Name: Bactéries étiquetées fluorescentes comme traceur pour révéler de nouvelles voies de flux de carbone organique dans les écosystèmes aquatiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Découvrez une méthode de marquage fluorescent pour quantifier les taux de broutage des eucaryotes aquatiques prédateurs. Cette technique unique permet de visualiser et d'estimer les flux de carbone et d'énergie dans les réseaux trophiques microbiens.

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Cette étude a été soutenue par la Fondation tchèque des sciences dans le cadre de la subvention de recherche 13-00243S et 19-16554S accordée set à K. et D. S., respectivement. Cet article a également été soutenu par le projet "Biomanipulation comme outil pour améliorer la qualité de l'eau des réservoirs de barrages" (No CZ.02.1.01/0.0/0.0/16-025/0007417), financé par le Fonds européen de développement régional, dans le domaine de la recherche, du développement et du développement des programmes opérationnels et l'éducation.

1. Collecte d'échantillons
<ol><li>
Collecte de l'échantillon d'eau du réservoir: première étude de cas (Exp I; système naturel inférieur d'abondance des prédateurs in situ et des proies)<ol>
<li>Recueillir des échantillons d'eau à l'endroit désiré à une profondeur appropriée. Conservez les échantillons dans une glacière à température contrôlée remplie à température in situ (en évitant les chocs de température; il convient de noter que les taux d'utilisation des protistes sont dépendants de la température) pendant le transport au laboratoire. REMARQUE : Notre échantillonnage a été effectué dans le réservoir méso-eutrophique en forme de canyon (Bohême du Sud, volume 34,5 x 106 m3, profondeur maximale 43 m, temps de rétention moyen 100 jours, dimictique). Le site d'échantillonnage était situé à une profondeur de 30 m, près du barrage. Un échantillon mixte d'une profondeur de 0,5 m a été prélevé par un échantillonneur Friedinger de 2 l.</li>
		<li>Continuez à la section 1.2 dès que possible.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Collecte de liquide dans les pièges des plantes carnivores Utricularia reflexa: la deuxième étude de cas (Exp II; un système avec des abondances de prédateurs et de proies élevées, volume d'échantillon extrêmement faible)<ol>
<li>Secouez doucement les plantes sous l'eau, retirez-les du contenant de culture et placez-les sur des matières absorbantes pour absorber l'excès d'eau. Selon la robustesse des plantes et la taille des pièges, choisissez 8-10 individus de plante.</li>
		<li>Divisez chaque pousse en parties à peu près égales en comptant les nœuds de feuilles portant des organes de piégeage. Chaque segment de pousse servira à recueillir des échantillons mixtes représentant des pièges jeunes, d'âge moyen et anciens.</li>
		<li>Fixez un mince capillaire en verre et une fiole Eppendorf pour la collecte d'échantillons à une pompe péristétique. Procéder à l'insertion de la pointe capillaire dans l'ouverture du piège. À l'aide de la pompe à vide, aspirer tout le liquide de chaque piège jusqu'à ce que 900 à 100 l de liquide de piégeage soient recueillis pour chaque catégorie d'âge du piège.</li>
		<li>Utilisez des sous-échantillons triplicate de 200 L du fluide de piégeage mis en commun pour des expériences de pâturage protistan. Traiter immédiatement ceux-ci comme détaillé à la section 3. Préserver les 300 oL restants de l'échantillon pour toutes les autres analyses des composants microbiens vivant dans le fluide, comme détaillé ci-dessous (section 2).</li>
		<li>Passez immédiatement à l'article 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fixation des échantillons prélevés
<ol><li>Exp I et II : fixer des sous-échantillons d'eau/fluide de piégeage pour l'énumération bactérienne (section 4; environ 20 ml et 0,3 ml, respectivement) avec du formaldéhyde pendant au moins 1 h pour obtenir un volume final de 2 % : concentration en volume dans chaque échantillon. REMARQUE : Manipulez le formaldéhyde exclusivement dans le capot de fumée, et portez des gants en tout temps tout en manipulant des échantillons.</li>
</ol>3. Filtration d'échantillon
<ol><li>Dilution de l'échantillon (Exp I) : aucune dilution n'est nécessaire pour les échantillons d'eau du réservoir. (Exp II) : diluer l'échantillon de fluide de piège 10x-100x avec de l'eau MQ sans particules pour obtenir une distribution appropriée des microbes cibles sur les surfaces filtrantes avant de compter par microscopie épifluorescence.</li>
	<li>Filtrer 1-2 ml (Exp I) de l'eau du réservoir ou 10-30 l (Exp II) du sous-échantillon du fluide de piégeage pour le comptage bactérien sur des filtres noirs de la taille d'un pore de 0,2 m, à l'aide d'un entonnoir de filtration (25 mm de diamètre).</li>
	<li>Tainer les filtres avec dIPI (4',6-diamidino-2'-phenylindole dihydrochlorure, 0.2% concentration finale) pendant 4 min. REMARQUE : Évitez la contamination de la peau et de la surface de travail et portez des gants.</li>
	<li>Placez le filtre avec des microbes concentrés sur une goutte d'huile d'immersion (pour la microscopie fluorescente) sur une lame de microscope. Placez une autre goutte d'huile sur le centre du filtre et recouvrez-la d'une feuille de couverture, en veillant à ce que l'huile soit répartie uniformément.</li>
	<li>À ce stade, traiter de préférence les échantillons immédiatement, ou encore, les conserver au congélateur (-20 oC) pendant plusieurs semaines à plusieurs mois jusqu'à ce qu'une analyse plus approfondie soit effectuée.</li>
</ol>4. Recensement des nombres bactériens sur les filtres
