Name: In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction (en) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Découvrez un test in vitro pour étudier l'interaction entre cellules tumorales et macrophages. Cette méthode évalue l'attraction des macrophages par le milieu conditionné tumoral et facilite le développement de traitements personnalisés contre le cancer.

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Soutien aux subventions : Z. An a reçu le soutien d'Alex's Lemonade Stand Foundation, de l'American Brain Tumor Association, du NIH T32CA108462 et du Program for Breakthrough Biomedical Research, qui est partiellement financé par la Sandler Foundation. W. Weiss a reçu l'appui des subventions des NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; la Samuel G. Waxman Cancer Research Foundation; et la chaise Evelyn et Mattie Anderson.

1. Préparation moyenne
<ol><li>
Préparation du milieu des cellules souches sans sérum
	<ol>
<li>Décongelez le supplément de 50x B27, le facteur de croissance épidermique (EGF, 20 g/mL en acide acétique de 10 mM avec 0,1 % de BSA) et le facteur de croissance du fibroblaste (FGF, 20 g/mL dans 10 mM d'acide acétique avec 0,1 % de BSA).</li>
		<li>Ajouter 500 oL d'EGF (concentration finale 20 ng/mL), 500 oL de FGF (concentration finale 20 ng/mL), 10 ml de 50x B27 à 500 mL de Mélange d'aigle modifié/nutritif F-12 (DMEM/F12) et 5 mL de 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Inverser la bouteille 4-6 fois pour mélanger, filtrer la stérilisation à travers une tasse de filtration de 500 ml 0,1 m. Marquer la bouteille et l'entreposer à 4 oC. REMARQUE: Le milieu est bon à utiliser jusqu'à un mois à 4 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer le milieu de culture MV-4-11 : Ajouter 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS) à 500 ml du moyen dudulbecco modifié d'Iscove (IMDM). Inverser la bouteille 4-6 fois pour mélanger, filtrer la stérilisation à travers une tasse de filtration de 500 ml 0,1 m. Marquer la bouteille et l'entreposer à 4 oC. REMARQUE: Le milieu est bon à utiliser jusqu'à un mois à 4 oC.</li>
	<li>Préparer le milieu d'entretien des cellules tumorales : Ajouter 50 ml de FBS à 500 ml du milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco. Inverser la bouteille 4-6 fois pour mélanger, filtrer la stérilisation à travers une tasse de filtration de 500 ml 0,1 m. Marquer la bouteille et l'entreposer à 4 oC. REMARQUE: Le milieu est bon à utiliser jusqu'à un mois à 4 oC.</li>
</ol>2. Préparation cellulaire
Jour 1:
<ol><li>Décongélation des cellules tumorales</li>
	<li>Réchauffez le milieu d'entretien des cellules tumorales (tel que décrit à l'étape 1.3) à un bain d'eau de 37 oC pendant 20 min.</li>
	<li>Prenez les cellules congelées U87, U87:EGFR, U87:EGFRvIII et U87:EGFR-EGFRvIII du réservoir d'azote liquide. Décongeler les cellules du bain d'eau de 37 oC pendant 2 min. CAUTION: Soyez prudent lorsque vous prenez les cellules du réservoir d'azote liquide. Portez des gants avec protection thermique et lunettes de sécurité au besoin.</li>
	<li>Vaporiser la surface du capuchon de culture tissulaire avec 70 % d'éthanol et essuyer 70 % d'éthanol à la surface avec du papier essuie-tout.</li>
	<li>Vaporiser les flacons cryogéniques contenant des cellules et la bouteille moyenne avec 70% d'éthanol, essuyer 70% d'éthanol sur la surface avec des essuie-tout, et les amener dans le capot de culture de tissu.</li>
	<li>Pipette 5 ml de support d'entretien de cellules de tumeur dans un tube stérile de centrifugeuse de 15 ml. Inverser le tube contenant des cellules tumorales 4-6 fois à mélanger. Pipette toutes les cellules dans le tube centrifugeur de 15 ml. Inverser le tube de centrifugeuse 4-6 fois pour mélanger.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant.</li>
	<li>Laver les cellules avec 10 ml de phosphate tamponné salin (PBS). Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant.</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans 12 ml du milieu d'entretien de cellules de tumeur (comme décrit dans l'étape 1.3). Pipette de haut en bas 3-5 fois pour mélanger. Transférer les cellules dans un flacon de culture cellulaire T75.</li>
