Agarose interconnectée activée pour le développement rapide des résines de chromatographie d'affinité - Capture d'anticorps comme étude de cas

Les anticorps monoclonaux dominent le marché biopharmaceutique et sont généralement purifiés par la chromatographie des protéines A. La résine selon est un facteur de coût majeur pendant la production affectant le prix des thérapeutiques à base d’anticorps. Nous décrivons ici un nouveau ligand d’affinité basé sur la protéine fluorescente qui est lue comme porteur de l’épitope linéaire de l’anticorps neutralisant le VIH 2F5.

En général, notre méthode permet la génération rapide de résines chromatographie d’affinité qui peuvent être utilisées pour la capture d’anticorps monoclonaux. Nous avons démontré cette capacité en capturant l’anticorps 2F5 à partir d’extraits de plantes brutes. Nous avons optimisé les conditions de capture et le tampon de solution afin d’améliorer la capacité de liaison dynamique et la réutilisation de la résine.

Notre résine permet des conditions généralement plus lâches que la protéine A et a le potentiel de réduire les coûts de purification des anticorps monoclonaux. En outre, la résine peut facilement être adaptée à d’autres anticorps qui se lient aux épitopes linéaires. Pour commencer cette procédure, ajuster la concentration de la solution ligand affinité préparée de sorte que c’est dans la gamme de 5 à 15 grammes par litre tel que défini par la conception des expériences.

Conservez la solution sur la glace jusqu’à ce que la réaction de couplage soit prête. Ensuite, remplissez une seringue de deux millilitres avec la solution DFE. Et préparez un adaptateur pour monter les seringues sur les colonnes d’agarose à liaison croisée activées par le NHS avec un volume de lit d’un millilitre.

Pour chaque 10 colonnes utilisées pour le couplage, préparez 30 millilitres de solution de désactivation, 30 millilitres de solution à faible pH et une millilitre de solution de stockage. Ensuite, préparez 20 millilitres d’acide chlorhydrique millimolaire dans un tube. Et l’incuber sur la glace pendant au moins 20 minutes.

Préparez une échelle de précision pour surveiller le flux à travers les fractions pour toutes les étapes pendant la réaction de couplage. Après cela, ouvrez une colonne d’agarose croisée scellée activée par le NHS. Appliquez une goutte de tampon sur l’entrée de l’adaptateur, pour empêcher l’air d’entrer dans la colonne.

Montez l’adaptateur de seringue à l’entrée de colonne. Lavez la colonne avec six millilitres d’acide chlorhydrique froid et millimolaire, à un débit inférieur à un millilitre par minute. À l’aide d’une seringue de deux millilitres, injectez immédiatement 1,5 millilitres de solution DFE à un débit inférieur à un millilitre par minute.

Et recueillir le flux à travers la fraction sur une échelle de précision pour une analyse ultérieure. Sceller la colonne aux deux extrémités et incuber pendant 15 à 45 minutes, à 22 degrés Celsius. Injectez ensuite six millilitres de la solution d’activation, suivis de six millilitres de solution de pH faible, à un débit inférieur à un millilitre par minute, retirez les ligands non liés de façon covalente de la résine.

Injectez six millilitres de la solution d’activation et incubez la colonne pendant 15 minutes. Après cela, injectez six millilitres de solution à faible pH dans la colonne. Suivi de six millilitres de la solution d’activation.

Injectez ensuite six millilitres de solution à faible pH dans la colonne. Injectez deux millilitres de solution de stockage dans la colonne et rangez-la à quatre degrés Celsius. Préparez d’abord 100 millilitres de l’extrait végétal clarifié contenant 2F5, ou du supernatant pour le système d’expression cellulaire préféré, qui contient également 2F5.

Ensuite, préparez le tampon d’équilibrage, et le tampon d’illusion de force X de fer élevé, tel que décrit dans le protocole de texte. Rincer le système de chromatographie avec les tampons. Montez une colonne d’affinité DFE sur le système de chromatographie.

Et équilibrer avec cinq CV de tampon d’équilibrage, à un débit d’un millilitre par minute. Surveillez l’absorption uv à 280 nanomètres. Chargez ensuite 80 millilitres de l’extrait végétal clarifié ou du supernatant sur la colonne à un débit de 5 millilitres par minute.

Pour garantir un temps de contact de deux minutes. Recueillir le flux à travers des échantillons en deux fractions millilitres ou la reconstruction de la courbe de percée. Stockez le débit à travers les échantillons à quatre degrés Celsius, si l’analyse immédiate de l’échantillon n’est pas possible.

Après cela laver la colonne avec 6CV de tampon d’équilibrage. Recueillir un échantillon au début, au milieu et à la fin du lavage. Diluer le MAB2F5 avec cinq volumes de tampon d’illusion de résistance ionique élevée.

Recueillir la fraction DFE lorsque le signal UV à 280 nanomètres a augmenté à cinq milli unités d’absorption au-dessus de la ligne de base. Optimisez le tampon d’illusion pour chaque paire epitope-anticorps, tel que décrit dans le protocole texte. La protéine de fusion DFE est exprimée dans les plants de tabac transgéniques, cultivés dans une serre.

La récupération globale du DFE est de 23,5 milligrammes par kilogramme. Avec une pureté de plus de 90%La quantité absolue de DFE immobilisée sur la résine augmente avec la masse de DFE injectée dans la colonne, et plafonne à environ 15 grammes par litre, tandis que le rendement de couplage diminue continuellement à mesure que plus de DFE est injecté. Les molécules DFE sont considérées comme conservant leur florescence rouge, même après couplage.

L’intensité de la couleur correspond à la quantité totale de DFE immobilisé. Par conséquent, la couleur de la colonne peut être utilisée comme un paramètre simple de contrôle de la qualité pour estimer l’efficacité du couplage, et la qualité de la colonne. L’anticorps recombinant 2F5 est produit de façon transitoire dans les plantes nicotiana benthamiana cultivées dans un phytotron.

La capture de 2F5 à partir de l’extrait brut de la plante, est testée à l’aide de colonnes d’affinité, couplées à environ sept milligrammes de DFE purifié. Une concentration de chlorure de magnésium de 1,25 molaire est suffisante pour exténuer 2F5 de la résine d’affinité DFE avec une récupération proche de 100% et une pureté d’environ 97%, ce qui est comparable aux résines de protéine A. Le DBC de la résine d’affinité DFE à 10%2F5 percée, diminue linéairement au cours des 25 cycles, à environ 15% de la valeur initiale.

Nous avons utilisé une approche de conception d’expériences pour optimiser la capacité de couplage de notre ligand affinité. Ces conditions peuvent être affinées pour d’autres ligands à l’avenir. Notre méthode utilise des protéines florescentes pour enfiler une protéine sous-transporteur pour le ligand spécifique au produit.

Dans le même temps il suffit d’ajouter des fonctions comme un indicateur de qualité visuelle de la procédure de mobilisation, fournissant une rétroaction immédiate et intuitive à l’opérateur.