Name: Microréseaux dADN et dARN à haute densité - Synthèse photolithographique, hybridation et préparation des grandes bibliothèques dacide nucléique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Découvrez la synthèse photolithographique de microréseaux d'ADN et d'ARN pour créer des bibliothèques d'acides nucléiques. Cette méthode permet d'étudier les interactions acides nucléiques-protéines.

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Ces travaux ont été soutenus par le Fonds autrichien pour la science (subventions FWF P23797, P27275 et P30596) et la Fondation nationale suisse pour la science (Grant #PBBEP2_146174).

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Les auteurs certifient qu'ils n'ont aucune affiliation avec un organisme à but lucratif.

La synthèse de l'ADN et de l'ARN en phase solide est le pain et le beurre de chaque laboratoire de chimie de l'acide nucléique, et bien que l'ajout du composant de photolithographie soit certes une opération complexe, la fabrication de microarray médiée par la lumière UV est également un processus très fiable . C'est, en outre, la seule méthode disponible pour la synthèse in situ d'ARN sur des microarrays. Pourtant, comme dans toute procédure expérimentale en plusieurs étapes, il y a amplement de place pour l'erreur humaine.
Peut-être l'étape la plus critique est le couplage d'une phosphoramidite, car il doit être une réaction chimique constamment à haut rendement afin de se permettre des oligonucléotides avec peu d'erreurs synthétiques. Dans notre protocole de synthèse de microarray, le couplage de phosphoramidite est encore plus essentiel à la qualité globale de synthèse puisque le processus de fabrication contourne le plafonnement et empêche la purification d'oligonucléotide. Des gains d'efficacité de couplage stepwise supérieurs à 99 % ont été calculés pour tous les phosphoramidites d'ADN et d'ARN photosensibles, même pour des temps d'accouplement très courts (15 s)24, mais des rendements d'accouplement plus faibles peuvent parfois se produire, en particulier dans le cas des amidites dG. La stabilité des phosphoramidites solubilisés à température ambiante a été étudiée avant et a été montrée pour dépendre de la nature de la nucléobase, avec des phosphoramidites de guanosine sujettes à la dégradation étendue en seulement une question de jours29, 30. Mais lorsqu'ils sont stockés à -25 oC, les phosphoramidites d'ACN dissous acdissés de 30 mM se sont avérées stables pendant plusieurs semaines. L'instabilité relative des solutions de phosphoramidite dG à température ambiante signifie cependant qu'elles ne doivent pas être maintenues attachées au synthétiseur d'ADN pendant plusieurs jours.
Pour les phosphoramidites à ARN, le rendement du couplage dépend beaucoup de la qualité de la phosphoramidite (qui peut être évaluée par spectroscopie 31 P NMR) et du temps d'accouplement. Les temps d'accouplement de 5 minutes pour rA, rG, rC et 2 min pour le rU semblent nécessaires. En effet, nous avons constaté que le raccourcissement du temps de condensation à 2 min pour tous les phosphoramidites d'ARN a mené aux signaux d'hybridation sensiblement inférieurs.
Le synthétiseur d'ADN lui-même, ainsi que les réactifs et les solvants, doit certainement être aussi propre que possible afin d'atteindre le rendement le plus élevé de la synthèse de l'oligonucléotide. Cependant, les matières insolubles, les sels ou les particules, peuvent s'accumuler au fil du temps dans les lignes et les tubes du système de livraison, conduisant à une diminution progressive de la consommation de réactifs et de réactifs. Lorsqu'un nettoyage général du synthétiseur ne résout pas un faible volume de sortie, une augmentation du nombre d'impulsions peut être une solution alternative. Particulièrement utile dans le cas d'une faible consommation de phosphoramidite, la ligne du protocole d'accouplement correspondant au pompage d'un mélange de phosphoramidite et d'activateur (troisième ligne de la sous-section de couplage du tableau 1 et du tableau 2) peut être modifié, de 6 à 9 impulsions sans aucun effet négatif appréciable sur la qualité de synthèse. De plus, le nombre d'impulsions de l'activateur nécessaire pour amener le mélange amidite/activateur au substrat de synthèse (actuellement 6, quatrième ligne dans la sous-section d'accouplement, voir tableau 1 et tableau 2) dépend du synthétiseur d'ADN lui-même ainsi que du longueur de tuyauterie dans la cellule de synthèse. Ce nombre peut être ajusté après avoir remplacé la phosphoramidite par une solution colorée et compte le nombre d'impulsions nécessaires pour pousser le mélange coloré vers le substrat de verre pour le couplage.
La méthode décrite ci-dessus permet à la synthèse de l'ADN et de l'ARN de se faire simultanément, sur le même microréseau. Les hybrides d'ADN et d'ARN peuvent également être préparés sans aucun changement aux protocoles de fabrication du tableau, et tant que le protocole de déprotection en trois étapes est suivi. Cependant, il convient de noter que les microréseaux à ARN seulement ne nécessitent qu'une déprotection en deux étapes : une décyanoéthylation d'abord avec et3N suivie de l'hydroxyle et de la déprotection de base avec l'hydrazine. Les nucléobases d'ADN se sont avérées incomplètement déprotégées dans ces conditions, et ont besoin de l'étape supplémentaire dans EDA afin d'effectuer l'enlèvement complet des groupes de phénoxyacetyl (Pac). Ce traitement supplémentaire avec EDA est plus court (5 min) que pour la déprotection standard des microréseaux d'ADN31,mais il suffit de le conduire à l'achèvement après les traitements de triéthylamine et d'hydrazine. En outre, un court temps de réaction avec EDA limite l'exposition d'un oligonucléotide d'ARN entièrement déprotégé aux conditions de base.