	<li>Cultivez les cellules dans un incubateur de37 oC avec 5 % de CO 2. Remettre le milieu d'entretien des cellules tumorales au réfrigérateur à 4 oC.</li>
</ol>Jour 2:
<ol start="2"><li>Vérifiez les cellules sous le microscope. Changer le support si nécessaire. Les cellules doivent se développer dans un monocouche dans la culture.</li>
</ol>Jour 3:
<ol start="3"><li>Décongélation des cellules MV-4-11
	<ol>
<li>Réchauffez le milieu de culture MV-4-11 (tel que décrit à l'étape 1.2) à un bain d'eau de 37 oC pendant 20 min. REMARQUE: MV-4-11 peut être changé en macrophages primaires ou d'autres lignées de cellules macrophages, selon le besoin de l'étude spécifique.</li>
		<li>Retirez les cellules MV-4-11 congelées du réservoir d'azote liquide. Décongeler les cellules à un bain d'eau de 37 oC pendant 2 min. MISE EN GARDE: Soyez prudent lorsque vous prenez les cellules du réservoir d'azote liquide. Portez des gants avec protection thermique et lunettes de sécurité au besoin.</li>
		<li>Vaporiser la surface du capuchon de culture tissulaire avec 70 % d'éthanol et essuyer 70 % d'éthanol à la surface avec du papier essuie-tout.</li>
		<li>Vaporiser les flacons cryogéniques contenant des cellules et la bouteille moyenne avec 70% d'éthanol, essuyer 70% d'éthanol sur la surface avec des essuie-tout, et les amener dans le capot de culture de tissu.</li>
		<li>Pipette 5 mL de milieu de culture MV-4-11 (tel que décrit à l'étape 1.2) dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ml. Inverser le tube contenant des cellules tumorales 4-6 fois à mélanger. Pipette toutes les cellules dans le tube centrifugeur de 15 ml. Inverser le tube de centrifugeuse 4-6 fois pour mélanger.</li>
		<li>Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant.</li>
		<li>Laver les cellules dans 10 ml de PBS et centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant.</li>
		<li>Resuspendre les cellules dans 12 ml de mv-4-11 milieu de culture (comme décrit à l'étape 1.2). Pipette doucement de haut en bas 3-5 fois pour mélanger. Transférer les cellules dans un flacon de culture cellulaire T75.</li>
		<li>Cultivez les cellules dans un incubateur de37 oC avec 5 % de CO 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Fractionnement des cellules tumorales
	<ol>
<li>Réchauffez le milieu des cellules souches sans sérum (tel que décrit à l'étape 1.1) dans un bain d'eau de 37 oC pendant 20 min.</li>
		<li>Vaporiser la surface du capuchon de culture tissulaire avec 70 % d'éthanol et essuyer 70 % d'éthanol à la surface avec du papier essuie-tout. Retirez la solution de détachement cellulaire du réfrigérateur. Vaporiser les bouteilles de solution de détachement moyen et cellulaire avec 70 % d'éthanol, essuyer 70 % d'éthanol à la surface avec du papier essuie-tout et les amener dans le capuchon de culture tissulaire. REMARQUE: Ne pas réchauffer la solution de détachement cellulaire accutase.</li>
		<li>Transférer la culture des cellules tumorales de l'incubateur dans le capot de culture tissulaire. Aspirer le milieu, ajouter 2 ml de solution de détachement cellulaire dans le flacon. REMARQUE: Le rinçant avec PBS avant d'ajouter accutase est facultatif ici.</li>
		<li>Mettre le flacon dans le capot. Vérifiez si les cellules tumorales arrondissnt chaque minute. Une fois les cellules tumorales arrondies, appuyez doucement sur le côté du flacon pour aider les cellules à se détacher du flacon.</li>
		<li>Pipette 8 ml de milieu de cellules souches sans sérum dans le flacon, pipette de haut en bas 3 fois pour mélanger, et transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ml. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant.</li>
		<li>Laver les cellules dans 10 ml de PBS. Pipette de haut en bas 3-5 fois pour mélanger. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant. REMARQUE: Cette étape est facultative.</li>
