS ou inoculées par BIRFLU (106 PFU) intranasalement . L'activité de Nluc (figure 4A) a été évaluée par l'administration du substrat de Nluc injecté rétro-orbitalement à 3 jours après l'infection utilisant un instrument d'imagerie in vivo. Nous avons choisi d'évaluer la bioluminescence au jour 3 parce que les études précédentes indiquaient que la réplication du IAv, y compris le PR8, culmine entre les jours 2 et 4 après l'infection24,54. La bioluminescence a été surveillée (figure4A, en haut) et utilisée pour calculer le flux total moyen (Flux (log10 p/s) (Figure 4A, en bas). Comme prévu, les souris inoculées avec BIRFLU ont montré une activité de bioluminescence élevée, mais aucun signal n'a été détecté chez les souris infectées par un simulacre. Par la suite, les poumons des souris infectées ont été récoltés et l'expression de Vénus a été évaluée à l'aide de l'imagerie ex vivo (figure4B, en haut). De plus, l'efficacité radiante moyenne de fluorescence a été calculée (Figure 4B, en bas). Les poumons de souris excisées ont également été homogénéisés pour déterminer les titreleurs viraux et la stabilité génétique de BIRFLU in vivo (Figure 4C, D). La stabilité génétique de BIRFLU a été analysée par l'analyse de plaque utilisant les virus isolés des poumons de souris et la microscopie fluorescente (Vénus, dessus), l'immunostaining (Nluc, milieu) et la coloration de violette cristalline (en bas). BIRFLU récupéré à partir de souris poumons ont été en mesure de former des plaques et exprime de façon stable les deux gènes journaliste (Figure 4C). Notamment, nous avons observé une bonne corrélation entre les signaux de bioluminescence et de fluorescence avec la réplication virale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig1.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique de la structure de virion IAV PR8 et BIRFLU et des segments génomiques. Les IAV sont entourés d'une couche lipidique contenant les deux principales glycoprotéines virales hémagglutinine (HA; noir) et neuraminidase (NA; bleu). Le IAV contient huit segments d'ARN à simple brin, à sens négatif (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M et NS). Chaque segment viral contient des régions non codantes (NCR) aux extrémités 3' et 5' (boîtes noires). En outre, à la fin 3' et 5' des viraux (v)RNAs sont les signaux d'emballage, responsables de l'encapsidation efficace des vRNAs en virions naissantes (boîtes blanches). Les segments et produits viraux IAV PR8 HA et NS sont indiqués en noir. Les séquences de Nluc, Devénus et PTV 2A sont indiquées dans des boîtes rouges, vertes et rayées, respectivement. La représentation schématique des segments HA et NS modifiés exprimant Nluc et Vénus, respectivement, dans BIRFLU sont également indiquées. Ce chiffre a été adapté de Nogales et coll.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig2.jpg"> Figure 2 : Caractérisation in vitro de BIRFLU. (A, B) Analyse de l'expression des protéines par fluorescence directe et immunofluorescence. Les cellules MDCK ont été simulées ou infectées (MOI 0.1) par des virus PR8 WT ou BIRFLU. Les cellules infectées ont été fixées à 18 h après l'infection pour visualiser directement l'expression de Vénus par microscopie fluorescente directe et pour visualiser l'expression Nluc (A) et virale NP (B) utilisant des anticorps spécifiques et l'immunofluorescence indirecte. Les noyaux ont été tachés avec DAPI. Des images représentatives (20x grossissement) sont affichées. Barres d'échelle de 100 m. (C, D) Cinétique de croissance de PR8 WT et BIRFLU. L'activité de Nluc (C) et les titres viraux (D) dans les supernatants de culture de tissu des cellules de MDCK infectées (MOI 0.001) avec wT et BIRFLU PR8 des virus ont été évalués aux heures indiquées après l'infection. Les données représentent les moyens de SD des tripliques. Les titrages viraux ont été déterminés par l'analyse immunisée-focus (FFU/mL). La ligne pointillée indique la limite de détection (200 FFU/ml). Ce chiffre a été adapté de Nogales et coll.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig3.jpg"> Figure 3 : Représentation schématique pour l'étude du BIRFLU chez la souris. L'expression des gènes de journaliste de Nluc et de Vénus a été évaluée chez des souris infectées par 1 x 106 PFU de BIRFLU à l'aide d'imagerie in vivo ou ex vivo. En bref, le jour 1, 5 à 7 souris femelles de BALB/c de semaine ont été simulées-infectées (1x PBS) ou inoculées avec 1 x 106 PFU de BIRFLU intranasally. Au jour 3 après l'infection, des souris ont été légèrement anesthésiées utilisant l'isoflurane et le substrat de Nluc a été injecté rétro-orbitalement. Le signal de Nluc a été directement évalué utilisant l'imagerie in vivo. Immédiatement après la formation image, des souris ont été euthanasiées et l'expression de Vénus dans les poumons excisés entiers a été analysée utilisant la formation image ex vivo. Les poumons récupérés de souris ont été homogénéisés pour évaluer la réplication et la stabilité virales par l'analyse de plaque. Les flèches indiquent une corrélation entre la fluorescence (Vénus), l'immunostaining (Nluc) et la coloration de la violette cristalline. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59890/59890fig4.jpg"> Figure 4 : Expression de bioluminescence et de fluorescence in vivo. Les souris femelles de CINQ à sept semaines de BALB/c ont été simulées-infectées (1x PBS) ou inoculées avec 1 x 106 PFU de BIRFLU intranasally. Au jour 3 post-infection, l'activité de Nluc (A) dans la souris entière a été déterminée. Images représentatives d'une souris unique montrant l'échelle d'éclat (p/sec/cm2/sr). Les valeurs d'éclat de bioluminescence ont été quanties et le flux total moyen est indiqué (Flux (Log10 p/s). Après l'imagerie De Nluc, les poumons ont été récoltés pour l'imagerie ex vivo (B). Des images représentatives de poumons entiers sont montrées. Pour quantifier l'expression de Vénus, les valeurs moyennes des régions d'intérêt (ROIs) ont été normalisées à l'autofluorescence pulmonaire des souris simulées-infectées et des changements de pli ont été calculés. Pour analyser la stabilité génétique de BIRFLU in vivo, les virus récupérés dans les poumons des souris ont été analysés par test de plaque à l'aide d'une microscopie fluorescente (Vénus, en haut), d'immunostaining (Nluc, milieu) et de coloration violette cristalline (en bas) (C). Des images représentatives d'une souris sont affichées. Pour évaluer la réplication du virus, des poumons entiers ont été homogénéisés après l'imagerie et utilisés pour infecter les cellules MDCK et déterminer les titreleurs viraux par test de plaque (PFU/mL) (D). Les flèches indiquent une corrélation entre la fluorescence (Vénus), l'immunostaining (Nluc) et la coloration de la violette cristalline. Les barres représentent la moyenne des titres de virus pulmonaires. Ce chiffre a été adapté de Logales et coll.55. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59890/59890fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Médias et solutions de culture tissulaire</td>
			<td>rédaction</td>
			<td>espace de stockage</td>
			<td>utiliser</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Médias de culture tissulaire : Dulbecco modifié Eagle's medium (DMEM), 10 % Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin-L-glutamine (PSG) (DMEM 10 % FBS 1% PSG).</td>
			<td>445 ml d'AMEM, 50 ml de FBS et 5 ml de 100x PSG.</td>
			<td>4 oC</td>
			<td>Entretien des cellules MDCK</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Médias post-infection: DMEM 0,3% Bovine Albumin (BA), 1% PSG (DMEM 0.3 % BA 1% PSG).</td>
			<td>491 ml DMEM, 4,2 ml de 35 % BA et 5 ml de 100x PSG</td>
			<td>4 oC</td>
			<td>Maintien des cellules MDCK après une infection virale</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Phosphate tamponné saline (PBS)</td>
			<td>80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na2HPO4.7H2O, 2 g de KH2PO4. Ajouter ddH2O jusqu'à 1 L. Ajuster le pH à 7,3</td>
			<td>température</td>
			<td>Pour préparer 1x PBS</td>
		</tr>
<tr>
<td>1x PBS</td>
			<td>Diluer 10x PBS avec ddH2O</td>
			<td>température</td>
			<td>Laver les cellules</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Médias d'infection : 1x PBS, 0.3% BA, 1% Penicillin-Streptomycin (PS) (PBS/BA/PS).</td>
			<td>487 mL 1x PBS stérile, 4,2 mL de 35% BA et 5 ml de 100x 1% PS(100 U/mL)</td>
			<td>4 oC</td>
			<td>Infections virales</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Solution de fixation/perméabilisation : 4 % de formaldéhyde, 0,5 % de triton X-100 dilué en 1x PBS.</td>
			<td>400 mL de formaline tamponneutre neutre 10 %, 5 ml de Triton X-100 et 595 ml de 1x PBS</td>
			<td>température</td>
			<td>Correction et perméabilisation des cellules MDCK.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Solution de blocage : 2,5% d'albumine bovine (BSA) en 1x PBS.</td>
			<td>2,5 g de BSA en 97,5 ml de 1x PBS</td>
			<td>4 oC</td>
			<td>Solution de blocage pour l'immunofluorescence et les essais de plaque.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution de dilution d'anticorps (1% BSA en 1x PBS)</td>
			<td>1 g de BSA en 99 ml de 1x PBS</td>
			<td>4 oC</td>
			<td>Dilution des anticorps primaires et secondaires.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution de violette cristalline de 0,1 %</td>
			<td>1 g de violette cristalline dans 400 ml de méthanol. Ajouter 600 ml de ddH2O</td>
			<td>température</td>
			<td>Coloration des cellules MDCK dans les essais de plaque.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl cétone (TPCK)-traité trypsin</td>
			<td>Préparer une solution de stock 1000x à 1 mg/mL en ddH2O</td>
			<td>-20 oC</td>
			<td>Pour les infections virales.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Médias et solutions de culture tissulaire.

