Name: Microscopie de fluorescence à cellules vivantes pour étudier la localisation des protéines subcellulaires et les changements de morphologie cellulaire chez les bactéries (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Découvrez la microscopie à fluorescence pour étudier la localisation des protéines et les changements morphologiques chez Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus. Cette méthode permet l'observation directe des processus cellulaires en temps réel.

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Nous remercions les membres de notre laboratoire pour leurs commentaires sur cet article. Ces travaux ont été financés par une subvention de démarrage de l'Université de Floride du Sud (PE).

1. Conditions générales de croissance
<ol><li>Inoculer 2 ml de milieu de croissance approprié complété par des antibiotiques (si nécessaire) avec une seule colonie de la souche à imager. Incuber ces cultures de semences pendant la nuit à 22 oC dans un incubateur secouant. REMARQUE : Les conditions de croissance bactérienne spécifiques utilisées dans cet article sont fournies sous la section des résultats représentatifs.</li>
	<li>Diluer les cultures de nuit 1:20 dans les médias frais dans un flacon de 125 ml, compléter avec des antibiotiques (si nécessaire).</li>
	<li>Cultiver la culture (s) à 37 oC dans un incubateur secouant jusqu'à la phase mi-logarithmique (OD600 à 0,5). REMARQUE : L'inducteur ou l'inhibiteur pourrait être ajouté directement à la culture de croissance (s) à la phase de croissance appropriée.</li>
	<li>Cellules de récolte aux conditions de culture souhaitées pour la préparation de l'échantillon de microscopie comme décrit dans la section suivante.</li>
</ol>2. Préparation de l'échantillon
<ol><li>Préparer 1% agarose en combinant 0,25 g de qualité de biologie moléculaire, faible EEO, agarose avec soit 25 ml de milieu de croissance complété avec des antibiotiques appropriés (si nécessaire) pour la microscopie timelapse ou de l'eau stérile. Chauffer le mélange à l'aide d'un four à micro-ondes pendant environ 30 s et le verser dans un plat stérile de 100 mm x 15 mm Petri et le laisser solidifier.</li>
	<li>Prenez un aliquot de 5 à 50 L de la culture cellulaire en fonction des besoins et tachent les cellules. Cellules de tache avec les colorants appropriés à ce stade (p. ex., ajouter le colorant fluorescent FM4-64 (tache de membrane) pour une expérience (figure 1)).<ol>
<li>Pipette a 5 l'aliquot de l'échantillon de culture ou de l'échantillon taché pour être photographié sur le fond d'un plat de culture de fond de verre de 35 mm (avec un diamètre microwell de 14 mm et un bordereau non couché no 1.5; voir le tableau des matériaux). CAUTION: Ne pas utiliser poly-L-lysine enduits de couvertures en particulier pour la microscopie timelapse car ils pourraient induire différents modèles de croissance (nous avons observé cela avec la poly-D-lysine ainsi; données non montrées) et / ou affecter la dynamique des protéines6.</li>
		<li>Pour réduire au minimum l'utilisation des colorants, tachez la suspension cellulaire de 3 à 4 l (récoltée à600 OD et 0,5; environ 2,7 x 107 et 3,4 x 107 pour B. subtilis et S. aureus respectivement par culture de 1 ml) directement sur le plat en verre.</li>
		<li>Placer une dalle d'agarose prédécoupée (11 mm de diamètre ou de n'importe quelle taille désirée pour chevaucher la zone de la glissière; couper à l'extrémité ouverte d'un tube stérile ou d'une lame de rasoir) sur le dessus de l'échantillon et taper doucement pour s'assurer que la dalle d'agarose est couchée à plat contre la glissière.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après l'imagerie (voir la section suivante), si le nombre de cellules dans le champ de vision n'est pas souhaitable, ajuster la densité cellulaire de l'échantillon par dilution ou concentration par centrifugation et modifier le rapport des cellules dans l'échantillon en utilisant le milieu de croissance / tampon au besoin. REMARQUE : Pour minimiser l'autofluorescence émanant du milieu de culture, les cellules peuvent être lavées en tampon (par exemple dans la saline tampon de 1x phosphate standard) et remises en suspension dans la quantité appropriée de tampon avant l'imagerie. Il est possible que dans cette étape de plus petites cellules ou vésicules ne peuvent pas être conservés après centrifugation et seront donc perdus.</li>
	<li>Ajouter de l'eau à l'aide d'une pipette (5 gouttes ll) à l'espace à l'intérieur du plat de culture (autour de la couverture) pour empêcher le tampon d'agarose de sécher, et pour aider à maintenir l'humidité au cours de l'acquisition de l'image, en particulier pour les expériences timelapse.</li>