		<li>Resuspendre les cellules dans 10 ml de milieu de cellules souches sans sérum (comme décrit à l'étape 1.1). Pipette de haut en bas 3-5 fois pour mélanger. Prendre 10 l des cellules et mélanger avec 10 l de solution Trypan Blue. Pipette 10 l du mélange dans la glissière de comptage, quantifier le numéro de cellule vivante à l'aide d'un compteur cellulaire automatique.</li>
		<li>Ajuster la densité cellulaire à 2,5 x 105 cellules/mL avec un milieu de cellules souches sans sérum (tel que décrit à l'étape 1.1), et seed 2 ml des cellules dans chaque puits d'une plaque de 6 puits de culture cellulaire. Pour chaque type de cellules, les graines 3 puits (échantillon de triplicate). En même temps, préparer 6 puits avec 2 ml de milieu de cellules souches sans sérum seulement (pas de cellules). REMARQUE: Ces échantillons seront utilisés : 1) comme contrôles négatifs et 2) pour ajuster le volume moyen conditionné en fonction du nombre de cellules.</li>
		<li>Mettre les plaques de 6 puits dans un incubateurde 37 oC avec 5 % de CO 2. Laisser les cellules se développer pendant 24 h.</li>
	</ol></li>
</ol>3. In Vitro Macrophage Attraction Assay
<ol><li>Préparation des supports conditionnés
	<ol>
<li>Réchauffez le milieu d'entretien des cellules tumorales (tel que décrit à l'étape 1.3) à un bain d'eau de 37 oC pendant 20 min.</li>
		<li>Vaporiser la surface du capuchon de culture tissulaire avec 70 % d'éthanol et essuyer 70 % d'éthanol à la surface avec du papier essuie-tout. Retirez la solution de détachement cellulaire du réfrigérateur. Vaporiser les bouteilles du milieu et de la solution de détachement cellulaire avec 70% d'éthanol, essuyer 70% d'éthanol sur la surface avec des essuie-tout et les amener dans le capot de culture tissulaire.</li>
		<li>Sortez les plaques de 6 puits de l'incubateur. Soigneusement pipette le support conditionné dans 15 ml de tubes de centrifugeuse stériles. Mettez les tubes sur la glace. Pipette les médias dans le "média seulement" bien dans un tube de centrifugeuse stérile séparée de 15 ml. REMARQUE: Avant cette étape, assurez-vous de vérifier sous le microscope pour voir si les cellules se fixent. Si ce n'est pas le cas, on peut utiliser des plaques enduites à l'étape 2.4.8 pour permettre une meilleure fixation ou inclure les cellules flottantes dans l'étape de comptage.</li>
		<li>Ajouter 0,5 ml de solution de détachement cellulaire dans chaque puits de la plaque de 6 puits. Vérifiez si les cellules tumorales arrondissnt chaque minute. Une fois les cellules tumorales arrondies, appuyez doucement sur le côté de la plaque pour aider les cellules à se détacher.</li>
		<li>Pipette 2,5 ml de milieu d'entretien des cellules tumorales dans le puits, pipette de haut en bas 3 fois pour mélanger et transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ml. Prendre 10 l des cellules et mélanger avec 10 l de solution Trypan Blue. Pipette 10 l du mélange dans la glissière de comptage et quantifier le nombre de cellules vivantes à l'aide d'un compteur cellulaire automatique.</li>
		<li>Ajuster le volume du milieu conditionné en fonction du numéro de cellule à l'aide du milieu de cellules souches sans sérum (incubation de 37 oC pendant la nuit). Par exemple, si Well A a 3x autant de cellules vivantes que le puits avec le moins de cellules, diluer son support conditionné 1:3. Cette étape est utilisée pour contrôler la différence causée par le taux de prolifération cellulaire. REMARQUE: La raison d'utiliser le milieu de cellules souches sans sérum avec une incubation de 37 oC pendant la nuit est de contrôler le changement possible dans les milieux avec une exposition prolongée de 37 oC.</li>
		<li>Filtrer le support conditionné à travers des filtres de 0,45 m. Mettez les supports conditionnés sur la glace. REMARQUE: Cette étape élimine les cellules et les débris cellulaires dans le support conditionné.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation des cellules MV-4-11
	<ol>
<li>Réchauffez le milieu IMDM (sans FBS) à un bain d'eau de 37 oC pendant 20 min.</li>