Un avantage de la synthèse in situ de tableau d'ARN au-dessus des méthodes alternatives comme la repérage ou la transcription d'ADN32,33,34 est la capacité de stocker la puce synthétisée d'ARN sous forme protégée jusqu'à l'utilisation, évitant ainsi le risque de dégradation potentielle de l'ARN. Les procédures post-synthétiques pour l'ARN impliquent, d'autre part, que les consommables et les réactifs sont maintenus stériles et que la manipulation est effectuée dans des conditions sans RNase. Il convient de noter que nous avons constaté que l'ajout d'inhibiteur de la RNase au mélange d'hybridation n'a pas donné lieu à des signaux d'hybridation plus forts pour les caractéristiques de l'ARN.
La synthèse des bibliothèques d'ADN sur un monomère sensible à la base est plus complexe que la synthèse de quelques séquences de contrôle sur une surface, et en tant que telle est certainement plus sujette aux erreurs de conception. Pourtant, en supposant que la conception de la séquence (c'est-à-dire la nature et le nombre de séquences) est correcte, la transformation de cette liste en une collection de masques d'exposition et une série ordonnée de cycles d'accouplement reste un processus simple. Cependant, d'importantes variations de la synthèse standard des microréseaux existent et sont essentielles à la fabrication réussie d'un réseau de bibliothèques à haute densité.
Tout d'abord, un monomère dT sensible à la base est couplé comme le premier phosphoramidite après la synthèse du linker. Le rendement de couplage de ce monomère (figure 1) s'est avéré relativement faible, autour de 85 %28, c'est pourquoi des efforts sont faits pour améliorer son taux d'incorporation, soit en augmentant sa concentration en ACN de 30 mM à 50 mM, soit en répétant le Étape de couplage : deux réactions consécutives de couplage utilisant des monomères frais, ou deux cycles d'accouplement distincts mais consécutifs.
Le deuxième changement est l'ajout d'une solution de carotène dans la chambre arrière de la cellule de synthèse, qui absorbe commodément 365 nm de lumière. Il s'agit d'une modification importante de la configuration de la photolithographie car elle empêche la lumière UV de se refléter sur le substrat du tableau. En effet, après avoir traversé le milieu interstitiel entre les substrats, la lumière UV entrante sort par la glissière forée et atteint le bloc de quartz de la cellule. Les équations de Fresnel prédisent que 4 % de la lumière UV par incident perpendiculaire se reflétera à partir de chacune des trois interfaces air-verre en aval (côté de sortie du substrat 2nd et des deux côtés du bloc de quartz) et de retour sur le substrat de synthèse, l'exposition involontaire d'oligonucléotides photoprotégés. La diffraction et la dispersion contribuent également à la protection photodéprotection « hors cible » et, par conséquent, à l'insertion de nucléotides, ce qui affecte directement le taux d'erreur de synthèse, mais ces contributions sont beaucoup plus petites que les réflexions et peuvent être réduire la densité de synthèse (laissant des écarts entre les entités). Nous avons constaté que le niveau de la solution de carotène dans la chambre inférieure de la cellule tend à diminuer légèrement seulement pendant les premières minutes de synthèse de tableau, et doit donc être surveillé et réajusté.
Enfin, le troisième changement est la solution de déprotection, remplaçant EtOH par toluène, qui maintient la bibliothèque d'ADN clivé lié à la surface, sans doute par des interactions électrostatiques. L'application d'une petite quantité d'eau à la zone de synthèse après le lavage ACN permet de recueillir la bibliothèque facilement. Le processus n'est cependant couronné de succès que si la teneur en eau en EDA et en toluène est minime, rendant l'acide nucléique entièrement insoluble dans le cocktail de déprotection. Alternativement, les bibliothèques d'ADN peuvent êtreclivées outre de la puce utilisant l'ammoniac 9,10,14,35,puis davantage déprotégée en chauffant la solution d'ammoniac aqueuse contenant de l'ADN à 55 oC pendant la nuit. La récupération des bibliothèques d'ADN utilisant l'ammoniac n'est cependant pas compatible avec l'ARN. Les oligonucléotides d'ARN sur un substrat de base-cléavable peuvent être élifiés de la surface utilisant la même procédure edA/toluène décrite ci-dessus, mais seulement à l'avant-dernière étape après la stratégie de déprotectionendeux étapes et à l'hydrazine28.
D'autres stratégies pour récupérer les bassins d'oligonucléotides dans les microréseaux sans avoir besoin d'un traitement de base spécifique existent, sont en principe compatibles avec la photolithographie et reposent sur l'utilisation d'enzymes. Par exemple, un seul nucléotide deoxyuracil peut être la cible de la glycosylase uracil-ADN (UDG) et excisée du reste de la séquence d'ADN, ou une seule unité d'ARN peut être identifiée par les enzymes rnase H de type 2 et le lien phosphodiester 5' à l'ARN clivé , la libération de la partie 5' ADN23.