	<li>Laissez les plats de culture acquerquer à la température à l'intérieur de la chambre d'incubation, un compartiment opaque intégré fourni par le fabricant, du microscope pendant 15 à 20 min. REMARQUE : Allumez l'élément chauffant et fixez la chambre d'incubation à une température désirée plusieurs heures avant l'imagerie. Cela permettra de s'assurer que le matériel se stabilise à la nouvelle température. Pour l'imagerie en timelapse prolongée, placez un bécher ou un flacon avec de l'eau à l'intérieur de la chambre de microscope, loin de la zone de travail, pour maintenir l'humidité.</li>
</ol>3. Imagerie
<ol><li>Le jour de l'expérience, allumez le système de microscope. Démarrez le logiciel d'imagerie (voir Tableau des matériaux) en cliquant sur l'icône appropriée sur le bureau. Initialisez le microscope en cliquant sur l'option Microscope Initialize (bouton représenté avec un microscope dessus) sur la boîte de dialogue de démarrage du logiciel. Assurez-vous que l'objectif est entièrement abaissé à l'aide du microscope ajustement grossier avant l'initialisation. REMARQUE : Après l'initialisation, trois boîtes de dialogue supplémentaires devraient apparaître en plus du menu de démarrage : resolve3D, collecte de données et moniteur de filtre.</li>
	<li>Placez une baisse de 1.517 (indice réfractif) d'huile sur l'objectif d'immersion d'huile 100x fourni par le fabricant (Ouverture numérique 1,4, Distance de travail 0,12 mm; voir Tableau des matériaux). REMARQUE : Il est important de choisir l'huile d'immersion appropriée pour la température à laquelle l'imagerie est effectuée.</li>
	<li>Chargez le plat en verre contenant de l'échantillon dans le boîtier métallique (cercueil) et glissez doucement dans la pince de scène.</li>
	<li>Utilisez le bouton d'ajustement grossier pour augmenter l'objectif jusqu'à ce que l'huile entre en contact avec le fond de verre du plat. Utilisez le morceau d'oeil et le bouton d'ajustement fin pour mettre l'échantillon au point. Une fois que les cellules sont au point tourner le bouton de la pièce de l'œil en mode caméra en déplaçant l'interrupteur de sélecteur situé sur l'avant du corps du microscope vers la gauche.</li>
	<li>Commencez l'expérience à l'aide du logiciel d'imagerie. Sur la fenêtre resolve3D, sélectionnez l'icône d'expérience Design/run représentée par un flacon. Une nouvelle boîte de dialogue doit apparaître intitulée conception /expérience d'exécution.<ol>
<li>Définir le nombre de z-stacks et l'épaisseur de l'échantillon à l'aide de la conception, puis la section de l'onglet sur la conception / exécuter la boîte de dialogue expérience. REMARQUE : Pour les expériences dans la section des résultats représentatifs, 17 z-stacks à 200 nm d'intervalle pour les images fixes et quatre z-stacks à 200 nm d'intervalle pour la microscopie timelapse ont été utilisés.</li>
		<li>Pour mesurer l'épaisseur des cellules de l'échantillon, ajustez manuellement le plan Z progressivement en utilisant les flèches de haut en bas sur la boîte de dialogue resolve3D. Marquez l'endroit où les cellules ne sont plus pointées comme la limite supérieure et inférieure pour l'acquisition d'images. Importer ces informations avant d'exécuter l'expérience.</li>
		<li>Pour aider à minimiser la phototoxicité et le photoblanchiment pendant l'imagerie en timelapse, réduisez le nombre de piles Z et choisissez le milieu du plan des cellules pour l'acquisition d'images.</li>
	</ol></li>
	<li>Sélectionnez l'ensemble de filtre approprié pour l'expérience à l'aide de la conception, puis canalise l'onglet sur la boîte de dialogue d'expérience de conception/exécution (TRITC : EX 542/27 ; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).<ol>
<li>En outre, sélectionnez une référence pour la collecte d'informations POL/DIC. Ajuster la transmission en pourcentage (intensité lumineuse) et la durée d'exposition pour les différents canaux sélectionnés avant l'imagerie en sélectionnant les options appropriées sur la boîte de dialogue resolve3D. REMARQUE : Dans un champ de vision d'essai qui n'est pas pris en compte pour le test d'expérience, ces paramètres identifient si les paramètres sélectionnés obtiennent des données significatives de fluorescence sans manquer de signal faible ou de sursaurisation. Ensuite, importer ces paramètres pour la mise en place expérimentale.</li>
	</ol></li>