<ol><li>Placez la diapositive sous le microscope épifluorescence (avec le filtre réglé correspondant au DAPI fluorochrome). Placez une grille de comptage de 10 x 10 dans l'une des oculaires. Déplacez la diapositive vers une position aléatoire.</li>
	<li>Quantifier les cellules bactériennes (fluorescence bleue) dans la zone de la grille de comptage (sous le grossissement 1000x). Dans les comptes, inclure les cellules traversant les bords gauche et supérieur de la grille de comptage, tout en excluant celles situées sur les bords droit et inférieur.</li>
	<li>Déplacez-vous vers une autre position aléatoire et répétez l'énumération sur au moins 10-15 grilles de comptage, s'élevant à 500 cellules comptées au total.</li>
	<li>Établir un facteur de conversion pour un microscope et un grossissement donnés, en fonction de la connaissance du rapport de la zone d'une grille à la zone de filtration effective totale du filtre. Ensuite, divisez le nombre total de cellules comptées par le nombre de grilles comptées, ce qui donne un nombre moyen de bactéries par grille.</li>
	<li>Multipliez ce dernier par le facteur de conversion établi et normalisez le nombre résultant par mL d'un échantillon (selon le volume d'échantillon filtré) pour obtenir l'abondance bactérienne totale par mL.</li>
</ol>5. Détermination de l'abondance du protistan
<ol><li>Fixer l'échantillon d'eau (Exp I) ou les sous-échantillons de fluide de piégeage (Exp II) avec soit du glutaraldéhyde (concentration finale de 1 %, plus approprié pour les échantillons contenant de la chlorophylle contenant des particules à traiter quelques jours à quelques semaines après la fixation) ou à l'aide du technique de décoloration formol-thiosulfate spécifiée ci-dessous. REMARQUE : Les deux techniques de conservation empêchent l'égestion du matériel ingéré des vacuoles alimentaires des protistes8.</li>
	<li>En ce qui concerne la technique de décoloration du formol-thiosulfate, ajoutez 100 l/1 l de la solution de Lugol dans 20 mL/200 l du sous-échantillon de fluide d'eau/piège (Exp I/Exp II, respectivement).</li>
	<li>Suivez immédiatement avec l'ajout de 0,5 mL/50 l de formaline tamponnée de borate, puis de 20 l/2 l de thiosulfate de sodium de 3 % (Exp I/Exp II, respectivement). REMARQUE: Le thiosulphate de sodium décolore la couleur jaune de Lugol pour permettre l'observation des cellules sous le microscope épifluorescence8.</li>
	<li>Filtrer un volume connu d'échantillon (selon le nombre de protistes cibles) sur des filtres en polycarbonate noir de la taille d'un pore.</li>
	<li>Estimer le nombre de l'espèce protiste est en comptant au moins 200 cellules sous grossissement 600x en utilisant la grille de comptage (voir ci-dessus).</li>
	<li>Réduire le volume de l'échantillon sous vide dans l'entonnoir de filtration à feu doux à environ 2 ml. Ensuite, relâchez la sous-pression et ajoutez le fluorochrome DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorure13, 0.2% concentration finale) pendant 2 min.</li>
</ol>6. Détermination de la structure communautaire des ciales dans des échantillons de plancton
REMARQUE : Les communautés ciliates dans les habitats d'eau douce sont très diverses14,15,16,18, et leur détermination microscopique est difficile. Trier les groupes de ciliate en guildes fonctionnelles10,14,16,17 permet une analyse plus détaillée des différents groupes de ciliate comme bactérioristes pélagiques.
<ol><li>Évaluer la structure communautaire du ciliate en combinant les éléments suivants :<ol>
<li>Échantillons tachés de DAPI dans la microscopie épifluorescence (pour localiser les cellules ciliate avec fluorescence lumineuse des macro- et micro-nucléées de différentes tailles et morphologie) combinés avec l'apport de bactéries fluorescentes étiquetées (FLB8; pour plus de détails, voir ci-dessous), le suivi de la capacité des cialiates à se nourrir de bactéries.</li>
		<li>Observation d'échantillon en direct dans certains cas17,19. Pour plus de détails sur les approches et les critères ci-dessus utilisés pour regrouper les ciliens en différentes catégories taxonomiques, voir les publications précédentes16,17. REMARQUE : Des études citées ont indiqué que parmi les cigales, les espèces omnivores de Stichotrichia (genera Halteria et Pelagohalteria) et D'Oligotrichia (à savoir Rimostrombidium spp.) sont les plus importants consommateurs pélagiques de bacterioplancton dans une grande majorité des habitats d'eau douce10,17,18.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Estimation des taux de pâturage du ciliate
<ol><li>Calculer les taux d'utilisation des cigales sur les bactéries en fonction des changements dans le nombre moyen de traceurs [c.-à-d., FLB8 par ciliate lié au temps d'incubation (5-15 min)] et la quantité de traceur de FLB ajouté, représentant au plus de 5%-15% des bactéries totales.</li>
	<li>Pour comparer les taux d'utilisation entre les différentes espèces de protistan, normalisez les taux d'utilisation en tant que nombre de bactéries par ciliate par heure, avec des calculs basés sur le temps d'incubation réel et la proportion de traceur FLB ajouté. REMARQUE : Le schéma général de l'application de la méthode FLB pour estimer les taux de bactérioris spécifiques aux cellules ou aux espèces et en vrac dans les échantillons naturels est représenté à la figure 1.</li>
	<li>Préparation de FLB à partir de souches bactériennes indigènes à un environnement d'eau douce8<ol>
