Détection de fusion génique oncogène utilisant la réaction ancrée de chaîne de polymérase de multiplex suivie du séquençage de prochaine génération

Ce protocole est utilisé pour la détection de fusions génétiques extrêmement instructives pour les échantillons de tumeurs des patients. L’état de fusion de dizaines de gènes est évalué simultanément en un seul essai. L’avantage de cette technique est que je peux identifier les fusions génétiques indépendamment de l’identité du partenaire de fusion à partir d’échantillons tumoraux qui ont été traités par fixation formulative.

La détection de certaines fusions génétiques dans l’échantillon clinique de tumeur informe directement le diagnostic, le pronostic et la sélection de traitement dans beaucoup de types de cancer. Il est essentiel de comprendre que de nombreuses fusions appelées par l’algorithme d’analyse sont des artefacts. La tâche la plus difficile lors de l’analyse des données consiste à faire la distinction entre les appels d’artefacts et les appels de fusion réels.

Commencez par diluer l’acide nucléique total pour atteindre la concentration désirée d’ARN. Pour chaque échantillon, transférer 20 microlitres de la dilution dans les tubes aléatoires de bande réamorçante dans un bloc d’aluminium pré-refroidi et mélanger en pipetting de haut en bas six à huit fois. Faites tourner brièvement les échantillons, transférez tout le volume dans une plaque PCR de 96 puits et scellez-les avec un film de scellant de plaque.

Insérez la plaque dans un thermocycleur, couvrez-la de la garniture de compression et fermez le couvercle. Incuber à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, transférer tout le volume du produit d’amorçage aléatoire dans les premiers tubes à bande réamorçante.

Mélanger en pipetting de haut en bas et tourner brièvement vers le bas. Transférer l’intégralité du volume dans une plaque PCR de 96 puits et sceller avec un film RT. Insérez la plaque dans le thermocycleur et exécutez la réaction selon les instructions manuscrites.

Effectuer la synthèse cDNA deuxième brin, et la réparation, et la ligature étape un selon les instructions manuscrites et procéder à la deuxième étape de ligature. Pour numéroter le code à barres moléculaire ou les tubes à bande adaptateur MBC, placez les tubes horizontalement avec des charnières à l’arrière et utilisez un marqueur permanent. Prenez la plaque de purification de perle de la première étape de ligature et transférez 40 microlitres de chaque échantillon dans les tubes de bande d’adaptateur de MBC, prenant soin de ne pas déranger la pastille de perle.

Mélanger les reagents par pipetage, tourner vers le bas les tubes, et transférer l’ensemble du volume à l’étape de ligature deux tubes bande de réaccente. Mélanger les échantillons, les faire tourner vers le bas, et placer dans un bloc thermocycleur. Laissez le couvercle chauffé hors tension et faire fonctionner le thermocycleur à 22 degrés Celsius pendant cinq minutes, suivi d’une prise de 4 degrés Celsius.

Ensuite, préparez les perles de nettoyage de ligature en les vortexant et en ajoutant 50 microlitres à un nouvel ensemble de tubes à bande PCR. Incuber sur l’aimant pendant une minute et jeter le surnatant. Retirez les tubes de bande de l’aimant et résuspendez les perles dans 50 microlitres de tampon de nettoyage de ligature en pipetting de haut en bas.

Transférer l’ensemble du volume de l’échantillon de la deuxième étape de ligature dans la bande de perles de nettoyage de ligature. Vortex les échantillons à mélanger et les laisser à température ambiante pendant 10 minutes. Vortex l’échantillon une fois à mi-chemin de l’incubation.

Ensuite, vortex les échantillons, les faire tourner vers le bas, et incuber sur l’aimant pendant une minute. Jetez le supernatant et ajoutez 200 microlitres de tampon de nettoyage de ligature fraîche. Vortex à résuspendre, tourner vers le bas, et placer sur l’aimant pendant une minute.

Après les deux lavages, effectuer un troisième lavage à l’aide d’eau ultrapure au lieu de tampon. Resuspendez les perles dans 20 microlitres d’hydroxyde de sodium de 5 millimètres et transférez les échantillons dans une plaque PCR de 96 puits. Placez la plaque dans un thermocycler avec un tampon de compression et exécutez-la à 75 degrés Celsius pendant 10 minutes, suivie d’une prise de 4 degrés Celsius.

Une fois que les échantillons ont refroidi à 4 degrés Celsius, placez la plaque sur un aimant pendant au moins trois minutes et procédez avec le premier PCR. Préparez les réactions pcr en ajoutant deux microlitres d’amorces GSP1 à chaque puits de la première bande de reagent PCR. Transférer 18 microlitres du deuxième produit de nettoyage de ligature vers les premiers tubes à bande de reagent PCR et mélanger par pipetting de haut en bas.