Nous avons maintenant une méthode puissante, fiable et à haute densité pour la synthèse de l'ADN, de l'ARN et des microréseaux hybrides d'ADN/ARN. Ceux-ci peuvent non seulement servir de plates-formes pour l'hybridation ou les essais de liaison36, mais ils représentent également un moyen rapide et peu coûteux de produire des bibliothèques complexes d'acide nucléique. Pour le stockage de données numériques à base d'ADN, la microlithographie peut devenir une solution potentielle au goulot d'étranglement de l'écriture (c.-à-d. au codage de l'information par synthèse). Le succès de l'encodage numérique sur l'ADN et dans l'assemblage des gènes de novo dépend de la fidélité de la séquence qui, au niveau de la synthèse, se traduit par le taux d'erreur. Les erreurs synthétiques et optiques dans nos protocoles actuels de fabrication de tableau seront discutées et rapportées ailleurs. Parallèlement, des efforts sont en cours pour accroître encore l'échelle de fabrication et le débit.

L'utilisation pratique des microréseaux d'ADN a traditionnellement été dans l'étude des variations dans les niveaux d'expression des gènes entre deux populations cellulaires, en utilisant des brins complémentaires et la fluorescence comme méthode de détection1. De temps en temps, les microarrays d'ADN s'aventurent dans des événements de liaison avec des ligands d'acide non nucléique, tels que des protéines, avec une stratégie de permutation systématique de séquence qui offre un aperçu complet du paysage de liaison2,3, 4,5. Cette approche transforme efficacement les microréseaux de simples surfaces d'hybridation en plates-formes à large couverture de séquences, ce qui serait un atout pour l'étude du monde plus riche et plus complexe de la structure et de la fonction de l'ARN. Soutenu par la réaction extrêmement efficace de couplage de phosphoramidite6, les tableaux d'ADN synthétisés in situ peuvent maintenant également être considérés comme une source bon marché d'ADN7, qui devient particulièrement pertinent compte tenu de la demande toujours croissante pour Matériel d'acide nucléique pour l'assemblage des gènes8,9, nanostructures à base d'ADN10, stockage d'informations ou de séquençage11,12. De même, les technologies de séquençage sont susceptibles de bénéficier du développement de méthodes qui produisent des mélanges très complexes d'oligonucléotides d'ARN13. Dans ce contexte, les protocoles de fabrication de tableaux qui permettent de synthétiser in situ et à haute densité des oligonucléotides sont idéalement placés pour répondre aux besoins du domaine en pleine expansion de la biotechnologie de l'acide nucléique. Cependant, avec un domaine aussi diversifié que la biotechnologie, le but de chaque application peut exiger que l'ADN sur microarray soit produit à haut débit ou avec une très faible quantité d'erreurs synthétiques14,15, ou les deux, nécessitant un regarder de plus près les protocoles de synthèse des microréseaux d'ADN qui, historiquement, ont été principalement optimisés pour les essais d'hybridation. Pendant ce temps, la synthèse in situ des microréseaux d'ARN s'est avérée être une entreprise difficile, avec la plupart de la difficulté associée au groupe de protection pour la fonction 2'-OH, habituellement un moiety silyl dans la synthèse standard de phase solide qui est enlevée avec réactifs à base de fluor, des produits chimiques incompatibles avec les surfaces de verre ou de silicium. Ces questions et les défis dans l'ADN et la synthèse des microréseaux d'ARN ont récemment fait l'objet d'un grand nombre de travaux, en particulier avec l'approche photolithographie16.
La photolithographie utilise la lumière UV pour débloquer les oligonucléotides avant le couplage et nécessite des masques pour construire un modèle d'exposition aux UV, organisant et contrôlant ainsi spatialement la croissance des oligonucléotides. Les masques physiques ont été remplacés par des micromiroirs contrôlés par ordinateur dont l'inclinaison réfléchit sélectivement la lumière UV sur le substrat de microarray17,18,19. Comme source UV, nous utilisons 365 nm de lumière à partir d'une source LED de haute puissance20. Les configurations photolithographiques actuelles sont équipées de réseaux de micromiroirs contenant 1024 à 768 miroirs, correspondant à plus de 780 000 points adressables individuellement (« caractéristiques ») sur une petite surface de seulement 1,4 cm2, ou 1080p avec des tableaux de 1920 à 1080, ou 2 millions de miroirs. Chacun des miroirs de l'appareil a donc un contrôle direct sur la séquence cultivée sur la fonction correspondante. À l'exception de la lumière UV, la photolithographie fonctionne comme une technique de synthèse en phase solide et adopte la chimie de la phosphoramidite à base de cycle. Seulement il exige une stratégie de protection entièrement différente pour que la synthèse d'ARN réussisse. Nous avons développé une nouvelle série de phosphoramidites à ARN sensibles à la lumière portant des groupes protecteurs hydrazine-labile21. Ces monomères permettent de déprotéger l'ARN dans des conditions douces qui n'affectent pas l'intégrité de la surface. Une première étape de déprotection utilise la triéthylamine pour éliminer les groupes de protection du phosphodiester cyanoéthyle, tandis que l'hydrazine est utilisée dans une deuxième étape distincte pour enlever ceux des fonctions de l'amine 2'-OH et exocyclique. Ce faisant, l'ARN oligonucléotides de 30-nt de longueur et de n'importe quelle séquence peut maintenant être synthétisé in situ sur microarrays22,23. En parallèle, nous avons également récemment commencé à aborder les questions de débit, de qualité et de vitesse dans la photolithographie de l'ADN et de l'ARN. Nous avons mesuré l'efficacité du couplage à 99 % pour tous les amidites d'ADN et d'ARN (Figure 1) et étudié chaque étape individuelle du cycle d'allongement de l'oligonucléotide, du temps d'oxydation au choix de l'activateur et à l'exposition optimale aux UV24 , 25. Nous avons introduit de nouveaux groupes de protection de 5' sensibles à la lumière qui peuvent être supprimés en quelques secondes seulement, transformant la synthèse de centaines de milliers de 100mers en un processus de quelques heures26. Nous avons également doublé le débit de fabrication de tableau en exposant deux substrats simultanément27. Enfin, nous avons introduit un dT phosphoramidite contenant un groupe de succinyl sensible à la base comme un moyen pratique de couper, recueillir et analyser l'ADN et l'ARN oligonucléotides, qui est au cœur de la préparation de la bibliothèque28.
