Name: Méthodes de recherche sur les chloroplastes : sonder le ciblage, la localisation et les interactions des protéines chloroplastiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 2 min 45 s
Description: Découvrez des méthodes complémentaires in vitro et in vivo pour étudier l'import, la localisation et les interactions des protéines chloroplastiques chez Arabidopsis thaliana. Ces techniques avancent la recherche en biologie végétale.

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<ol><li>Jarvis, P., López-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Letters. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li>
<li>Fitzpatrick, L. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+isolating+a+high+yield+of+Arabidopsis+chloroplasts+capable+of+efficient+import+of+precursor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A method for isolating a high yield of Arabidopsis chloroplasts capable of efficient import of precursor proteins.</a> Plant Journal. 27 (1), 59-65 (2001).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Current Biology. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li>
<li>Lee, J., Kang, H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+import+into+chloroplasts+using+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying protein import into chloroplasts using protoplasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
<li>Asher, A., Ganesan, I., Klasek, L., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+physiologically+active+thylakoids+and+their+use+in+energy-dependent+protein+transport+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Bouchnak, I., Moyet, L., Salvi, D., Kuntz, M., Rolland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+chloroplast+sub-compartments+from+Arabidopsis+for+the+analysis+of+protein+Localization+by+immunoblotting+or+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of chloroplast sub-compartments from Arabidopsis for the analysis of protein Localization by immunoblotting or proteomics.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Salvi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AT_CHLORO%3A+the+first+step+when+looking+for+information+about+subplastidial+localization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">AT_CHLORO: the first step when looking for information about subplastidial localization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1829, 395-406 (2018).</li>
<li>Shanmugabalaji, V., Douet, V., Agne, B., Kessler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+chloroplast+translocon+protein+complexes+using+the+TAP+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of chloroplast translocon protein complexes using the TAP tag.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ycf2-FtsHi+heteromeric+AAA-ATPase+complex+is+required+for+chloroplast+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Ycf2-FtsHi heteromeric AAA-ATPase complex is required for chloroplast protein import.</a> Plant Cell. 30 (11), 2677-2703 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thylakoid+membrane+protein+complexes+by+blue+native+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).</li>
<li>Kikuchi, S., Hirohashi, T., Nakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+preprotein+translocon+at+the+outer+envelope+membrane+of+chloroplasts+by+blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the preprotein translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts by blue native PAGE.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (3), 363-371 (2006).</li>
<li>Chen, L. J., Li, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+megadalton+TOC-TIC+supercomplexes+as+major+mediators+of+protein+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Stable megadalton TOC-TIC supercomplexes as major mediators of protein import into chloroplasts.</a> Plant Journal. 92 (2), 178-188 (2017).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 775, Humana Press. New York City. 432(2011).</li>
<li>Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJarvis%2C+RP+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. JM, W. alker 774, Humana Press. New York City. 374(2011).</li>
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méthodes de recherche sur les chloroplastes : sonder le ciblage, la localisation et les interactions des protéines chloroplastiques

Chloroplast Research Methods: Probing The Targeting, Localization And Interactions Of Chloroplast Proteins

Méthodes de recherche sur les chloroplastes : sonder le ciblage, la localisation et les interactions des protéines chloroplastiques

Chloroplasts are the organelles that define plants1. Along with many other metabolic, developmental and signaling functions, chloroplasts are responsible ...

Bienvenue dans les collections JoVE Methods sur les méthodes de recherche sur les chloroplastes, organisées par notre rédacteur invité, Paul Jarvis. Cette collection couvre un large éventail de techniques in vitro et in vivo qui caractérisent les interactions protéiques à l’intérieur des chloroplastes. Des chercheurs de l’Université d’Oxford décrivent une méthode in vitro utilisant des chloroplastes isolés, incubés avec des protéines marquées radioactivement pour surveiller leur absorption.Cette méthode est une évolution des approches antérieures utilisées pour étudier l’importation de protéines de chloroplastes in vitro. Ensuite, de manière complémentaire, l’importation de protéines de chloroplastes est examinée in vivo. Cette méthode utilise l’expression transitoire de protéines chimériques et de protoplastes pour examiner les changements de taille et la localisation des protéines via l’immunoblotting et la microscopie à fluorescence.Dans cette vidéo méthodique, les auteurs ont examiné le système de membranes thylacoïdes présent dans les chloroplastes. En isolant les membranes, les voies de translocation des protéines sont élucidées dans les chloroplastes par SDS-PAGE et l’imagerie au phosphore. Des chercheurs en France appliquent différentes méthodes de centrifugation pour isoler les sous-compartiments présents dans les chloroplastes.Ces fractions cellulaires isolées sont ensuite analysées par immunoblotting et protéomique afin de fournir des informations sur la localisation suborganellaire des protéines chloroplastiques. Ensuite, des chercheurs suisses ont utilisé la purification par affinité de complexes multiprotéiques chloroplastiques pour examiner la machinerie moléculaire impliquée dans l’importation de protéines. Plus précisément les complexes multi-protéiques de la langue et des tiques intégrés dans les membranes de l’enveloppe.Dans une approche complémentaire, les scientifiques caractérisent le complexe protéique thylacoïde végétal dans Arabidopsis à l’aide de Blue Native PAGE, ou BN-PAGE, qui permet la séparation des complexes protéiques dans leur forme native et fonctionnelle. Les complexes sont analysés plus en détail via une page SDS 2D. Vous venez tout juste d’avoir un aperçu des différentes méthodes utilisées pour étudier les protéines chloroplastiques dans notre collection JoVE Methods.Vous pouvez consulter les articles en détail sur la page web de la Collection des méthodes de recherche sur les chloroplastes affichée à l’écran.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

L'approche décrite comparative, protéomique quantitative vise à obtenir un aperçu de la composition de complexes multiprotéiques dans des conditions différentes et est démontrée en comparant différentes souches génétiquement. Pour l'analyse quantitative des volumes égaux de fractions différentes d'un gradient de densité de saccharose sont mélangés et analysés par spectrométrie de masse.