		<li>Vaporiser la surface du capuchon de culture tissulaire avec 70 % d'éthanol et essuyer 70 % d'éthanol à la surface avec du papier essuie-tout. Vaporiser la bouteille moyenne avec 70% d'éthanol, essuyer 70% d'éthanol sur la surface avec des essuie-tout et les apporter dans le capot de culture de tissu.</li>
		<li>Prenez le flacon de cellules MV-4-11 dans le capot de culture de tissu. Pipette 10 ml de cellules dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ml. Prendre 10 l de cellules et mélanger avec 10 l de solution Trypan Blue. Pipette 10 l du mélange dans la glissière de comptage et quantifier le nombre de cellules vivantes à l'aide d'un compteur cellulaire automatique. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5min à 4 oC. Aspirez le supernatant.</li>
		<li>Laver les cellules avec 10 ml de PBS et centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant.</li>
		<li>Resuspendre les cellules dans le milieu IMDM (sans FBS) pour une densité cellulaire finale de 1x106 cellules/mL. REMARQUE: Le nombre de cellules de macrophages utilisés ici peut être ajusté.</li>
	</ol></li>
	<li>Transwell d'assay REMARQUE: Pour cette étape, utilisez un kit d'assiducellulaire ou achetez les réactifs et insérez séparément. Pour les cellules MV-4-11, choisissez des inserts Transwell de taille de 5 pores. Pour détecter la migration des macrophages, quantifier directement le nombre de macrophages dans la chambre basse ou utiliser des méthodes colorimétriques/fluormétriques. Ici, nous démontrons l'assay en utilisant la méthode coloriométrique.<ol>
<li>Porter la plaque de 24 puits, l'insert et les réactifs à la température ambiante.</li>
		<li>Ajouter 250 l de cellules MV-4-11 préparées ci-dessus dans chaque insert.</li>
		<li>Ajouter 400 ll de milieu/moyen conditionné seulement (avec une incubation de nuit à 37 oC, ces échantillons servent de contrôle négatif) aux chambres inférieures de la plaque de 24 puits. Pour chaque ligne ou contrôle tumoral, utilisez des échantillons de triplicate. Évitez les bulles entre l'insert et le milieu conditionné. Les bulles empêcheront les macrophages de migrer vers les puits inférieurs.</li>
		<li>Incuber les plaques dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 pendant 4 h. REMARQUE: Le temps d'incubation peut être ajusté. Les cellules qui migrent dans les chambres inférieures peuvent être vues sous le microscope.</li>
		<li>Appuyez doucement sur l'insert sur la paroi intérieure du même puits et jetez l'insert. Comme les cellules MV-4-11 se développent en suspension, la solution de détachement cellulaire ou le traitement de trypsine n'est pas nécessaire ici.</li>
		<li>Doucement pipette les cellules dans les puits de haut en bas 3 fois pour mélanger. Transférer 225 l de suspension cellulaire sur une plaque de 96 puits à parois noires adaptée à la mesure fluorescente.</li>
		<li>Diluer le colorant CyQuant 1:75 avec un tampon de lyse 4x. Vortex brièvement et tourner vers le bas la solution. Ajouter 75 ll de solution à chaque puits de la plaque de 96 puits. Incuber 15 min à température ambiante.</li>
		<li>Lisez la fluorescence à l'aide du filtre 480/520 nm avec un lecteur de plaque de fluorescence.</li>
		<li>Analyser les données en soustrayant le blanc et la normalisation à la ligne de cellules tumorales de contrôle.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liu, Y., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+function+of+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origin and function of tumor-associated macrophages.</a> Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).</li>
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<li>Tsukamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Blockade+of+IL6+and+PD-1%2FPD-L1+Signaling+Abrogates+Mutual+Regulation+of+Their+Immunosuppressive+Effects+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combined Blockade of IL6 and PD-1/PD-L1 Signaling Abrogates Mutual Regulation of Their Immunosuppressive Effects in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 78 (17), 5011-5022 (2018).</li>
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</ol>