	<li>Ouvrez la liste de points en sélectionnant le bouton liste de points sur la boîte de dialogue resolve3D. Une nouvelle boîte de dialogue doit apparaître intitulée liste de points. Marquez plusieurs champs de vision à utiliser dans l'expérience en trouvant des champs de vision appropriés à l'aide des contrôles d'étape au microscope et en sélectionnant l'option point de marque sur la boîte de dialogue de liste de points. REMARQUE : Un point de remplacement devra être sélectionné chaque fois que le microscope est recentré sur un point de la liste de points. Cela peut être fait en concentrant le microscope sur le point approprié dans la liste, puis en sélectionnant le bouton de point de remplacement. Il est important de ne pas toucher le bouton d'ajustement analogique grossier/fin lors du recentrage; utiliser uniquement le logiciel pour ajuster la mise au point.</li>
	<li>Définiz les paramètres timelapse en sélectionnant d'abord la conception, puis l'onglet timelapse sur la boîte de dialogue d'expérience de conception/exécution. Sélectionnez la case à cocher timelapse. Entrez les paramètres de timelapse appropriés en termes d'images timelapse/temps total.</li>
	<li>Définir les points à être représentés à partir de la liste de points en sélectionnant d'abord la conception, puis les points onglet sur la boîte de dialogue d'expérience de conception /exécution. Sélectionnez l'option liste de points de visite et entrez les points à imager dans la boîte de texte séparée par des virgules ou des traits d'union s'il s'agit d'une séquence complète.</li>
	<li>Avant de commencer une expérience, modifiez les noms de fichiers et les emplacements de fichiers à l'aide de l'onglet exécuter sur la boîte de dialogue de conception/exécution. L'emplacement du fichier peut être modifié en sélectionnant le bouton Paramètres, en sélectionnant le dossier de données, puis en sélectionnant le dossier approprié ou en créant un nouveau. Modifier les noms de fichiers en entrant dans le nouveau nom de fichier dans la boîte de texte de nom de fichier d'image.</li>
	<li>Commencez l'expérience en sélectionnant le bouton de lecture sur la boîte de dialogue d'expérience de début. REMARQUE : Pour le timelapse, vérifiez continuellement l'attention à chaque champ de vision tout au long de l'expérience en utilisant le paramètre DIC (pour éviter le photoblanchiment inutile) et recentrez et mettez à jour l'information dans la liste des points, car les cellules ont tendance à se concentrer au fil du temps.</li>
</ol>4. Traitement d'image
<ol><li>Ouvrez les fichiers d'images brutes (R3D) souhaités pour la génération de chiffres. REMARQUE : Les fichiers récemment enregistrés peuvent être localisés à l'aide du bouton de dossier de données sur la boîte de dialogue de démarrage du logiciel d'imagerie.</li>
	<li>Exécuter le programme de déconvolution, pour supprimer la lumière de fluorescence hors foyer7,8, afin de produire un fichier d'image D3D déconvolved. Sélectionnez l'onglet processus sur la boîte de dialogue de démarrage, puis sélectionnez déconvolve. Une nouvelle boîte de dialogue apparaîtra intitulée déconvolve.<ol>
<li>Définiz les paramètres de déconvolution en faisant glisser le numéro d'image approprié (situé dans le coin supérieur gauche de chaque fichier d'image) à l'entrée sur la boîte de dialogue de déconvolution. Sur la boîte de dialogue de déconvolution, sélectionnez le bouton plus d'options, et désélectionnez le rolloff de la frontière de culture après le traitement de la case à cocher (sinon les images ne peuvent pas être superposées sur le fichier DIC correspondant).</li>
		<li>Cliquez sur le bouton do it sur la boîte de dialogue deconvolution pour décongestionner le fichier d'image brute. REMARQUE : Les paramètres de déconvolution pourraient être ajustés comme indiqué par le manuel d'orientation du fabricant du logiciel pour les résultats souhaités.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si nécessaire, effectuez une soustraction manuelle de bruit de fond et un réglage de luminosité/contraste dans n'importe quel ou tous les canaux de longueur d'onde (couleur). Pour ce faire, en sélectionnant le bouton d'ajustement de contraste sur le fichier d'image déconvolved.</li>
	<li>Enregistrez l'image en tant que fichier TIFF en sélectionnant d'abord l'option de fichier en haut de la boîte de dialogue D3D. Sélectionnez ensuite enregistrer comme TIFF, identifier et sélectionner les z-piles appropriées (qui sont au point), sélectionnez ou déssélectionnez les ensembles de filtres souhaités.</li>
	<li>Effectuer la quantification des données à l'aide de tout logiciel fourni par le fabricant ou de programmes librement disponibles tels que ImageJ5.<ol>
<li>Pour la quantification de la taille des cellules, cliquez sur l'onglet outil sur le fichier d'image D3D approprié, puis sélectionnez l'option distances de mesure. Mesurez les distances en sélectionnant les points de départ et d'extrémité sur le fichier d'image désiré à l'aide de la souris par clics gauches. REMARQUE : Il est préférable de zoomer sur l'image pendant la quantification de la taille de la cellule.</li>