En dépit de l'aspect relativement banal de l'ADN et de la synthèse de phase solide d'ARN, particulièrement pour des chimistes d'acide nucléique, la photolithographie de microarray demeure une mise à niveau non triviale exigeant une configuration complexe, le contrôle soigneux et la surveillance du processus, et instructions distinctes pour la manipulation post-synthétique en fonction de la nature de l'oligonucléotide et du type d'application. Dans cet article, nous souhaitons fournir une présentation détaillée de l'ensemble de la procédure étape par étape de la synthèse in situ des microréseaux d'ADN et d'ARN par photolithographie, de la conception expérimentale à l'analyse des données, en mettant l'accent sur la préparation des instruments et Consommables. Nous décrivons ensuite les méthodes de déprotection post-synthétiques qui correspondent à l'objectif visé par la fabrication de microréseaux (c.-à-d. l'hybridation ou la récupération des bibliothèques d'acide nucléique).

<table><tbody><tr><td><fonctionnalisation de la lame <>></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique >99,8 %</td><td>Sigma</td><td>33209</td><td>Pour la déprotection de l’ARN</td></tr><tr><td>Routeur CNC</td><td>Stepcraft</td><td>300 CK</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>VWR</td><td>1.07017.2511</td><td>Pour la déprotection et la fonctionnalisation</td></tr><tr><td>N-(3-triéthoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide</td><td>Gelest</td><td>SIT8189.5</td><td>Réactif de silanisation</td></tr><tr><td>Lames de microscope en verre Nexterion Lames de microscope</td><td>Schott</td><td>1095568</td><td></td></tr><tr><td>Polymax 1040</td><td>Heidolph</td><td></td><td>Agitateur orbital</td></tr><tr><td>Proclean 507 Bain-marie à ultrasons</td><td>Ulsonix</td><td></td><td>Pour nettoyer les lames après le perçage</td></tr><tr><td>Tickopur RW 77 Nettoyant spécial</td><td>Sigma</td><td>Z860086</td><td>Pour nettoyer les lames après le perçage</td></tr><tr><td>Synthèse de microarrays</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25 M dicyanoimidazole in ACN</td><td>Biosolve</td><td>0004712402BS</td><td>Activator</td></tr><tr><td>0.7 XGA DMD</td><td>Texas Instruments</td><td></td> Digital <td>Micromirror</td></tr><tr><td>Device 20 mM I2 in pyridine/H2O/THF</td><td>Oxydant</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sigma L860020-06250 &mu ; m d’épaisseur Chemraz 584 perfluoroélastomère</td><td>FFKM</td><td></td><td>Joint inférieur en téflon</td></tr><tr><td>2'-O-ALE RNA phosphoramidites</td><td>ChemGenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>365 nm haute puissance UV-LED</td><td>Nichia</td><td>NVSU333A</td><td></td></tr><tr><td>5'BzNPPOC DNA phosphoramidites</td><td>Orgentis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5'NPPOC DNA phosphoramidites</td><td>FlexGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Biosolve</td><td>0001205402BS</td><td>Pour la synthèse de l’ADN</td></tr><tr><td>Diluant amidite pour la synthèse</td><td>de l’ADN Sigma</td><td>L010010</td><td>Pour dissoudre les phosphoramidites</td></tr><tr><td>Clivable dT</td><td>ChemGenes</td><td></td><td>Monomère sensible à la base pour la préparation de banques</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biosolve</td><td>0004474701BS</td><td>Comme solvant d’exposition</td></tr><tr><td>Déprotection des microréseaux d’ADN et d’ARN </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine >99.5 %</td><td>Sigma</td><td>3550</td><td>Pour la déprotection</td></tr><tr><td>Expedite 8909</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td></td><td>Synthétiseur d’ADN</td></tr><tr><td>Hydrazine hydratée 50-60 % hydrazine</td><td>Sigma</td><td>225819</td><td>Pour la déprotection de l’ARN</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>Ruban PTFE à faible densité de qualité industrielle</td><td>Gasoila</td><td></td><td>Thin, joint supérieur en téflon</td></tr><tr><td>Pyridine >99 %</td><td>Sigma</td><td>P57506</td><td>Pour la déprotection de l’ARN</td></tr><tr><td>Triethylamine >99 %</td><td>Sigma</td><td>T0886</td><td>Pour la déprotection de l’ARN</td></tr><tr><td>&bêta ;-carotène</td><td>Sigma</td><td>C9750</td><td>Pour la préparation de la