William A. Weiss est cofondateur de StemSynergy Therapeutics. Zhenyi An n'a rien à révéler.

Dans ce protocole, il y a plusieurs étapes clés : 1) sélection de l'insert Transwell. Pour la lignée cellulaire MV-4-11, les inserts Transwell de 5 m fonctionnent bien. Cependant, pour d'autres lignées cellulaires telles que la lignée cellulaire de monocytes THP-1 couramment utilisée, une taille de pores différente pourrait mieux fonctionner. 2) Comme différentes lignées cellulaires se développent à des vitesses différentes, il est important d'ajuster le volume des supports conditionnés en fonction du nombre de cellules....

Les macrophages sont des cellules immunitaires à haute hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle1. Ils jouent des rôles importants dans les systèmes de défense hôte, la réparation des tissus, le développement et la progression tumorale1. Les TAM sont des macrophages dans le microenvironnement des tumeurs solides. Certains TAMs peuvent favoriser la croissance de tumeur en inhibant l'activité cytotoxique T cellule-négociée, modulant le microenvironnement de tumeur (TME), favorisant l'angiogenèse, l'invasion et la métastasie2,3,4, 5. Les TAMsont parmi les types de cellules les plus abondants dans le TME et lenombre plus élevé de TAMs est généralement corrélé avec la survie plus mauvaise patiente dans beaucoup de types de tumeurs pleines 6. Les signatures génétiques distinctes des cellules tumorales affectent leur capacité à recruter des macrophages. Dans GBM, une tumeur cérébrale agressive sans traitement, les macrophages peuvent représenter jusqu'à la moitié de la masse tumorale7. La co-amplification du récepteur épidermique de facteur de croissance (EGFR) et de son EGFRvIII mutant de truncation est fréquemment observée dans GBM, qui confère des avantages de croissance de tumeur8. Les cellules co-exprimant EGFR et EGFRvIII attirent plus de macrophages que les cellules exprimant EGFR ou EGFRvIII individuellement7.
Chemokines sont une famille de petites cytokines qui jouent un rôle important dans la régulation de la composition immunitaire dans le TME6,9. Les cellules humaines expriment plus de 50 cytokines10. L'infiltration immunitaire dans les tumeurs est largement réalisée par l'interaction entre les cytokines et les récepteurs cytokine11. Chaque type de cellules immunitaires exprime des récepteurs chimiokine distincts/chemokines et peut être recruté par des cellules sécrétant des chimiokines spécifiques/récepteurs de chimiokine12. Les cellules cancéreuses peuvent augmenter l'expression de certaines chimiocines pour recruter des cellules immunitaires telles que les TAM, les lymphocytes T régulateurs et les cellules suppressrices dérivées du myéloïde (MDSC)6. Le blocus de la chimiokine spécifique sécrétée par les tumeurs peut être un moyen prometteur en inhibant l'infiltration des cellules immunitaires dans la masse tumorale.
Ici, nous décrivons un protocole qui permet l'évaluation in vitro de l'interaction tumeur-macrophage, utilisant les médias conditionnés des cellules de tumeur contenant des chemokines et des lignées de cellules de macrophage.

<table><tbody><tr><td>0,1 &mu ; m tasse de filtration</td><td>Thermo fisher</td><td>566-0010</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu ; Unité de filtration</td><td>m Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques de 10 mL</td><td>Olympus plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger stériles de 15 mL</td><td>Olympus plastics</td><td>28-103</td><td></td></tr><tr><td>Pointe de pipette de 1 mL</td><td>Bioproduits moléculaires ART</td><td>2779-RI</td><td></td></tr><tr><td>Pipette d’aspiration de 2 mL</td><td>Falcon</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>plaque à 24 puits</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Partie de l’ECM507, ou peut être acheté séparément</td></tr><tr><td>4x tampon de lyse</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Partie de l’ECM507, ou peut être acheté séparément</td></tr><tr><td>5 &mu ; m Insert Transwell</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Fait partie de l’ECM507, ou peut être acheté séparément</td></tr><tr><td>75 cm2</td> flacon <td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Innovative</td><td>cell technologies</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant Dye</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>Fait partie de l’ECM507, ou peut être acheté séparément</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM :F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Stylo Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypan bleu</td><td>Biorad</td><td>1450021</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro assay to study tumor-macrophage interaction (en)