<li>Sélectionnez une taille appropriée (volume cellulaire moyen et MCV) et une morphologie des bactéries afin qu'elles imitent efficacement les tailles typiques des cellules bactérioplanctoniques/bactériennes dans le système aquatique à l'étude. REMARQUE : Pour Exp I, un mélange de souches isolées provenant de l'emplacement d'étude du genre Limnohabitans et du Polynucleobacter a été utilisé (c.-à-d. bactérietypique et très abondante dans les lacs et les étangs)20. Pour plus de détails sur la morphologie et la taille des souches, voir les publications précédentes3,17,18,21.</li>
		<li>Récoltez les cellules bactériennes de la culture par centrifugation (5 000 x g)pendant 15 min au début de la phase stationnaire et mélangez-les à un rapport numérique qui donne mcV - SD des cellules dans le mélange correspondant au MCV typique des bactéries à l'endroit choisi.</li>
		<li>Suspendre les granulés dans 10 ml de saline tamponnée de phosphate (PBS; pH no 9).</li>
		<li>Ajouter 2 mg de colorant fluoré jaune-vert 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF, se lie aux protéines) à la suspension cellulaire dans le tampon phosphate-saline, et couver dans un bain d'eau de 60 oC pendant 2 h.</li>
		<li>Après l'incubation, centrifuger les cellules vers le bas, décante la solution DTAF, et laver et centrifuger 3x avec PBS.</li>
		<li>Après le lavage final, re-suspendre les cellules dans20 ml de la mémoire tampon PP i-saline.</li>
		<li>Vortex la suspension FLB et pipette 1,5 mL aliquots en 2 ml cryo-vials, puis garder congelé (à -20 oC) dans PPi-saline tampon jusqu'à l'utilisation.</li>
		<li>Pré-filtre PPi-saline tampon à travers un filtre en polycarbonate de 0,2 m pour une utilisation dans l'étape suivante.</li>
		<li>Pour déterminer la concentration de FLB, transférer un petit aliquot (habituellement 20-40 l) à 2 ml de tampon PP i-saline sans particules, sonicate à 30 W pour plusieurs rafales de 2 s, et filtrez sur un filtre noir en polycarbonate de 0,2 m pour l'énumération par épifluorescence microscopie (1 000X grossissement) sous des paramètres de filtre optique pour DTAF (448 nm/520-540 nm).</li>
	</ol></li>
	<li>Technique de traçage pour l'estimation du bactériivory ciliate<ol>
<li>Pour les expériences de pâturage dans les habitats planctoniques naturels, distribuez des échantillons de 300 ml dans des flacons de 1 L bien rincés et incubez à température in situ pendant 15 min (pour permettre aux protistes de se remettre du choc de manipulation).</li>
		<li>Ajouter les traceurs FLB pour constituer 5%-15% des bactéries totales, avec les quantités ajoutées en fonction de la saison et la température de l'eau. REMARQUE : Il existe un spectre très large et dépendant de la saison dans les taux d'apitoier spécifiques aux espèces ciliate couvrant plusieurs ordres de grandeur (c.-à-d. de 101-104 bactéries ciliate-1 par heure)10,16, 17,18,22,23,24.</li>
		<li>Dans les périodes d'augmentation de l'occurrence des ciales avec des taux d'utilisation élevés (généralement pendant l'été), également exécuter une incubation parallèle avec des ajouts FLB très faible, constituant seulement 2%-4% des bactéries totales pour éviter le chargement excessif de vacuoles de ciliate par traceur FLB (voir exemples de la figure 2).</li>
		<li>Inciler des échantillons de ciliate/plancton avec FLB pendant 5-15 min.</li>
		<li>Il y a deux possibilités pour la fixation d'échantillon pour empêcher l'égestion du matériel ingéré des vacuoles de nourriture des protistes8. Terminer les incubations par l'ajout de 1 % de glutaraldéhyde (concentration finale qui convient mieux aux échantillons contenant des particules contenant de la chlorophylle, comme les algues). Vous pouvez également utiliser 100 l/10 l de la solution de Lugol dans un sous-échantillon de 20 ml/200 l de sous-échantillon de liquide d'eau/piège, suivi immédiatement de l'ajout de 0,5 mL/10 l de formaline tamponnée de borate, puis de 200 l/2 l de thiosulfate de sodium de 3 % (Exp I/Exp II, respectivement).</li>
	</ol></li>
	<li>Après l'ajout du fixatif, laisser reposer les échantillons pendant au moins 1 h dans l'obscurité à 4 oC afin d'assurer une conservation complète des cellules ciliate.</li>
	<li>Prenez des sous-échantillons naturels de plancton de 4 à 30 mL/10-30 l (Exp I/Exp II, respectivement; le volume dépend de l'abondance du ciliate) et tachent avec dAPI (concentration finale de 0,2 % wt/vol; pour plus de détails, voir l'étape 3.2 ci-dessus).</li>
	<li>Passer à travers des filtres noirs de 1 m et inspecter par microscopie épifluorescence pour compter les ciliates (600x grossissement) et énumérer le nombre de traceurs FLB ingérés (principalement à 1000x grossissement) comme détaillé dans les publications précédentes2,17 . Inspecter les échantillons dans les 7 jours suivant la conservation.</li>
	<li>Pour estimer le nombre total de pâturages spécifiques au protozoaires et aux espèces, multipliez les taux moyens d'utilisation de tous les cigales, ou seulement des espèces de ciliate détectées par l'abondance in situ.</li>
	<li>L'exemple du calcul des taux d'apaisement par cellule à partir des données in situ du réservoir d'eau d'Omov est décrit comme suit :<ol>
<li>Supposons que la concentration bactérienne est de 3,55 x 106 bactéries/mL et traceur FLB ajouté est de 0,25 x 106 FLB/mL, ce qui donne une somme de 3,8 x 106 bactéries/mL de particules bactériennes totales (bactéries naturelles - FLB - 100% des particules de proie) disponibles pour les protistes phagotrophiques dans l'échantillon naturel. REMARQUE : Les traceurs FLB ajoutés représentent ainsi 6,58 % (un projet de 0,25/0,038) du total des particules bactériennes. Le nombre moyen de FLB par Halteria sp. est de 6,2 FLB en 5 min d'incubations.</li>