		<li>Pour la quantification du signal de fluorescence, utilisez l'option inspecteur de données sous l'onglet outil sur le fichier d'image D3D approprié. REMARQUE : Il est préférable de zoomer sur l'image et d'avoir uniquement des filtres pertinents sélectionnés lors de la réalisation de la quantification du signal de fluorescence.</li>
		<li>Pour quantifier le signal de fluorescence, dessinez une boîte avec une option colonne/ligne fixée à une dimension spécifique. Sélectionnez une zone avec signal à quantifier et enregistrez la valeur. Mesurez le signal d'arrière-plan en utilisant la même boîte de taille pour sélectionner une zone immédiatement à l'extérieur des cellules. Soustrayez la valeur de fond de la valeur enregistrée du signal de fluorescence obtenu dans la cellule.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Coltharp, C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+for+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy for microbiology.</a> Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).</li>
<li>Holden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanistic+principles+of+bacterial+cell+division+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).</li>
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<li>Eswara, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+Staphylococcus+aureus+cell+division+protein+directly+regulates+FtsZ+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Haeusser, D. P., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splitsville%3A+structural+and+functional+insights+into+the+dynamic+bacterial+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).</li>
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<li>Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+discovery+and+development+of+antibacterial+agents+targeting+the+cell-division+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).</li>
<li>Brzozowski, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Role+of+a+SLOG+Superfamily+Protein+YpsA+in+Gram-Positive+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 623(2019).</li>
<li>Elsen, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+the+cell-division+inhibitor+PC190723%3A+modulation+of+FtsZ+assembly+cooperativity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).</li>
<li>Haydon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li>
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<li>Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+cell+signaling+using+genetically+encoded+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Journal%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).</li>
<li>Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Microscopy+Reveals+That+Levels+of+Cyclic+di-GMP+Vary+among+Bacillus+subtilis+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations.</a> Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).</li>
<li>Schneider, J. P., Basler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+biology+of+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shedding light on biology of bacterial cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).</li>
<li>Yao, Z., Carballido-Lopez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+for+bacterial+cell+biology%3A+from+localization+to+dynamics%2C+from+ensembles+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules.</a> Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+for+quantification+of+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria.</a> BioMed Central Microbiology. 15, 255(2015).</li>
<li>Ursell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((precise+quantification+of+bacterial+cellular+dimensions+across+a+genomic-scale+knockout+library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Biology%22%5BJournal%5D)">precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library.</a> BioMed Central Biology. 15 (1), 17(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La microscopie est restée un pilier dans les études relatives aux organismes microbiens. Compte tenu de la taille des cellules à l'échelle du micron, les études sur le niveau d'une seule cellule ont traditionnellement été utilisées sur la microscopie électronique (EM). Bien que l'EM soit devenue une technique assez puissante ces dernières années, elle a ses propres limites intrinsèques en plus de l'accès limité des utilisateurs16. Les améliorations apportées aux techniques de microscopie à fluores...