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) représentent un grand pourcentage de cellules dans la masse tumorale pour différents types de cancers. Glioblastoma (GBM), une tumeur maligne de cerveau sans traitement, a jusqu'à la moitié de la masse tumorale TAMs. Les TAM peuvent être pro-tumoral ou anti-tumoral, selon l'activation de gènes spécifiques dans les cellules. Les mutations génétiques dans les tumeurs, par la régulation de l'expression cytokine, peuvent affecter le recrutement de TAMs au microenvironnement de tumeur. Ici, nous décrivons un essai cellulaire quantitatif pour évaluer le recrutement de macrophage par le milieu conditionné des cellules de tumeur. Cet exemple utilise la lignée cellulaire de macrophage humain MV-4-11 pour étudier l'attraction du macrophage par le milieu conditionné du glioblastome, ce qui permet une reproductibilité élevée et une faible variabilité. Les données générées avec cet analyse peuvent contribuer à une meilleure compréhension de l'interaction entre la tumeur et le microenvironnement tumoral. Des résultats similaires peuvent être utilisés pour évaluer l'interaction entre les cellules tumorales et d'autres cellules immunitaires, y compris les lymphocytes T et les cellules tueuses naturelles (NK).

Les résultats sont généralement affichés au moyen de graphiques à barres (exemple illustré à la figure 1). Des échantillons avec des valeurs élevées de 480/520 indiquent que le support conditionné a une grande capacité de recruter des macrophages. Selon les besoins expérimentaux, des contrôles supplémentaires peuvent être inclus. Par exemple, on peut utiliser des anticorps neutralisants pour traiter les médias conditionnés pour abolir la chimiotaxie macrophag...

Cet article représente un analyse in vitro utile pour évaluer la capacité du milieu conditionné des cellules de tumeur pour attirer des macrophages.

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction (en)