bibliothèque</td></tr><tr><td>Hybridation et numérisation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x Citrate salin de sodium</td><td>Roth</td><td>1054.1</td><td></td></tr><tr><td>5'Cy3-labellisé brin complémentaire</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>Pour l’hybridation duplex</td></tr><tr><td>Biopur Safe-Lock microcentrifugeuse</td><td>tube Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA (10 mg/mL)</td><td>Promega</td><td>R3961</td><td></td></tr><tr><td>EDTA biologie moléculaire</td><td>grade Promega</td><td>H5031</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4100A</td><td>Molecular Devices Scanner</td><td></td> de <td>microréseaux</td></tr><tr><td>Four d’hybridation</td><td>Boekel Scientific</td><td>230500</td><td></td></tr><tr><td>MES monohydraté</td><td>Sigma</td><td>69889</td><td></td></tr><tr><td>MES sodium</td><td>Sigma</td><td>M3058</td><td></td></tr><tr><td>NaCl >99.5 %</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>SecureSeal SA200 Chambre d’hybridation</td><td>Grace BioLabs</td><td>623503</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge mini</td><td>Labnet</td><td>C1301</td><td>Centrifugeuse à microréseaux</td></tr><tr><td>Tween-20 grade de biologie moléculaire</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Extraction de données</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Pour l’extraction de données</td></tr><tr><td>MatLab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>Conception</td></tr> <tr>de microréseaux<td>NimbleScan 2.1</td><td>Roche NimbleGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dessalage et quantification</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Spectrophotomètre</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toluène</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZipTip C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18s008</td><td>Désalage des pointes de pipette</td></tr></tbody></table>

microréseaux d'adn et d'arn à haute densité - synthèse photolithographique, hybridation et préparation des grandes bibliothèques d'acide nucléique

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

La photolithographie est une technique puissante pour la synthèse des oligonucléotides d'ADN sur des lames de verre, car elle combine l'efficacité des réactions d'accouplement de phosphoramidite avec la précision et la densité de la lumière UV réfléchie par des miroirs de la taille d'un micromètre. La photolithographie produit des microréseaux pouvant accueillir des centaines de milliers jusqu'à plusieurs millions de séquences d'ADN différentes, 100-nt ou plus, en seulement quelques heures. Avec cet espace séquence très important, les microréseaux sont des plates-formes idéales pour explorer les mécanismes des interactions entre l'acide nucléique et ligand, qui sont particulièrement pertinentes dans le cas de l'ARN. Nous avons récemment rapporté sur la préparation d'un nouvel ensemble de phosphoramidites d'ARN compatibles avec la photolithographie in situ et qui ont été plus tard employés pour cultiver des oligonucléotides d'ARN, des homopolymères aussi bien que des séquences de base mélangée. Ici, nous animons en détail le processus de fabrication du microréseau d'ARN, de la conception expérimentale, à la configuration instrumentale, à la synthèse du tableau, à la déprotection et à l'analyse finale de l'hybridation à l'aide d'un modèle 25mer séquence contenant les quatre bases à titre d'exemple. En parallèle, nous allons au-delà des expériences basées sur l'hybridation et exploitons la microlithographie comme une passerelle peu coûteuse vers des bibliothèques complexes d'acide nucléique. Pour ce faire, les microréseaux d'ADN à haute densité sont fabriqués sur un monomère sensible à la base qui permet à l'ADN d'être facilement clivé et récupéré après synthèse et déprotection. Le protocole de fabrication est optimisé de façon à limiter le nombre d'erreurs synthétiques et, à cet effet, une couche de solution de carotène est introduite pour absorber les photons UV qui pourraient autrement se refléter sur les substrats de synthèse. Nous décrivons étape par étape le processus complet de préparation de la bibliothèque, de la conception au clivage et à la quantification.