Le domaine de la biologie cellulaire bactérienne a été considérablement amélioré par les progrès récents dans les techniques de microscopie1,2. Entre autres instruments, les microscopes capables de mener des expériences de microscopie à fluorescence en timelapse demeurent un outil précieux. Les chercheurs peuvent surveiller divers événements physiologiques en temps réel à l'aide de protéines fluorescentes telles que les fusions transcriptionnelle et translationnelle de la protéine fluorescente verte (GFP), les acides fluorescents D-amino (FDAA)3, ou utiliser d'autres taches pour étiqueter la paroi cellulaire, la membrane et l'ADN. Il n'est donc pas surprenant que la microscopie par fluorescence demeure populaire chez les biologistes des cellules microbiennes. En plus de simplement montrer les phénotypes finaux, fournir des informations sur la façon dont les phénotypes observés surgissent à l'aide de la microscopie timelapse pourrait ajouter une valeur significative aux résultats et potentiellement offrir des indices quant à ce que les processus cellulaires sont ciblés par les candidats médicaments potentiels4.
Les protocoles d'imagerie à haute résolution à l'aide d'un microscope à fluorescence entièrement motorisé, inversé et à large champ (voir le Tableau des matériaux)sont fournis dans cet article. Ces protocoles pourraient être adaptés aux besoins d'autres microscopes à fluorescence capables de procéder à une microscopie en timelapse. Bien que le logiciel discuté ici corresponde au logiciel fourni par le fabricant spécifique comme indiqué dans le tableau des matériaux, logiciel couramment fourni par d'autres fabricants de microscope ou le libre disponible ImageJ5, ont des outils équivalents pour analyser les données de microscopie. Pour les conditions où le timelapse n'est pas propice, des expériences de cours dans le temps pourraient être menées comme décrit dans cet article. Les protocoles décrits ici fournissent un guide détaillé pour étudier les changements phénotypiques chez deux espèces bactériennes différentes : B. subtilis et S. aureus. Voir tableau 1 pour les souches utilisées.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-100</td><td>Biologie moléculaire Qualité - Low EEO</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>Plat à fond en verre</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1755-10</td><td>Sans</td></tr> <tr>dioxane<td>Microscope</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite</td><td>Customized Olympus IX-71 Support de microscope inversé ; Tour d’éclairage personnalisée et module d’éclairage à lumière transmise. Objectifs : PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm) ; HUILE OLY 100X (N.A. 1,4, WD 0,12 mm) ; Prisme DIC Nomarski pour objectif 100X ; Appareil photo CoolSnap HQ2 ; Assemblage SSI 7 couleurs ; Chambre de contrôle de l’environnement - opaque.</td></tr><tr><td>PC190723</td><td>MilliporeSigma</td><td>3445805MG</td><td>Inhibiteur de FtsZ</td></tr><tr><td>SoftWorx</td><td>GE</td><td></td><td>Logiciel d’imagerie fourni par le fabricant</td></tr></tbody></table>