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Les macrophages tumeur-associés jouent des rôles importants dans le microenvironnement de tumeur. Comprendre comment différentes mutations génétiques dans les cellules tumorales affectent le recrutement de macrophages est essentielle pour concevoir un traitement personnalisé pour les patients atteints de cancer. Cet essai fournit un moyen facile et robuste d’évaluer l’interaction entre les cellules tumorales et les macrophages in vitro.Cet essai peut être modifié pour évaluer les interactions entre les cellules tumorales et d’autres cellules immunitaires in vitro. Pour commencer cette procédure, réchauffez le milieu de cellules souches sans sérum en le plaçant dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Vaporiser la surface du capot de culture tissulaire avec 70% d’éthanol et essuyer la surface pulvérisée avec des serviettes en papier.Ensuite, vaporisez les bouteilles de solution de détachement moyen et cellulaire avec 70% d’éthanol et essuyez-les avec des serviettes en papier. Transférer les bouteilles nettoyées dans le capot de culture tissulaire. Récupérer la cellule tumorale et la transférer dans le capot de culture tissulaire.Aspirer le milieu et laver les cellules avec 10 millilitres de PBS. Ajouter ensuite deux millilitres de solution de détachement cellulaire à la fiole. Placez le flacon dans le capot, en vérifiant chaque minute pour voir si les cellules tumorales se sont arrondies.Une fois que les cellules tumorales arrondir, appuyez doucement sur le côté de la fiole pour aider les cellules à se détacher. Après cela, pipette huit millilitres de milieu cellulaire sans sérum dans le flacon et pipette de haut en bas trois fois pour mélanger. Transférer cette suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et une centrifugeuse à 200 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Aspirez le surnatant. Ensuite, lavez les cellules en 10 millilitres de PBS, en s’assurant de pipette de haut en bas trois à cinq fois pour mélanger. Centrifuger les cellules à 200 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Aspirer le supernatant, et resuspendre les cellules en 10 millilitres de milieu sans sérum. Pipette de haut en bas trois à cinq fois pour mélanger. Mélangez 10 microlitres de cette suspension cellulaire avec 10 microlitres de solution Trypan Blue.Pipette suivante 10 microlitres du mélange Trypan Blue et cellulaire dans une diapositive de comptage, et utiliser un compteur de cellules automatiques pour quantifier le numéro de cellule vivante. Utilisez un milieu cellulaire sans sérum pour ajuster la densité cellulaire à 2,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre. Puis ensemencer deux millilitres des cellules dans chaque puits d’une plaque de culture de six puits.En même temps, préparez six puits avec seulement deux millilitres de milieu de cellules souches sans sérum. Après cela, incuber les plaques de six puits à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Vaporisez d’abord la surface du capot de culture tissulaire avec 70 % d’éthanol et essuyez la surface pulvérisée avec des serviettes en papier.Ensuite, vaporisez les bouteilles de solution de détachement moyen et cellulaire avec 70% d’éthanol et essuyez-les avec des serviettes en papier. Transférer les bouteilles nettoyées dans le capot de culture tissulaire. Après cela, récupérer les plaques de six puits de l’incubateur.Pipette soigneusement le média conditionné dans des tubes de centrifugeuse stériles de 15 millilitres, et placez les tubes sur la glace. Ajouter 0,5 millilitres de solution de détachement cellulaire dans chaque puits des plaques de six puits, et vérifier chaque minute si les cellules tumorales ont arrondi. Une fois que les cellules tumorales arrondir, appuyez doucement sur le côté de la plaque pour aider à détacher les cellules.Pipette suivante 2,5 millilitres de milieu d’entretien des cellules tumorales dans le puits et pipette de haut en bas trois fois pour mélanger. Transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 millilitres. Mélanger 10 microlitres de cellules avec 10 microlitres de la solution Trypan Blue, et transférer 10 microlitres de ce mélange dans la diapositive de comptage.Utilisez un compteur de cellules automatiques pour quantifier le nombre de cellules vivantes et utilisez le milieu de cellules souches sans sérum qui a été incubé à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour ajuster le volume des médias conditionnés en fonction du numéro de cellule. Filtrer le média conditionné à travers des filtres de 0,45 micromètre et placer les supports conditionnés sur la glace. Pour commencer, réchauffer le milieu IMDM dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.Nettoyez le capot de culture tissulaire avec 70% d’éthanol et nettoyez la bouteille de milieu et transportez-la dans le capot comme décrit précédemment. Ensuite, transférez la fiole des cellules MV-4-11 dans le capot. Pipette 10 millilitres de cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.Utilisez Trypan Blue et un compteur de cellules automatique pour quantifier le nombre de cellules vivantes comme décrit précédemment. Puis centrifuger les cellules à 200 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirer le supernatant et laver les cellules avec 10 millilitres de PBS.Centrifugeuse à nouveau à 200 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirer le supernatant, et resuspendre les cellules dans le milieu IMDM à une densité cellulaire finale d’un million de cellules par millilitre. Apportez d’abord les matériaux nécessaires à la température ambiante.Ajouter 250 microlitres des cellules MV-4-11 préparées à chaque insert. Ajouter ensuite 400 microlitres du milieu conditionné ou moyen seulement aux chambres inférieures de la plaque de 24 puits, en s’assurant d’ajouter les échantillons en triplicate. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant quatre heures.Puis appuyez doucement sur l’insert sur la paroi intérieure du même puits et jetez l’insert. Pipette doucement les cellules dans les puits de haut en bas trois fois pour mélanger. Transférer 225 microlitres de cette suspension cellulaire dans les puits d’une plaque à parois noires de 96 puits adaptée à la mesure fluorescente.Après cela, diluer le colorant CyQUANT avec tampon 4x lyse à un rapport de un à 75. Vortex brièvement et spin down la solution. Transférer 75 microlitres de cette solution à chaque puits de la plaque de 96 puits et incuber à température ambiante pendant 15 minutes.À l’aide d’un lecteur de plaque de fluorescence, lisez la fluorescence et analysez les données décrites dans le protocole textuel. Dans cette étude, un essai in vitro est employé pour étudier l’interaction de macrophage de tumeur. Les échantillons ayant des valeurs élevées de fluorescence indiquent que le média conditionné a une grande capacité de recruter des macrophages.Selon les besoins expérimentaux, des contrôles supplémentaires peuvent être inclus. Par exemple, on peut utiliser des anticorps neutralisants pour traiter les médias conditionnés pour abolir la chimiotaxis macrophage et effectuer de la même manière. On peut également ajouter des chimiokines supplémentaires aux médias conditionnés, qui servent de contrôle positif.Il est important de contrôler les différences de nombre de cellules pour cet essai parce que différents types de cellules peuvent se développer à des vitesses différentes. La confirmation in vivo des résultats in vitro est essentielle. On peut injecter des cellules tumorales dans les souris et analyser les tumeurs avec la cytométrie d’écoulement, l’immunostaining, et CyTOF pour confirmer les résultats.

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Dans cette vidéo, nous étudions l’interaction tumeur-macrophage à l’aide d’un test d’interaction transwell-macrophage basé sur la fluorescence. Le test implique l’analyse de la migration des macrophages par chimiotaxie induite par des produits chimiques.