Hybridation de microréseau d'ADN et d'ARN La figure 5 montre les résultats d'un test d'hybridation effectué sur un microréseau contenant les versions ADN et ARN d'une séquence 25mer (5'-GTCATCATCATCACACACCCTGGTC-3' sous forme d'ADN). L'analyse de la figure 5A apparaît dans un format à échelle verte correspondant au spectre d'excitation/émission de fluorescence Cy3, avec une intensité de fluorescence enregistrée dans des unités arbitraires entre 0 et 65536. La conception du tableau a suivi la disposition des fonctionnalités 25:36 décrite dans la section protocole. L'analyse est affichée après une orientation appropriée du tableau, avec le coin supérieur gauche peuplé de la plus longue chaîne de caractéristiques fiduciales. Ici, les caractéristiques fiduciales contiennent la version ADN du 25mer et devraient, en principe, toujours donner un signal de fluorescence positif afin d'effectuer l'alignement de balayage et l'extraction des données. Le microarray hybride devrait apparaître uniformément lumineux, avec les bords de la zone de synthèse étant toutefois généralement plus lumineux que le centre (jusqu'à 50% plus lumineux). La grande quantité de séquences reproduites, réparties au hasard dans toute la zone, réduit l'impact des artefacts spatiaux. Ici, chaque séquence (ADN et ARN) a été synthétisée à 2 000 endroits aléatoires. Il y a généralement un faible bruit de fluorescence (arrière-plan), le 50 a.u., qui conduit à un rapport signal/bruit de l'ordre de 200:1 à 800:1 dans les essais d'hybridation. Après l'extraction des données, les intensités de fluorescence sont moyennes et tracées .
Il existe une variabilité significative des valeurs de fluorescence absolue entre les expériences. Ici, nous montrons les résultats de trois synthèses indépendantes utilisant les mêmes paramètres de fabrication et la même manipulation post-synthétique. L'ADN 25mer, lorsqu'il est hybridé à son brin d'ADN complémentaire étiqueté Cy3, donnera des signaux de fluorescence allant de 20 000 à 30 000, très rarement au-dessus ou en dessous. L'ARN 25mer, lorsqu'il est hybride au même complément d'ADN étiqueté Cy3, donnera des intensités de fluorescence sur les caractéristiques correspondantes allant de 15 000 à 20 000. Cependant, l'intensité de fluorescence des duplex ARN/ADN descendparfois occasionnellement en dessous de 8 000, lorsque les duplex CORRESPONDANTs d'ADN/ADN vont encore fluorer dans la gamme 20 000-30 000. Dans de tels cas, les résultats pour l'ARN peuvent être considérés comme sous-optimaux. Une défaillance de synthèse ou d'hybridation, que ce soit pour l'ADN ou l'ARN, sera immédiatement perceptible lors de la numérisation de l'absence évidente de fluorescence. Il existe de multiples possibilités pour la synthèse de l'ARN d'échouer ou de réussir partiellement et elles seront décrites dans la partie de discussion.
Déprotection, clivage et récupération de la bibliothèque Selon la complexité et la densité de la bibliothèque, la forme et le contour du tableau synthétisé peuvent être vus sans grossissement mais sous un éclairage approprié (Figure 4), avec l'ADN encore sous forme protégée. Après la déprotection avec EDA/toluène, et avant l'ajout d'eau afin de recueillir la bibliothèque clivée, la zone de synthèse contenant les oligonucléotides maintenant déprotégés peut se démarquer comme une zone hydrophile, lorsque le reste de la glissière de verre apparaîtra recouvert d'une couche hydrophobe turbide. L'observation directe de la zone de synthèse dépend de la superficie totale utilisée pour synthétiser les oligonucléotides : une plus grande utilisation de la zone de synthèse correspondra à une plus grande possibilité de distinction claire entre les régions hydrophiles et hydrophobes à la surface. Inversement, les bibliothèques synthétisées à l'aide de moins de miroirs et avec des fonctionnalités plus petites peuvent ne pas être immédiatement observables.
De même, la quantité d'ADN récupéré après le dessalement est directement proportionnelle à la surface totale utilisée pour la synthèse. Si toutes les caractéristiques sont utilisées pour la synthèse de l'oligonucléotide, le clivage et la procédure de récupération devraient donner entre 25 et 30 pmol d'ADN. Une utilisation de 10% de la zone de synthèse ne permettra donc qu'environ 3 pmol d'ADN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig1v2.jpg"> Figure 1 . Structures chimiques des phosphoramidites d'ADN et d'ARN utilisées dans la synthèse d'oligonucléotide par photolithographie de microarray. Les groupes de protection photosensibles standard nitrophenylpropyloxycarbonyl (NPPOC) au 5'-OH sont utilisés dans la synthèse régulière de microarray d'ADN et d'ARN à des fins d'hybridation. Pour la synthèse des bibliothèques d'ADN complexes, plus le benzyl-NPPOC (BzNPPOC) est préféré au 5'-OH, car BzNPPOC est éliminé deux fois plus vite que nPPOC, ce qui réduit considérablement le temps total de synthèse des microréseaux. Les oligonucléotides d'ADN pour des bibliothèques exigent également le couplage d'un monomère de dT cleavable à l'extrémité de 3' Ce monomère, qui porte une fonction ester succinyl, sera clivé pendant la déprotection, permettant à l'ADN d'être prélevé à partir de la puce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2.jpg"> Figure 2 . Exemple de masque comme fichier d'image envoyé à l'appareil micromiroir pendant l'exposition aux UV. Les pixels blancs correspondent à des miroirs qui seront inclinés dans la position «ON», reflétant la lumière UV sur la cellule de synthèse. Les pixels noirs correspondent aux miroirs "OFF", où la lumière UV sera réfléchie