		<li>Pour normaliser l'utilisation par heure, utilisez le calcul suivant : (6,2 x 12)/(6,58/100) et 1131 bactéries par cellule Halteria/h. REMARQUE : Pour plus d'exemples de distributions des taux d'apprepat individuels de Halteria sp. détectés sous des températures variables de l'eau, des quantités (en pourcentage) de TRACEur FLB ajouté, et des temps d'incubation différents avec FLB, voir Figure 3.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Kasalický, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+the+Limnohabitans+genus%2C+an+important+group+of+freshwater+bacterioplankton%2C+by+characterization+of+35+isolated+strains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The diversity of the Limnohabitans genus, an important group of freshwater bacterioplankton, by characterization of 35 isolated strains.</a> PLoS One. 8, 58209(2013).</li>
<li>Stabell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliate+bacterivory+in+epilimnetic+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Ciliate bacterivory in epilimnetic waters.</a> Aquatic Microbial Ecology. 10, 265-272 (1996).</li>
<li>Zingel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliates+are+the+dominant+grazers+on+pico-+and+nanoplankton+in+a+shallow%2C+naturally+highly+eutrophic+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Ciliates are the dominant grazers on pico- and nanoplankton in a shallow, naturally highly eutrophic lake.</a> Microbial Ecology. 53, 134-142 (2007).</li>
<li>Bickel, S. L., Tang, K. W., Grossart, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliate+epibionts+associated+with+crustacean+zooplankton+in+german+lakes%3A+distribution%2C+motility%2C+and+bacterivory%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ciliate epibionts associated with crustacean zooplankton in german lakes: distribution, motility, and bacterivory.</a> Frontiers in Microbiology. 3 (243), (2012).</li>
<li>Sirová, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunters+or+gardeners%3F+Linking+community+structure+and+function+of+trap-associated+microbes+to+the+nutrient+acquisition+strategy+of+a+carnivorous+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Hunters or gardeners? Linking community structure and function of trap-associated microbes to the nutrient acquisition strategy of a carnivorous plant.</a> Microbiome. 6, 225(2018).</li>
<li>Šimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+traits+of+a+zoochlorellae-bearing+Tetrahymena+sp.+%28Ciliophora%29+living+in+traps+of+the+carnivorous+aquatic+plant+Utricularia+reflexa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ecological traits of a zoochlorellae-bearing Tetrahymena sp. (Ciliophora) living in traps of the carnivorous aquatic plant Utricularia reflexa.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 336-348 (2017).</li>
<li>Pitsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+Tetrahymena+utriculariae+n.+sp.+%28Ciliophora%2C+Oligohymenophorea%29+with+its+endosymbiotic+algae+%28Micractinium+sp.%29%2C+living+in+the+feeding+traps+of+a+carnivorous+aquatic+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The green Tetrahymena utriculariae n. sp. (Ciliophora, Oligohymenophorea) with its endosymbiotic algae (Micractinium sp.), living in the feeding traps of a carnivorous aquatic plant.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 322-335 (2017).</li>
<li>Nielsen, J. M., Clare, E. L., Hayden, B., Brett, M. T., Kratina, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+tracing+in+ecology%3A+Method+comparison+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Ecology+and+Evaluation%22%5BJournal%5D)">Diet tracing in ecology: Method comparison and selection.</a> Methods in Ecology and Evaluation. 9, 278-291 (2018).</li>
<li>Beisner, B. E., Grossart, H. P., Gasol, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+methods+for+estimating+phago-mixotrophy+in+nanophytoplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plankton+Research%22%5BJournal%5D)">A guide to methods for estimating phago-mixotrophy in nanophytoplankton.</a> Journal of Plankton Research. , 1-13 (2019).</li>
<li>Dolan, J. D., Šimek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+ingested+matter+in+Strombidium+sulcatum%2C+a+marine+ciliate+%28Oligotrichida%29%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Processing of ingested matter in Strombidium sulcatum, a marine ciliate (Oligotrichida).</a> Limnology and Oceanography. 42, 393-397 (1997).</li>
<li>Massana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grazing+rates+and+functional+diversity+of+uncultured+heterotrophic+flagellates%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Grazing rates and functional diversity of uncultured heterotrophic flagellates.</a> The ISME Journal. 3, 588-596 (2009).</li>
<li>Grujčić, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptophyta+as+major+freshwater+bacterivores+in+experiments+with+manipulated+bacterial+prey%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Cryptophyta as major freshwater bacterivores in experiments with manipulated bacterial prey.</a> The ISME Journal. 12, 1668-1681 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Déchiffrer l'interaction trophique dans les systèmes aquatiques est toujours difficile28, en particulier à l'échelle nano-plancton impliquant les protistes et leurs proies, les bactéries. Quand il s'agit de voies d'absorption des nutriments et de quantification, l'application de méthodes utilisées avec succès à des niveaux trophiques plus élevés est moins possible, en raison de la grande complexité des interactions biotiques. Il s'agit, par exemple, d'approches stables d'étiquetage des isotopes. C...