Les virus de la grippe A (IvIV) sont des agents pathogènes respiratoires contagieux qui causent des épidémies annuelles et des pandémies occasionnelles. Ici, nous décrivons un protocole pour suivre des infections virales in vivo utilisant une luciferase recombinante nouvelle et fluorescence-exprimant bi-reporter IAV (BIRFLU). Cette approche fournit aux chercheurs un excellent outil pour étudier l'IAV in vivo.

Un virus de la grippe Luciferase-fluorescent Reporter pour l'imagerie en direct et la quantification de l'infection virale

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Les chercheurs ont déjà généré des virus grippaux recombinants qui expriment des reporters de protéines fluorescentes ou bioluminescentes. Une partie de notre expression unique des gènes des reporters dans le virus de la grippe limite considérablement son utilisation dans les expériences. Notre protocole décrit l’utilisation du virus de la grippe bireporter qui exprime à la fois les gènes fluorés et bioluminescents des journalistes, et surmonte donc sa limitation.Le principal avantage de cette technique est l’utilisation d’un seul virus grippal recombinant pour des études in vitro et in vivo. Lors de l’exécution de cette technique, l’injection rapide du substrat de luciferase et la bonne planification de la manipulation des souris est importante, parce que le substrat est rapidement métabolisé. En outre, le rasage des souris est recommandé pour améliorer la détection du signal bioluminescent.Pour infecter les souris, commencez par préparer le BIRFLU en 1X PBS. Maintenir le virus sur la glace jusqu’à l’inoculation. Vérifiez l’absence du réflexe de pincement des orteils pour vous assurer que la souris est anesthésiée et inoculez-la intranasally avec la dilution BIRFLU préparée.Assurez-vous que toutes les souris respirent correctement avant de les retourner dans leurs cages. Ouvrez le logiciel d’imagerie et appuyez sur Initialiser, puis définissez les paramètres qui seront utilisés pour l’imagerie. Pour surveiller les souris infectées par BIRFLU, rasez-leur la poitrine pour améliorer la détection du signal bioluminescent.Une fois que les souris sont anesthésiées, utilisez une aiguille de calibre 22 pour administrer rétro-orbitalement 100 microlitres du substrat de luciferase de Nluc, dilué un à 10 dans PBS. Immédiatement après l’injection, placez les animaux dans la chambre d’isolement avec leur poitrine face vers le haut. Ensuite, placez la chambre d’isolement dans l’instrument d’imagerie, fermez la porte et acquérez des images.Après l’imagerie, retournez les souris dans leurs cages et surveillez-les jusqu’à ce qu’elles se soient complètement rétablies. Utilisez l’outil de retour sur investissement logiciel d’imagerie pour analyser les données de bioluminescence acquises en dénudant une région d’intérêt et en cliquant sur la mesure. Pour effectuer l’imagerie ex vivo des poumons de souris, recueillez les poumons selon les instructions manuscrites, démarrez le logiciel d’acquisition d’images et définissez les paramètres de l’imagerie.Une fois que la machine est paramé paraisée, placez les poumons dans un plateau noir et assurez-vous que les tissus sont séparés les uns des autres. Introduisez le plateau dans l’imageur, fermez la porte et acquérez des images. Après l’imagerie, retirez immédiatement les tissus et rangez-les sur de la glace à quatre degrés Celsius si les échantillons seront traités le même jour.S’ils seront traités plus tard, congelez-les rapidement dans un tube sur de la glace sèche et conservez-les à 80 degrés Celsius. Pour traiter les images, sélectionnez l’outil roi, dessinez les régions d’intérêt autour de chacun des poumons individuels et cliquez sur mesurer. BIRFLU a été caractérisé in vitro en déterminant les niveaux d’expression de Vénus, Nluc et NP dans les cellules infectées.L’expression Vénus et Nluc n’est détectée que dans les cellules infectées par BIRFLU, tandis que la PN est exprimée dans les cellules infectées par le PR8 et le BIRFLU de type sauvage. Aucune expression n’est observée dans les cellules simulées infectées. En outre, l’activité de Nluc a été mesurée dans les supernatants de culture tissulaire à 24, 48, 72, et 96 heures après l’infection.Il est détecté dès 24 heures après l’infection, et les niveaux d’expression augmentent à 96 heures. Il peut également être démontré que la cinétique de réplication de BIRFLU sont comparables au virus PR8 de type sauvage. BIRFLU a la capacité d’exprimer à la fois les gènes fluorescents et bioluminescents reporter, et la corrélation entre les deux peut être évaluée à l’aide de l’imagerie in vivo et ex vivo d’un poumon de souris.Les poumons des souris infectées par BIRFLU présentaient une bioluminescence élevée in vivo et une fluorescence ex vivo. Des titres viraux et la stabilité génétique de BIRFLU in vivo ont également été déterminés. Les analyses de plaque sur les virus des poumons de souris ont montré que le virus peut former des plaques et exprimer les deux gènes de reporter.Birflu pourrait également être utilisé pour évaluer l’efficacité des anticorps antiviraux et neutralisants contre la grippe. La sortie de ces analyses ont toutes été corrélées les unes avec les autres et sont rapides et faciles à faire.