microscopie de fluorescence à cellules vivantes pour étudier la localisation des protéines subcellulaires et les changements de morphologie cellulaire chez les bactéries

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Les études des facteurs influençant la division cellulaire et la forme cellulaire chez les bactéries sont couramment effectuées en conjonction avec la microscopie à haute résolution de fluorescence, car les observations faites au niveau de la population peuvent ne pas vraiment refléter ce qui se produit à un seul niveau cellulaire. La microscopie en accéléré en cellule vive permet aux chercheurs de surveiller les changements dans la division cellulaire ou la morphologie cellulaire qui fournissent des informations précieuses sur la localisation subcellulaire des protéines et le moment de l'expression des gènes, comme il arrive, pour potentiellement aider à répondre à d'importantes questions biologiques. Ici, nous décrivons notre protocole pour surveiller les changements phénotypiques dans Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus utilisant un microscope de deconvolution à haute résolution. L'objectif de ce rapport est de fournir un protocole simple et clair qui peut être adopté par d'autres chercheurs intéressés à mener des expériences de microscopie à fluorescence pour étudier différents processus biologiques chez les bactéries ainsi que d'autres organismes.

Phénotypes GpsB Précédemment nous avons montré que Sa-GpsB est une protéine essentielle comme épuisement du GpsB utilisant un ARN antisens a comme conséquence la lyse cellulaire9. Ici nous décrivons comment l'émergence de divers phénotypes de division cellulaire et des changements dans la localisation de protéine pourraient être capturés utilisant le protocole de microscopie de timelapse décrit dans cet article. À cette fin, S. aureus souches RB143 [SH1000 hébergeant p...

Cet article fournit un guide étape par étape pour étudier la dynamique de localisation sous-cellulaire des protéines et pour surveiller les changements morphologiques à l'aide de la microscopie à haute résolution de fluorescence dans Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus.

Microscopie de fluorescence à cellules vivantes pour étudier la localisation des protéines subcellulaires et les changements de morphologie cellulaire chez les bactéries