Les procaryotes hétérotrophes sont un composant biologique clé dans les systèmes aquatiques et représentent une fraction importante de la biomasse du plancton1,2,3. Les facteurs qui contrôlent leur abondance, leur diversité et leur activité sont essentiels pour comprendre leur rôle dans le cycle biogéochimique (c.-à-d. le sort du carbone organique et d'autres nutriments et le flux d'énergie des procaryotes à des niveaux trophiques plus élevés). Le pâturage protozoaires est l'un de ces facteurs importants. Bacterivory des nanoflagellates et des cils hétérotrophes impose un contrôle descendant fort sur l'abondance procaryotique, la fonction de la communauté, la structure, la diversité, et même la morphologie cellulaire et le taux de croissance de groupes bactériens particuliers4, 5,6. Dans certains systèmes, les protistes sont la principale cause de mortalité bactérienne6,7.
L'approche standard utilisée pour évaluer le bactérioris protozoaire, qui est utilisé depuis un certain temps déjà, implique l'utilisation de bactéries étiquetées fluorescentes (FLB) comme analogues de proie et microscopie épifluorescence. Les taux d'apaisement spécifiques aux cellules peuvent être déterminés en quantifiant le nombre de particules de proies étiquetées dans les vacuoles alimentaires du protistan sur un parcours temporel sélectionné8. Cette approche présente plusieurs avantages. Tracer est ajouté à des échantillons naturels avec des assemblages naturels de prédateurs et de proies. Il y a une manipulation minimale de l'échantillon avant l'incubation, une altération minimale de l'échantillon par le traceur FLB ajouté, et les temps d'incubation sont courts pour s'assurer que les résultats sont solides obtenus dans des conditions proches de l'in situ. Alternativement, dans les environnements où le nombre de protistes bactérioraires ou de zooplancton (p. ex., les systèmes marins extracôtiers), les taux de disparition des FLB ajoutés aux échantillons en faibles quantités (2 % à 3 % de traceur) peuvent être détectés par cytométrie de débit à long terme (12-24 h). expériences d'incubation. Ensuite, les nombres de FLB aux points de départ et d'extrémité (intégrant l'impact de tous les bactérioris) sont quantifiés par cytométrie de flux (pour plus de détails, voir la publication précédente9). Cependant, un tel paramètre ne représente que les taux totaux de bactérioris agrégés qui ne peuvent être directement attribués à des groupes ou espèces de brouteurs de protistan et de zooplancton en particulier.
Dans l'ensemble, il peut être difficile de quantifier avec précision et avec un sens écologique les taux de mortalité bactérienne spécifiques aux espèces protistan ou au morphotype dans l'environnement aquatique. Certains protistes sont des brouteurs sélectifs, et la taille et la forme cellulaire du traceur FLB ajouté peuvent fausser les taux naturels d'ingestion deproies 10,11. En outre, l'activité et le métabolisme du protistan sont très sensibles à la température12; par conséquent, la quantité de traceur FLB ajouté doit être soigneusement manipulée pour chaque type d'échantillon individuel (non seulement en fonction de l'abondance naturelle, la taille et la morphologie des bactéries et des types dominants de bactériivores, mais aussi sur la température). La plupart des études portent sur l'activité de pâturage en vrac du protistan; cependant, le bactériérique d'espèces spécifiques de protistan a souvent une valeur d'information beaucoup plus élevée et peut être préférable. Dans ce cas, la connaissance taxonomique des espèces protistes présentes dans un échantillon et la compréhension de leur comportement sont nécessaires. Par conséquent, des quantités considérables de temps et de travail sont nécessaires pour obtenir des résultats solides sur les taux spécifiques d'espèce de bactériorisattribuable attribuable à un groupe ou une espèce protistan particulier.
Malgré ces difficultés, cette approche demeure l'outil le plus approprié actuellement disponible pour évaluer le bactériivory protistan dans les milieux naturels. Présenté ici est une méthode complète, facile à suivre pour utiliser FLB comme un traceur dans les études d'écologie microbienne aquatique. Tous les aspects problématiques mentionnés de l'approche sont pris en compte et un flux de travail amélioré est décrit, avec deux expériences à partir d'environnements contrastés ainsi que des espèces de ciliate contrastées à titre d'exemples.
La première étude de cas a été menée dans un environnement épilimnétique à partir du réservoir d'eau mésotrophique d'Omov en République tchèque, qui montre des abondances de broussailles et de bactéries comparables à la plupart des plans d'eau douce de surface (cf.5,7). La deuxième étude de cas a été menée dans l'environnement très spécifique à l'intérieur des pièges de la plante carnivore aquatique Utricularia reflexa, qui accueille un nombre extrêmement élevé de deux ciliates mixotrophiques de pâturage (Tetrahymena utriculariae) cellules bactériennes. Les calculs des taux de pâturage spécifiques aux cellules et des stocks permanents bactériens dans les deux types d'échantillons sont présentés. Une série d'interprétations écologiques des résultats est ensuite discutée, et des exemples d'études de suivi possibles sont finalement suggérés.