Une nouvelle approche pour l&#39;analyse comparative des complexes multiprotéiques Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N Marquage métabolique et spectrométrie de masse quantitative

La formation de complexes de protéines in vivo peut être visualisé par fluorescence bimoléculaire complémentation. partenaires d'interaction sont fusionnés à des parties complémentaires de marqueurs fluorescents et exprimés transitoirement dans des feuilles de tabac, ce qui entraîne un signal fluorescent reconstitué à proximité des deux protéines.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour étudier l'importation de protéines dans les chloroplastes isolés sous contrainte. La méthode est simple et rapide, et peut être appliqué pour étudier les conséquences des différentes conditions de stress pour les protéines de chloroplaste importation, et les mécanismes de régulation correspondants.

Analyse des protéines d&#39;importation dans les chloroplastes isolés de plantes stressées

Ici, nous présentons un protocole de capture interactif appliqué aux protoplastes de mésophylle de la feuille d' Arabidopsis thaliana . Cette méthode repose de manière critique sur la réticulation UV in vivo et permet l'isolement et l'identification des protéines de liaison de l'ARNm de la plante à partir d'un environnement physiologique.

Capture interactine d&#39;ARNm à partir de protoplastes végétaux

Nous présentons des protocoles ci-après pour l’isolement de haut rendement de thylakoïdes physiologiquement actives et essais de transport de protéine pour la translocation de chloroplastes twin arginine (cpTat), sécrétoire (cpSec1) et particules (cpSRP) voies de reconnaissance des signaux.

Isolement des thylakoïdes physiologiquement actives et leur utilisation dans des essais de Transport protéine dépendant de l’énergie

Nous décrivons ici un protocole pour exprimer les protéines dans des protoplastes à l’aide de la méthode de transformation par PEG. La méthode fournit une expression simple de protéines d’intérêt et un examen efficace de la localisation de la protéine et le processus d’importation pour diverses conditions expérimentales in vivo.

Étudier l’Import des protéines dans des chloroplastes à l’aide de protoplastes

Nous présentons ici un protocole éprouvé et testé pour la purification des chloroplastes complexes d’importation protéiques (complexe TOC-TIC) à l’aide de la balise de robinet. Le protocole d’affinité-isolation en une seule étape peut potentiellement s’appliquer à n’importe quelle protéine et être utilisé pour identifier de nouveaux partenaires d’interaction par spectrométrie de masse.

Purification d’affinité des chloroplastes Translocon protéines Complexes à l’aide de la balise de robinet

Nous décrivons ici une méthode pour purifier les chloroplastes intacts des feuilles de l’Arabidopsis et leurs trois compartiments secondaires principaux (enveloppe, stroma et les thylakoïdes), en utilisant une combinaison de centrifugations différentielles, gradient de Percoll continue, et gradients de sucrose discontinu. La méthode est importante par subplastidial et localisation sous-cellulaire des protéines par immunotransfert et protéomique.

Préparation des compartiments des chloroplastes d’Arabidopsis pour l’analyse de la localisation de la protéine par immunotransfert ou protéomique

De nombreuses espèces végétales modifient le positionnement des chloroplastes pour optimiser l’absorption de la lumière. Ce protocole décrit comment utiliser un instrument simple et fait maison pour étudier le mouvement des chloroplastes dans les feuilles d’Arabidopsis thaliana en utilisant les changements dans la transmission de la lumière à travers une feuille comme proxy.

Utilisation de changements dans la transmission des feuilles pour étudier le mouvement des chloroplastes chez Arabidopsis thaliana

Le besoin de nouvelles approches pour étudier les sites de contact membranaire (MCS) s’est accru en raison de l’intérêt croissant pour l’étude de ces structures cellulaires et de leurs composants. Nous présentons ici un protocole qui intègre les technologies de microscopie précédemment disponibles pour identifier et quantifier les complexes protéiques intra-organites et inter-organites qui résident dans les MCS.

Visualisation et quantification des interactions endogènes intra-organites protéiques au niveau des sites de contact ER-mitochondries par des tests de ligature de proximité

Découvrez des méthodes complémentaires in vitro et in vivo pour étudier l'import, la localisation et les interactions des protéines chloroplastiques chez Arabidopsis thaliana. Ces techniques avancent la recherche en biologie végétale.

Méthodes de recherche sur les chloroplastes : sonder le ciblage, la localisation et les interactions des protéines chloroplastiques (Vidéo) | JoVE Journal

Méthodes de recherche sur les chloroplastes : sonder le ciblage, la localisation et les interactions des protéines chloroplastiques

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