Mesurer la prolifération des cellules musculaires vasculaires lisses à l'aide de la chimie de clic

La prolifération est une mesure importante de la fonction cellulaire. Ce protocole permet aux chercheurs de mettre au point un test de prolifération sensible dans leurs laboratoires sans le coût élevé des trousses disponibles dans le commerce. Le principal avantage de cette technique est qu’elle évite le traitement sévère des cellules et/ou l’utilisation de la radioactivité.

Vicky Wong, la directrice de mon laboratoire, démontrera cette technique. Pour apaiser la prolifération, retirez les cellules musculaires lisses vasculaires d’un flacon avec le média lisse de cellules de muscle dans le sérum bovin foetal de 2%, et plaquez à 20.000 cellules par millilitre dans DMEM dans une plaque de 96 puits. Faire croître les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Ajouter 30 nanogrammes par plaquette millilitre dérivé du facteur de croissance à trois à six puits comme un contrôle positif pour stimuler la prolifération. Ajoutez ensuite PBS au même nombre de puits qu’un contrôle négatif. Incuber pendant 72 heures.

Diluer le stock d’EdU de cinq millimolaires préparé précédemment à un millimolaire et ajouter deux microlitres à chaque puits pendant les 24 dernières heures de la période de culture de 72 heures. Conservez un ensemble de répliques sans EdU pour déterminer la fluorescence et la luminescence de fond. Vingt-quatre heures plus tard, fixer les cellules en enlevant les médias, puis en ajoutant 150 microlitres par puits de 4% paraformaldéhyde et incuber 10 minutes à température ambiante.

Retirer le paraformaldéhyde et ajouter 150 microlitres de 1%TX-100 dans l’eau par puits et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Laver trois fois avec PBS pour enlever le TX-100. Pour détecter l’EdU incorporé à l’aide de fluorescence, faire 10 millilitres de solution d’étiquetage par plaque de 96 puits juste avant l’utilisation en ajoutant des réacgages à partir de solutions de stock dans le bon ordre: 20 microlitres THPTA, 20 microlitres de cuivre sulfate, cinq microlitres fluorescéine picolyl-azide, et 100 microlitres sodium ascorbate en PBS pour un volume total de 10 millilitres.

L’étape la plus critique est de faire la solution d’étiquetage juste avant l’utilisation. Retirer le PBS des puits, ajouter 150 microlitres de solution d’étiquetage à chaque puits et incuber 30 minutes à 37 degrés Celsius. Pour détecter tous les noyaux, ajoutez dapi à chaque puits et l’image sur un microscope fluorescent ou lecteur de plaque d’imagerie.

Pour éviter le comptage manuel et lorsqu’un lecteur de plaque d’imagerie n’est pas disponible, ce protocole peut être modifié en une lecture de luminescence à l’aide d’azide HRP et d’un substrat ELISA. Pour détecter l’EdU à l’aide de luminscence, préparez d’abord une solution saline tamponnée à trois avec 0,1 % de polysorbate 20. Ajouter ensuite 150 microlitres de tampon bloquant à chaque puits et incuber pendant 90 minutes à température ambiante.

Après avoir enlevé le tampon de blocage, lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de PBS. Pour détecter l’EdU incorporé, préparez d’abord 10 millilitres de solution d’étiquetage par plaque de 96 puits en ajoutant des réadages à partir de solutions de stock dans le bon ordre. Tout d’abord, 20 microlitres THPTA, puis 20 microlitres de cuivre sulfate, cinq microlitres biotine picolyl-azide, 100 microlitres sodium ascorbate en PBS pour un volume total de 10 millilitres.

Laver les puits cinq fois trois minutes avec 200 microlitres de TBST en secouant. Étanchez les peroxydes endogènes avec 150 microlitres de peroxyde d’hydrogène de 0,3 % pendant 20 minutes à température ambiante. Après avoir enlevé le peroxyde d’hydrogène, laver cinq fois trois minutes avec 200 microlitres de TBST en secouant.

Ajouter 50 microlitres de peroxyde streptavidine-raifort diluée dans tbst à chaque puits et incuber à température ambiante pendant une heure. Laver cinq fois trois minutes avec 200 microlitres de TBST en secouant. Ajouter 50 microlitres de substrat ELISA chemiluminescent à chaque puits et lire immédiatement dans un lecteur de plaque capable de détecter la luminescence.

Bien que les noyaux fluorescents puissent être détectés par un lecteur standard de plaque de fluorescence, en utilisant le protocole de luminescence, l’analyse fluorescente est convertie en une lecture liquide homogène détectée avec du peroxyde streptavidine-raifort et un substrat ELISA standard. L’avantage de cette méthode par rapport à une lecture fluorescente est une lecture plus homogène et la plaque peut être lue en quelques secondes comme on le voit ici lorsque la prolifération de VSMC en réponse à PDGF a été mesurée. L’inconvénient est que l’arrière-plan est plus élevé qu’avec la fluorescence, donc les contrôles négatifs ont tendance à être plus élevés.

Dans une tentative de diminuer la variabilité, les résultats ont été normalisés aux comptes initiaux de cellules. Cependant, dans un ensemble distinct d’expériences, il a été démontré que cette méthode n’est pas assez sensible pour détecter de petites différences dans le nombre de cellules. La façon la plus efficace et la plus précise de compter les cellules positives et totales de l’EdU est d’utiliser un lecteur de plaques d’imagerie.

Si ce type de lecteur de plaque n’est pas disponible, le comptage manuel donnera également des résultats précis. Lorsqu’on compare ces deux méthodes, le nombre manuel positif d’EdU était identique au nombre automatisé, tout comme le nombre total non formulé. L’avantage de ces deux méthodes est la visibilité des cellules à compter, une meilleure précision, et que la coloration non spécifique des débris peut être vu et évité.

Le principal inconvénient avec la méthode de comptage manuel est le temps. N’oubliez pas de rendre la solution d’étiquetage fraîche juste avant l’utilisation et d’ajouter les ingrédients dans l’ordre fourni dans le protocole écrit. Si l’intensité de la coloration est faible, essayez d’ajuster le rapport chélateur/cuivre.

Rappelez-vous que le paraformaldéhyde est toxique. Il doit être utilisé dans une hotte de fumée tout en portant des gants. La procédure elle-même n’est pas difficile, mais peut-être besoin d’être optimisée en ajustant les ratios chélateur/cuivre dans la solution d’étiquetage.

En outre, les temps d’incubation et la durée du traitement edu peuvent être ajustés en fonction du type de cellule et de la question spécifique posée. Cette technique est compatible avec la surface cellulaire et la coloration intracellulaire afin que les caractéristiques des cellules de division et de non-division puissent être déterminées. Bien que couramment utilisée pour mesurer la prolifération, la chimie des clics peut également être utilisée pour l’étiquetage métabolique de l’ARN, des protéines, des acides gras et des glucides.

Si la cible métabolique d’intérêt se trouve à la surface de la cellule, les cellules vivantes peuvent être étiquetées.