<table><tbody><tr><td>0,2 et micro ; Filtres de taille de pores M&nbsp ;</td><td>Alimentations SPI, https://www.2spi.com/</td> <td>B0225-MB</td><td>Noir, filtres à membrane de gravure sur piste en polycarbonate, diamètre approprié pour l’appareil de filtrage utilisé</td></tr><tr><td>5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescéine (DTAF)</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes automatiques à volumes réglables&nbsp ;</td><td>N’importe quelle marque, différentes tailles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>22 000 x g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryoflacons</td><td>N’importe quelle marque, 2 mL DAPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(4&acute ;,6-Diamidino-2&acute ;-dichlorhydrate de phénylindole)</td><td>N’importe quelle marque&nbsp ;</td><td></td><td>1 mg ml-1</td></tr><tr><td>Microscope à épiflorescence</td><td>Grossissement de 400 x à 1000 x</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Filtres appropriés pour l’observation dans la gamme</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> DAPI et DTAF <td>Grille de comptage dans l’un des oculaires</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Appareil de filtrage</td><td>Généralement d’un diamètre de 25 mm&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Une marque pour la microscopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Une marque pour la microscopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huile d’immersion pour la microscopie</td><td>Huile spécifique à faible fluorescence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lugol&acute ; Préparer</td><td></td><td></td><td>une solution alcaline de Lugol comme suit : Solution 1 - dissoudre 10 g d’iodure de potassium dans 20 ml dans de l’eau MQ, puis ajouter 5 g d’iode. Solution 2 - ajouter 5 g d’acétate de sodium. à 50 ml d’eau MQ. Ajouter la solution 2 à la solution 1 et bien mélanger</td></tr><tr><td>Formol stabilisé au méthanol</td><td>Toute marque disponible à des fins</td><td></td><td></td>de microscopie</tr><tr><td>Lames de microscope et lamelles de protection</td><td>Toute marque produite à des fins de microscopie&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MQ eau pour la dilution des échantillons</td><td>N’importe quelle marque </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; pH = 9)</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>0,05 M Na2HPO4-NaCl, ajustée à pH 9</td></tr><tr><td>PPi-saline Tampon</td><td></td><td></td> Na<td>4P2O7-NaCl. Ajouter 0,53 g de Na4P2O7 à 100 ml d’eau MQ plus 0,85 g de NaCl&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dispositif d’échantillonnage&nbsp ;</td><td>Approprié pour obtenir un échantillon représentatif&nbsp ;</td><td></td><td>par exemple échantillonneur Friedinger pour plancton lacustre</td></tr><tr><td>Solution de thiosulfate de sodium</td><td>Toute marque</td><td></td> de <td>solution à 3 % est utilisée dans le protocole</td></tr><tr><td>Sonicateur</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>30 W</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>N’importe quelle marque permettant un mélange minutieux des solutés et des échantillons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Toute marque permettant de maintenir la température à 60 &deg ; L</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bactéries étiquetées fluorescentes comme traceur pour révéler de nouvelles voies de flux de carbone organique dans les écosystèmes aquatiques