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Ce protocole facilite l’observation directe de divers changements phénotypiques à un niveau unicellique et permet la surveillance continue de la localisation des protéines et du moment de l’expression des gènes. Le principal avantage de la microscopie par fluorescence est qu’il s’agit d’une méthode simple pour surveiller divers processus biologiques, tels que la division cellulaire et les changements de morphologie cellulaire dans les cellules vivantes. Assurez-vous d’accorder une attention particulière au protocole de préparation de l’échantillon et d’explorer le logiciel microscope pour être en mesure de localiser les paramètres et les options énumérés dans ce protocole.Une représentation visuelle de ce protocole est essentielle car il permet aux utilisateurs de regarder et d’apprendre les étapes significatives de la technique comme ils ont mis en place leurs propres expériences. Commencez par étiqueter un aliquot de cinq à 50 microlitres de la culture cellulaire d’intérêt avec un colorant de colorant à coloration membranaire approprié et en ajoutant cinq microlitres des cellules bactériennes tachées sur un glissement de couverture sur le fond d’un plat de culture de fond de verre de 35 millilitres. Placez une dalle d’agarose de 11 millimètres de diamètre sur l’échantillon et appuyez doucement pour vous assurer que la dalle est plate contre le glissement du couvercle.Ajouter ensuite environ cinq microlitres d’eau autour du glissement du couvercle pour empêcher le tampon agarose de sécher et permettre au plat de culture d’équilibrer à la température à l’intérieur de la chambre d’incubation d’un microscope à déconvolution haute résolution pendant 15 à 20 minutes. Pour l’image de l’échantillon, utilisez le bouton de mise au point d’ajustement grossier pour vous assurer que l’objectif est complètement abaissé avant d’initialiser le microscope dans le logiciel de microscope. Placez une goutte d’huile d’index réfractive de 1.517 dans l’objectif d’immersion d’huile 100x, et transférez le plat de fond en verre contenant l’échantillon dans le cercueil de logement en métal.Faites glisser doucement le plat dans la pince de scène, et utilisez le bouton de réglage grossier pour augmenter l’objectif jusqu’à ce que l’huile entre en contact avec le fond de verre du plat. Utilisez l’oculaire et le bouton de réglage fin pour mettre l’échantillon au point, et passer en mode caméra. Dans le logiciel d’imagerie de la fenêtre Resolve 3D, sélectionnez l’icône Design/Run Experiment.Une nouvelle boîte de dialogue s’intitulera Design/Run Experiment. Ouvrez les onglets Conception et Sectioning dans la boîte de dialogue pour définir le nombre de piles Z et l’épaisseur de l’échantillon. Pour mesurer l’épaisseur des cellules de l’échantillon, ajustez progressivement le plan Z à l’aide des flèches de haut en bas de la boîte de dialogue Resolve 3D, ce qui rend l’endroit où les cellules sont hors de discussion comme limites supérieures et inférieures pour l’acquisition d’image.Après avoir ajusté la transmission en pourcentage de l’intensité lumineuse et la durée de l’exposition pour les différents canaux sélectionnés dans la boîte de dialogue Resolve 3D, cliquez sur Liste de points pour ouvrir la liste des points. Dans les onglets Conception et Time Lapse, sélectionnez la case à cocher Time Lapse et entrez les paramètres de laps de temps. Sélectionnez l’option liste point de visite et entrez les points à imager dans la boîte de texte, en séparant les points par virgules ou traits d’union pour des séquences complètes.Modifiez ensuite les noms de fichiers et les emplacements de fichiers dans l’onglet Exécuter et sélectionnez Jouer dans la boîte de dialogue Begin Experiment pour démarrer l’expérience. À la fin de l’analyse, ouvrez les fichiers d’images RAW d’intérêt dans un programme de déconvolution approprié, et sélectionnez l’onglet Processus et Deconvolve. Effectuez n’importe quelle soustraction manuelle de bruit de fond et réglage de contraste de luminosité dans n’importe quel ou tous les canaux de longueur d’onde si nécessaire avant d’enregistrer l’image comme un fichier TIFF.Pour la quantification de la longueur cellulaire, ouvrez les fichiers d’images décontvolutés du fabricant fourni par logiciel ou dans des logiciels d’imagerie libres, tels que ImageJ, et ouvrez l’onglet Outil. Sélectionnez ensuite mesurer les distances et cliquez à gauche sur les points de départ et de fin du fichier d’image désiré pour mesurer la longueur de la cellule. Pour la quantification des signaux fluorescents, sélectionnez Inspecteur des données.Dessinez une case avec l’option Colonne/Ligne définie à la dimension spécifique d’intérêt, et sélectionnez la zone avec le signal à quantifier. L’ajout de xylose pour induire une souche GGS 8 entraîne un phénotype à six cellules. Alors que les commandes vectorielles vides semblent similaires aux cellules témoins cultivées en l’absence d’inducteur.La surproduction de staphylocoque aureus GPSB perturbe la division cellulaire en B.subtilis telle que mesurée par la microscopie time lapse et la quantification de la longueur cellulaire. En outre, les modèles de localisation de FtsZ ou l’une des protéines associées à cette protéine peuvent être utilisés par un journaliste pour étudier et/ou identifier de nouveaux composés antimicrobiens grâce à l’imagerie par manque de temps et à la quantification de la longueur cellulaire. Assurez-vous d’utiliser une huile avec l’index réfractif approprié car l’indice réfractif peut changer en fonction de la température utilisée pour l’imagerie.La déconvolution peut être effectuée si l’utilisateur souhaite supprimer le bruit hors foyer, et l’analyse des données impliquant la quantification du signal fluorescent et les mesures de longueur et de largeur des cellules peut également être effectuée.

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Ici nous démontrons les protocoles pour effectuer une seule molécule de microscopie par fluorescence sur des cellules vivantes pour permettre aux bactéries fonctionnelles complexes moléculaires à détecter, suivre et quantifiés.

Visualisation simple complexes moléculaires In Vivo Utilisation avancée de microscopie par fluorescence

Ce protocole prévoit une procédure étape par étape pour surveiller le comportement seule cellule de bactéries différentes dans le temps en utilisant la fluorescence automatisée de microscopie time-lapse. En outre, nous fournir des lignes directrices comment analyser les images de microscopie.

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Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Biofilms microbiens sont généralement constitués par des sous-populations distinctes de cellules spécialisées. Analyse unicellulaire de ces sous-populations nécessite l'utilisation de reporters fluorescents. Nous décrivons ici un protocole de visualiser et de contrôler plusieurs...