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Méthodes pour l'imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez les animaux vivants sont décrits. Les agents pathogènes sont modifiées pour exprimer la luciférase permettant d'imagerie optique du corps entier des infections chez les animaux vivants. Les modèles animaux peuvent être infectés par des pathogènes exprimer la luciférase et le cours résultant de la maladie de visualiser en temps réel par imagerie par bioluminescence.

En utilisant la luciférase aux infections bactériennes chez les souris image

Cette méthode décrit l'utilisation de système d'imagerie infrarouge à base de colorants pour la détection du virus H1N1 dans broncho-alvéolaire (LBA) des souris infectées avec une sensibilité élevée. Cette méthodologie peut être effectuée dans un 96 - ou 384 puits de plaque, il faut &lt;volume de 10 ul de matériel d'essai et a le potentiel pour le dépistage simultané de plusieurs agents pathogènes.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

En utilisant la luciférase et in vivo des systèmes d'imagerie (IVIS) comme un nouveau moyen d'identifier les maladies extrêmes avant de développements cliniques se produire. IVIS nous a permis de visualiser en temps réel l'invasion des virus encéphalitique sur plusieurs jours, en fournissant un modèle de maladie plus précise pour des études futures. Il nous a également permis d'identifier les caractéristiques protecteurs potentiels des antiviraux et des vaccins plus rapidement que les modèles...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Détection d&#39;un neuro-invasive virus encéphalitique

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

La vidéo montre le dosage de la luciférase utilisé pour quantifier les protéines marquées à la luciférase. Le test utilise une enzyme luciférase modifiée composée d’un gros fragment qui se lie au petit fragment, qui est conjugué à une protéine d’intérêt. Les sous-unités liées forment une enzyme active qui, en présence du substrat, libère un signal luminescent. Ce signal est ensuite quantifié à l’aide d’un luminomètre.

Le test de la luciférase : un test à haut débit pour mesurer les signaux luminescents à l’aide de biorapporteurs basés sur le système de nanoluciférase

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Un virus de la grippe rapporteur fluorescent à la luciférase pour suivre les infections virales

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Un test rapporteur de luciférase pour étudier la régulation de la traduction dans des cellules infectées par des poxvirus

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Le titrage à haut débit de la luciférase-virus recombinants exprimant

Présenté ici est un protocole pour une approche d’imagerie par fluorescence, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA , and protein (MICDDRP), une méthode capable de visualiser simultanément par fluorescence unicellulaire de protéines virales et d’acides nucléiques de différents types et brins. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de systèmes.

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Imagerie vivante et quantification de l’infection virale chez des souris transgéniques K18 hACE2 à l’aide du SARS-CoV-2 recombinant exprimant le rapporteur

Découvrez le système BIRFLU pour le suivi du virus Influenza A in vivo et in vitro. Cette méthode bi-reporter combinant luciférase et fluorescence permet d'évaluer l'efficacité des traitements antiviraux et les réponses immunitaires chez la souris.

Un virus de la grippe Luciferase-fluorescent Reporter pour l'imagerie en direct et la quantification de l'infection virale

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