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

L'élucidation des interactions trophiques, telles que la prédation et ses effets, est une tâche fréquente pour de nombreux chercheurs en écologie. L'étude des communautés microbiennes a de nombreuses limites, et il est souvent difficile de déterminer les taux de prédateurs, de proies et de prédateurs. Présenté ici est une méthode optimisée basée sur l'ajout de proies fluorescentes étiquetées comme un traceur, ce qui permet une quantitation fiable des taux de pâturage dans les eucaryotes prédateurs aquatiques et l'estimation du transfert de nutriments à des niveaux trophiques plus élevés.

Exemple d'expérience Que j'ai été exécuté dans le réservoir d'eau d'Imov (Bohême du Sud, CZ), qui est un site naturel avec un prédateur naturel plus faible et l'abondance des proies. Des données représentatives sont rapportées pour l'espèce de ciliate omnivore Halteria grandinella, qui est un broussaillage abondant et efficace de particules picoplancton (lt;2 m)10,16,17,18 <...

Présenté ici est un protocole pour une seule cellule, l'épifluorescence technique basée sur la microscopie pour quantifier les taux de pâturage chez les eucaryotes prédateurs aquatiques avec une haute précision et une résolution taxonomique.

Bactéries étiquetées fluorescentes comme traceur pour révéler de nouvelles voies de flux de carbone organique dans les écosystèmes aquatiques

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Cette approche est significative car elle nous permet de visualiser et d’estimer les flux de carbone et d’énergie des procaryotes aux niveaux trophiques plus élevés dans les réseaus alimentaires microbiens à très haute résolution. Il s’agit de la seule technique actuellement disponible pour déterminer quelles espèces protistes consomment des bactéries in situ, tout en quantifiant le taux de ce processus à un niveau unicellique. Étant donné que les bactéries sont les seuls microbes importants qui changent le carbone organique dissous en carbone organique particulaire, les connaissances des acteurs impliqués et les taux auxquels cela se produit forment la base pour comprendre les écosystèmes aquatiques en général. Nous recommandons fortement aux chercheurs de se familiariser avec leur système d’étude avant de mener des expériences de pâturage. Il s’agit de la lumière et de l’épifluorescence de l’inspection par microscopie des échantillons, ainsi que de la connaissance du taxon principal présent et de leur dynamique saisonnière. Jitka Jezberov démontrera la procédure.

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Bactérioplancton environnement sont incubés avec un modèle de carbone organique dissous (DOC) composé et un réactif de marquage de l'ADN, bromodésoxyuridine (BrdU). Ensuite, DOC-dégradants cellules sont séparées de la communauté en vrac en fonction de leur incorporation de BrdU élevée en utilisant la fluorescence tri cellulaire (FACS). Ces cellules sont ensuite identifiés par des analyses moléculaires ultérieures.

Bromodésoxyuridine (BrdU) l&#39;étiquetage et ultérieures de tri cellulaire activé par fluorescence de la culture indépendante Identification de carbone organique dissous dégradants bactérioplancton

Source : Pioli, R., et al., Structuration des micro-organismes et des microparticules par assemblage séquentiel assisté par capillarité. J. Vis. Exp. (2021)Cette vidéo montre la méthode de capture de cellules uniques d’Escherichia coli (E. coli) marquées par fluorescence dans des pièges microfluidiques à l’aide d’une suspension sans carbone et d’un flux contrôlé, suivi d’un ajout de nutriments pour déclencher la croissance et d’une imagerie par fluorescence des microcolonies.