loin de la cellule. Les pixels blancs permettront donc l'accouplement de la phosphoramidite entrante suivante sur les oligonucléotides trouvés aux caractéristiques correspondantes sur les substrats de verre. Oligonucléotides synthétisés sur les entités dont les miroirs correspondants sont, dans ce fichier masque, les pixels noirs resteront cependant inertes lors du prochain événement de couplage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig3v2.jpg"> Figure 3 . Photographies de la photolithographie microarray optique et la configurationde synthèse . (A) Circuit optique pour l'exposition aux UV. La lumière UV de l'UV-LED est d'abord homogénéisée par un tuyau de lumière rectangulaire-section, puis réfléchit sur les micromiroirs. Les micromiroirs qui ont été inclinés dans une position "OFF" refléteront la lumière UV loin de la cellule de synthèse, mais les micromiroirs dans la position "ON" refléteront la lumière sur la cellule de synthèse, située au plan focal, en passant d'abord par un relais 1:1 Offner système d'imagerie. (B) La cellule de synthèse, une fois assemblée, se compose d'une diapositive forée placée en premier sur le bloc de quartz de la cellule, séparée par un joint PTFE épais (non montré). Une deuxième glissière non forée est ensuite placée au-dessus de la glissière forée, séparée par un mince joint PTFE. Un cadre métallique (non montré) maintient l'assemblage ensemble. (C). Pour la préparation de la bibliothèque, une fois que la cellule de synthèse est fixée au plan focal de la lumière UV entrante, la chambre située entre le bloc de quartz et la glissière forée est remplie d'une solution de 1 % de carotène dans le CH2Cl2. Pour ce faire, un tube d'entrées et de sortie supplémentaire est fixé au bloc de quartz et la solution orange s'écoule de la position la plus à droite vers la position la plus à gauche. Le flux de réactifs et de solvants pour la synthèse est représenté en flèches blanches. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig4.jpg"> Figure 4 . La zone de synthèse est généralement visible à l'œilnu. Ici, une bibliothèque d'ADN peut être vu sur la surface de verre juste après la synthèse, avec l'ADN encore sous forme protégée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig5v2.jpg"> Figure 5 . Les analyses d'hybridation aux séquences d'ADN et d'ARN 25mer synthétisées in situ sur des microréseaux. (A) Balayage de fluorescence de l'ADN et du microarray hybrides entiers. 25mer L'ADN et les oligonucléotides d'ARN sont hybridés à leurs brins complémentaires Cy3-étiquetés. Le tableau a été scanné avec un laser à une longueur d'onde d'excitation de 532 nm, à une résolution de 5 m. (B) Intensités de fluorescence (unités arbitraires) de l'ADN : ADN et ARN : duplex d'ADN dans trois expériences séparées. Les données vert clair pour les oligonucléotides d'ARN synthétisés in situ peuvent être considérées comme sous-optimales, par rapport à l'intensité de fluorescence des séquences d'ADN correspondantes. Les barres d'erreur sont SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig6v2.jpg"> Figure 6 . Représentation schématique de la procédure de déprotection, de clivage et de récupération pour les bibliothèques d'ADN synthétisées sur microréseaux. Les séquences d'ADN sont cultivées sur un nucléoside dT cleavable sensible à la base (indiqué dans la zone zoomée). Après synthèse, la déprotection des oligonucléotides d'ADN (les groupes de protection de base sont représentés comme des sphères rouges) dans edA/toluène laisse le matériau déprotégé électrostatiquement lié à la surface et peut ensuite être pipetted en appliquant une petite quantité de l'eau sur la zone synthétisée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59936/59936fig7v3.jpg"> Figure 7 . Spectre d'absorption représentatif (220 - 350 nm) d'une bibliothèque d'ADN clivée et dessalée contenant 4 000 séquences différentes, d'une longueur de 100.n. Un total de 940 ng d'ADN a été isolé à partir d'une synthèse de tableau unique, correspondant à 30 pmol du total d'ADN, ou 15 pmol par substrat en verre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59936/59936fig7large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59936/59936table1.jpg"> Tableau 1. Protocole de cycle représentatif pour le couplage/oxydation/photodeprotection de 5'-BzNPPOC-dA, en supposant que la phosphoramidite correspondante a été chargée sur le port "A". Le temps d'accouplement (en secondes) est affiché à la ligne " couple monomère ". Le temps de photodeprotection UV, correspondant ici à une énergie radiante de 3 J/cm2 (photochimie BzNPPOC), est calculé comme le temps écoulé entre les deux signaux de communication "Event 2 Out".
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59936/59936table2.jpg"> Tableau 2. Protocole de cycle représentatif pour le couplage/oxydation/photodeprotection de 5'-NPPOC-rA, en supposant que la phosphoramidite d'ARN correspondante a été chargée sur le port "A". Le temps d'accouplement (en secondes) est affiché à la ligne " couple monomère ". Le temps de photodeprotection UV, correspondant ici à une énergie radiante de 6 J/cm2 (photochimie NPPOC), est calculé comme le temps écoulé entre les deux signaux de communication "Event 2 Out".

Dans cet article, nous présentons et discutons de nouveaux développements dans la synthèse et les applications des microarrays d'acide nucléique fabriqués in situ. Plus précisément, nous montrons comment les protocoles de synthèse de l'ADN peuvent être étendus à l'ARN et comment les microréseaux peuvent être utilisés pour créer des bibliothèques d'acide nucléique récupérables.