Analyse unicellulaire des<emBacillus subtilis> Les biofilms par microscopie à fluorescence et cytométrie de flux

Source : Brzozowski, R. S. et al. Microscopie à fluorescence à cellules vivantes pour étudier la localisation des protéines subcellulaires et les changements morphologiques cellulaires chez les bactéries. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre la microscopie à fluorescence à cellules vivantes pour visualiser les changements morphologiques en temps réel chez les bactéries. Il décrit les étapes impliquées dans l’imagerie, l’acquisition en accéléré et la déconvolution pour obtenir des images...

Imagerie des changements morphologiques chez les bactéries à l’aide de la microscopie à fluorescence à cellules vivantes

La vidéo décrit la technique d’imagerie FLIM-FRET pour déterminer l’interaction protéine-protéine dans des bactéries vivantes exprimant des protéines cytoplasmiques marquées avec des protéines fluorescentes, un eGFP donneur et un accepteur mCherry. La technique combinée permet également de quantifier les protéines en interaction.

Imagerie FLIM-FRET pour la caractérisation des interactions protéine-protéine chez les bactéries vivantes

Un procédé basé sur des protéines fluorescentes de cellules vivantes pour éclairer des vacuoles cellulaires (inclusions) contenant Chlamydia est décrit. Cette stratégie permet une détermination rapide et automatisée de l’infectiosité de Chlamydia dans les échantillons et peut être utilisée pour étudier quantitativement la dynamique de croissance des inclusions.

Utilisation de protéines fluorescentes de visualiser et de quantifier<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole la dynamique de croissance dans les cellules vivantes

Les études de biomolécules in vivo sont cruciales pour comprendre la fonction moléculaire dans un contexte biologique. Nous décrivons ici une nouvelle méthode permettant l’internalisation de biomolécules fluorescentes, telles que l’ADN ou les protéines, dans des micro-organismes vivants. L’analyse des données in vivo enregistrées par microscopie à fluorescence est également présentée et discutée.

Internalisation et l&#39;Observation des Biomolécules Fluorescent In Living micro-organismes par électroporation

Comprendre la fonction des processus essentiels chez les bactéries est difficile. Microscopie à fluorescence avec des colorants spécifiques à la cible peut éclairer clé dans la progression de la croissance et cycle cellulaire des cellules microbiennes. Ici, Agrobacterium tumefaciens est utilisé comme une bactérie modèle pour mettre en évidence les méthodes d’imagerie de cellules vivantes pour la caractérisation des processus essentiels.

Vivre la microscopie de Fluorescence cellulaire afin d’observer les processus essentiels au cours de la croissance des cellules microbiennes

Les cellules bactériennes sont spatialement organisées. Pour suivre cet organisme au fil du temps dans des cellules de Myxococcus xanthus croissantes lentes, un set-up pour l’imagerie de cellules vivantes de fluorescence à haute résolution spatio-temporelle sur plusieurs générations a été développé. En utilisant cette méthode, la dynamique spatio-temporelle des protéines importantes pour la ségrégation des chromosomes et division cellulaire peut être déterminée.

Imagerie de cellules vivantes de fluorescence de Cell Cycle végétatif complet de la lente croissance sociale bactérie Myxococcus xanthus

Ce protocole d’imagerie cellulaire bactérienne vivante permet de visualiser les interactions entre plusieurs espèces bactériennes au niveau unicellulaire au fil du temps. L’imagerie par time-lapse permet d’observer chaque espèce bactérienne en monoculture ou en coculture afin d’interroger les interactions inter-espèces dans les communautés bactériennes multi-espèces, y compris la motilité cellulaire individuelle et la viabilité.

Visualisation cinétique des interactions bactériennes interspécifiqueuses unicellulaires

Découvrez la microscopie à fluorescence pour étudier la localisation des protéines et les changements morphologiques chez Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus. Cette méthode permet l'observation directe des processus cellulaires en temps réel.

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Microscopie de fluorescence à cellules vivantes pour étudier la localisation des protéines subcellulaires et les changements de morphologie cellulaire chez les bactéries

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