Structuration microfluidique et suivi par fluorescence de la croissance bactérienne unicellulaire

Source : Chetrit, D., et al. Application de l’imagerie à cellules vivantes et de la tomographie cryo-électronique pour résoudre les caractéristiques spatiotemporales du système de sécrétion dot/icm de Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).Cette vidéo montre la préparation et l’imagerie de bactéries pathogènes marquées par fluorescence. Les tampons d’agarose sont d’abord préparés et positionnés dans un cadre adhésif. Une suspension de bactéries génétiquement modifiées exprimant une...

Préparation d’échantillons et imagerie de bactéries marquées par fluorescence

Un procédé basé sur des protéines fluorescentes de cellules vivantes pour éclairer des vacuoles cellulaires (inclusions) contenant Chlamydia est décrit. Cette stratégie permet une détermination rapide et automatisée de l’infectiosité de Chlamydia dans les échantillons et peut être utilisée pour étudier quantitativement la dynamique de croissance des inclusions.

Utilisation de protéines fluorescentes de visualiser et de quantifier<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole la dynamique de croissance dans les cellules vivantes

Les études de biomolécules in vivo sont cruciales pour comprendre la fonction moléculaire dans un contexte biologique. Nous décrivons ici une nouvelle méthode permettant l’internalisation de biomolécules fluorescentes, telles que l’ADN ou les protéines, dans des micro-organismes vivants. L’analyse des données in vivo enregistrées par microscopie à fluorescence est également présentée et discutée.

Internalisation et l&#39;Observation des Biomolécules Fluorescent In Living micro-organismes par électroporation

Toute une analyse de biorapporteur cellulaire avec Burkholderia sartisoli RP037-MCHE a été développé pour détecter fractions d'un contaminant organique (par exemple, le fluorène) disponible pour la dégradation bactérienne après le transport actif par mycéliums de pontage des pores remplis d'air dans un système de modèle insaturé de l'eau.

Une approche Cell biorapporteur entières pour évaluer transport et la biodisponibilité des contaminants organiques dans les systèmes insaturés eau

Le rôle de l'assortiment (ségrégation spatiale) dans les scénarios d'évolution peut être examinée à l'aide des systèmes microbiens simples en laboratoire qui permettent le réglage de la distribution spatiale contrôlée. En modifiant la densité cellulaire fondateur, différents niveaux d' assortiment peuvent être visualisées en utilisant des souches bactériennes marquées par fluorescence dans les biofilms de colonies de Bacillus subtilis.

Surveillance spatiale Ségrégation en surface Colonizing populations microbiennes

Comprendre la fonction des processus essentiels chez les bactéries est difficile. Microscopie à fluorescence avec des colorants spécifiques à la cible peut éclairer clé dans la progression de la croissance et cycle cellulaire des cellules microbiennes. Ici, Agrobacterium tumefaciens est utilisé comme une bactérie modèle pour mettre en évidence les méthodes d’imagerie de cellules vivantes pour la caractérisation des processus essentiels.

Vivre la microscopie de Fluorescence cellulaire afin d’observer les processus essentiels au cours de la croissance des cellules microbiennes

Ce manuscrit décrit une méthode pour l’étiquetage individuel ARN messager (ARNm) transcriptions avec sondes d’ADN marquées fluorescent, pour une utilisation en single-molecule fluorescence in situ (smFISH) expériences d’hybridation chez e. coli. smFISH est une méthode de visualisation qui permet la détection simultanée, de localisation et quantification des molécules d’ARNm uniques dans des cellules individuelles fixes.

Méthode pour l’étiquetage des transcriptions dans les cellules individuelles Escherichia coli pour Single-molecule Fluorescence In Situ des expériences d’hybridation

Ce protocole d’imagerie cellulaire bactérienne vivante permet de visualiser les interactions entre plusieurs espèces bactériennes au niveau unicellulaire au fil du temps. L’imagerie par time-lapse permet d’observer chaque espèce bactérienne en monoculture ou en coculture afin d’interroger les interactions inter-espèces dans les communautés bactériennes multi-espèces, y compris la motilité cellulaire individuelle et la viabilité.

Visualisation cinétique des interactions bactériennes interspécifiqueuses unicellulaires

Nous décrivons ici une procédure qui permet de détecter les bactéries pathogènes à l’échelle de l’organe pendant l’infection et de quantifier les activités des rapporteurs fluorescents.

Tomographie tridimensionnelle à haute résolution des infections microbiennes

Découvrez une méthode de marquage fluorescent pour quantifier les taux de broutage des eucaryotes aquatiques prédateurs. Cette technique unique permet de visualiser et d'estimer les flux de carbone et d'énergie dans les réseaux trophiques microbiens.

Bactéries étiquetées fluorescentes comme traceur pour révéler de nouvelles voies de flux de carbone organique dans les écosystèmes aquatiques (Vidéo) | JoVE Journal

Bactéries étiquetées fluorescentes comme traceur pour révéler de nouvelles voies de flux de carbone organique dans les écosystèmes aquatiques

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