Faites tourner les échantillons et transférez-les dans une plaque PCR de 96 puits. Placez-les dans le thermocycleur et exécutez PCR selon les instructions manuscrites. Procéder à la purification des perles en ajoutant 20 microlitres du produit PCR à une plaque à fond U remplie de 24 microlitres de perles de purification par puits.

Pipette de haut en bas pour mélanger et laisser la plaque à température ambiante pendant cinq minutes, puis incuber la plaque sur l’aimant pendant deux minutes. Jetez le supernantant des perles et lavez-les deux fois avec 200 microlitres de 70% d’éthanol. Après le lavage final, retirer tout l’éthanol et laisser sécher l’échantillon pendant deux minutes.

Retirer la plaque de l’aimant et réutiliser les perles dans 24 microlitres de 10 millimètres Tris-HCl et pH 8,0. Incuber l’aimant pendant trois minutes, puis remettre la plaque sur l’aimant pendant deux minutes. Commencez la quantitation de la bibliothèque en préparant une à cinq dilutions du deuxième produit PCR en Tris-HCl de 10 millimètres.

Suivez ceci par une dilution sérielle de 1:199, 1:199, et 20:80 dans 10 millimètres Tris-HCl avec 05% polysorbate. Installez pcr clé en ajoutant six microlitres de mélange maître à chaque puits d’une plaque optique de 96 puits, suivie de quatre microlitres de la dilution ou de la norme appropriée. Faites tourner la plaque et chargez-la dans l’instrument qPCR.

Effectuez qPCR selon les instructions manuscrites. Une fois la quantification de la bibliothèque terminée, diluer toutes les bibliothèques à deux nanomolaires avec tris-HCl de 10 millimètres. Faites un pool de bibliothèques en combinant 10 microlitres de chaque bibliothèque normalisée en un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.

Ensuite, préparez la bibliothèque amplicon dénaturée, ou piscine DAL, en combinant 10 microlitres de la piscine de la bibliothèque avec 10 microlitres de 0,2 hydroxyde de sodium normal et en incubant le mélange pendant cinq minutes à température ambiante. Après l’incubation, ajouter 10 microlitres de 200 millimètres Tris-HCl au pH 7.0, suivi de 970 microlitres de tampon d’hybridation HT1. Faites le tube de charge final en combinant 300 microlitres de HT1, 25 microlitres de 20 picomolaires PhiX et 675 microlitres de la piscine DAL.

Ajouter tout le volume du tube de charge au puits d’échantillon de la cartouche de reagent séquenceur et charger la cartouche dans le séquenceur. Commencez par sélectionner l’échantillon de contrôle positif et assurez-vous que toutes les fusions attendues et les isoformes oncogènes ont été détectés et sont répertoriés dans l’onglet des preuves solides. Pour chaque échantillon, inspectez les sites de démarrage uniques moyens par valeur de contrôle GSP2, puis visualisez les lectures de support pour chaque fusion potentielle en cliquant sur le lien Visualize qui emmène l’utilisateur vers une vue JBrowse web des carambolages de fusion individuelle à l’appui des lectures.

Confirmez que les lectures sont pour la plupart exemptes d’inadéquation, mais plus de 30 bases des lues s’alignent avec le partenaire de fusion, et que les séquences adjacentes au point de rupture entre les gènes et les sites de liaison d’amorce sont exemptes d’insertions ou de suppressions. Il est essentiel de s’assurer que chaque fusion d’appels est généralement exempte de désalignement et qu’une partie importante des lectures s’aligne sur le partenaire de fusion. Ce protocole a été employé pour étudier le statut de fusion de gène dans un échantillon d’adénocarcinome de poumon.

Le résumé montre des fusions de données solides et la page Lire les statistiques montre les paramètres de l’échantillon. Cet échantillon présente une bonne qualité d’ARN, de sorte que des résultats négatifs seraient signalés si aucune fusion n’était trouvée. Un appel de fusion légitime a un grand nombre de lectures de soutien, un pourcentage élevé de lectures de l’amorce soutenant la fusion, et un grand nombre de sites de démarrage.

La visualisation des lectures démontre un bon alignement sur les grandes régions du partenaire de fusion. Inversement, un appel de fusion artefactual a des mesures de support inférieures et un taux d’erreur élevé lors de la cartographie vers le partenaire. Les appels de fusion artifactual effectués par l’algorithme d’analyse sont fréquents.

Il est essentiel d’inspecter manuellement chaque appel pour s’assurer qu’il représente une véritable fusion génétique dans l’échantillon du patient.