Essai d’attraction des macrophages Transwell basé sur la fluorescence : une méthode in vitro pour étudier l’interaction tumeur-macrophage par chimiotaxie induite par des produits chimiques

Pour comprendre le comportement malin du cancer, il faut créer des modèles précis de la façon dont les cellules tumorales interagissent avec les composants du microenvironnement tumoral, tels que les macrophages. Ici, nous décrivons deux méthodes pour étudier l’interaction des cellules de glioblastome avec les macrophages associés aux tumeurs et la microglie où l’effet sur l’invasion du glioblastome est évalué.

Coculture Assays pour étudier macrophage et microglie Stimulation de glioblastome Invasion

L'activité phagocytique de Macrophage contre des cellules cancéreuses, spécifiquement les cellules mammaires de carcinome de souris 4T1, a été imaged dans cette étude. Le modèle de coculture des cellules vivantes a été établi et observé à l'aide d'une combinaison de microscopie fluorescente et de contraste d'interférence différentielle. Cette évaluation a été imageà l'aide d'un logiciel d'imagerie pour développer une vidéo en accéléré multipoints.

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Ici, nous présentons une méthode utilisant des supports perméables de membrane pour faciliter l'étude de la signalisation de paracrine de non-contact employée par des cellules de tumeur pour supprimer la réponse immunitaire. Le système est disposé à étudier le rôle des facteurs tumeur-sécrétés en amortissant l'activation de macrophage.

Étudier les effets des ligands paracriné sécrétés par les tumeurs sur l'activation du macrophage à l'aide de la co-culture avec des supports membranaires perméables

Ici, nous présentons un protocole pour étudier l’interaction des macrophages primaires dérivés de monocytes humains avec un sphéroïde tumoral dans une matrice tridimensionnelle (3D) de collagène I, avec la possibilité de comparer l’impact des propriétés solubles et physiques du microenvironnement sur l’invasion cellulaire.

Un test de co-invasion macrophage-tumeur sphéroïde

Étant donné le nombre limité de modèles de xénogreffes disponibles pour étudier les interactions entre les cellules CART humaines et les cellules myéloïdes, nous avons établi des modèles in vitro et in vivo pour comprendre les impacts des macrophages humains sur les cellules CART. Les résultats peuvent potentiellement être généralisés pour évaluer les rôles des macrophages dans le microenvironnement tumoral et tester des immunothérapies ciblées sur les macrophages.

Étude des interactions entre les cellules myéloïdes et les cellules CAR-T in vitro et in vivo

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’application de la rhodamine 123 pour identifier le potentiel de membrane mitochondrial (MMP) et étudier CLIC4 induite par le knockdown HN4 cellulaire, l’apoptose in vitro. Sous le microscope à fluorescence commun et microscope à fluorescence laser confocale, le changement en temps réel de la MMP a été enregistré.

Détection de potentiel de Membrane des mitochondries pour étudier CLIC4 HN4 induite par le Knockdown cellule Apoptosis In Vitro

Le test des comètes est une méthode efficace pour détecter les lésions de l’ADN dont l’ADN simple et double-brin se brise. Nous décrivons la comète neutres et alcalins des essais pour mesurer les lésions de l’ADN dans les cellules cancéreuses pour évaluer les effets thérapeutiques de la chimiothérapie.

Évaluation In Vitro dommages à l’ADN à l’aide du test des comètes

Ce protocole décrit une analyse inversée invasion verticale qui pourrait être utilisée pour quantifier les capacités de migration et invasion des cellules dans un décor en trois dimensions tout en préservant le microenvironnement cellulaire. Ce dosage est adapté aux cellules rares et/ou sensibles.

Déplacement vers le haut : Un Simple et Flexible In Vitro Invasion en trois dimensions Assay protocole

Cet article présente une procédure complète pour évaluer in vitro si angiogenèse tumorale classique existe dans les hémangioblastomes (HBs) et son rôle dans HBs. Les résultats soulignent la complexité de la néovascularisation-HB et suggèrent que cette forme courante d’angiogenèse est seulement un mécanisme complémentaire dans la néovascularisation-HB.

Une procédure complète d’évaluer la Performance In Vitro de la néovascularisation Hémangioblastome putatif à l’aide de l’ellipsoïde test de germination

Découvrez un test in vitro pour étudier l'interaction entre cellules tumorales et macrophages. Cette méthode évalue l'attraction des macrophages par le milieu conditionné tumoral et facilite le développement de traitements personnalisés contre le cancer.

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