Microréseaux d'ADN et d'ARN à haute densité - Synthèse photolithographique, hybridation et préparation des grandes bibliothèques d'acide nucléique

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Les microrésaires d’ADN et d’ARN sont très utiles pour étudier les interactions entre les acides nucléiques et les protéines, mais ils sont aussi une méthode pratique pour la préparation des bibliothèques de séquences. La photolithographie permet de synthétiser des centaines de milliers de séquences uniques en parallèle et est actuellement la seule méthode directe de synthèse de l’ARN sur les microrésages. La synthèse photolithographique in situ des microrésaires peut également être étendue aux oligonucléotides chimiquement modifiés, par exemple avec deux fluoro premiers d’acides nucléiques peptidiques.Voir le processus de fabrication et de manipulation du microarray peut aider à comprendre comment cette machinerie complexe a été développée à partir de la synthèse standard bien connue de l’ADN de phase solide. Commencez cette procédure par la conception du microrése et la fonctionnalisation des diapositives décrites dans le protocole textuel. Allumez le synthétiseur d’ADN UV LED et son ventilateur de refroidissement.Fixez un compteur d’intensité UV au point focal de la lumière UV entrante et allumez-la. Sur l’ordinateur, démarrez le logiciel WiCell Controller. Allumez et initialisez le dispositif de micromère.Chargez un fichier masque tout blanc en cliquant à droite sur DMD, puis en sélectionnant l’image de charge. Cliquez à droite sur l’icône UVS et sélectionnez obturateur UV ouvert. Lisez la valeur de puissance sur le compteur d’intensité et comptez 60 secondes.Après 60 secondes, relisez la valeur de puissance et notez les valeurs de début et de fin. Fermez l’obturateur en sélectionnant l’obturateur UV fermer et éteindre le compteur d’intensité. Calculer la valeur moyenne d’intensité UV en milliwatts par centimètre carré.Dans le logiciel WiCell, chargez le travail, la séquence et les fichiers de protocole dans leurs sous-fenêtres respectives, puis cliquez sur envoyer pour envoyer les fichiers séquence et protocole au synthétiseur d’ADN. Pour assembler la cellule de synthèse placer un joint perfluoroelastomer épais sur le bloc de quartz de la cellule. Placez ensuite une lame de microscope forée et fonctionnalisée sur le premier joint et vérifiez que les trous sur les glissières se connectent à l’entrée et au tube de sortie de la cellule de synthèse.Placez un deuxième joint mince en polytétrafluoroéthylène au-dessus de la glissière forée, entourant les deux trous. Enfin, placez une deuxième glissière fonctionnalisée mais non triée au sommet du deuxième joint. Maintenant, placez un cadre en métal à 4 vis sur le dessus de la cellule à double substrat assemblé Serrer la vis à la même force de serrage à l’aide d’un tournevis de couple.Attachez l’entrée et le tube de sortie au synthétiseur d’ADN. Amorcez la ligne de lavage de l’acétyonitrile et vérifiez l’écoulement approprié de l’acéonitrile à travers les substrats. Mesurer le volume d’acétylisation à la ligne de déchets après avoir traversé sept cycles d’amorçage de l’acétylisation.Ce volume doit être de deux millilitres. Fixez la cellule de synthèse au plan focal de la lumière UV entrante. Dans le cas de la préparation de la bibliothèque, fixez une entrée supplémentaire et une ligne de sortie à l’arrière de la cellule et remplissez la chambre arrière avec les deux millilitres de la solution de bêtacarotène.Démarrez la synthèse en cliquant d’abord sur Exécuter dans le logiciel WiCell. Lors de la première commande d’attente dans le dossier d’emploi, appuyez sur démarrer sur le synthétiseur d’ADN. Après la synthèse des microréseau réguliers, déconnecter la cellule du synthétiseur, et démonter la cellule.Utilisez un stylo diamant pour graver le numéro de synthèse sur les glissières en verre. Étchage le nombre sur le visage non synthétisé de chaque diapositive. Transférer les glissières dans des tubes de centrifugeuse de 50 millilitres et les conserver dans une zone desséchée jusqu’à nouvel usage.Après la synthèse des microrésaires de bibliothèque, égouttez d’abord la solution de bêtacarotène hors de la chambre puis lavez la chambre deux fois en coulant cinq millilitres de chlorure de méthylène à travers avant de s’écouler. Pour la dépprotection des microarres d’ADN, remplissez un bocal en verre souillé de 20 millilitres d’éthanol et de 20 millilitres d’EDA. Placez les microrésaisons à ADN uniquement verticalement dans le bocal, fermez le couvercle et laissez les glissières se déprodent pendant deux heures à température ambiante.Après deux heures, récupérer les glissières à l’aide d’une pince à épiler et les rincer soigneusement à l’eau double distillée. Séchez les glissières dans une centrifugeuse de microarray pendant quelques secondes avant de les stocker dans un dessiccateur. Pour la dépprotection du microrésexe arn, préparez une solution sèche de triéthylamine de 20 millilitres et d’acétyltrile de 30 millilitres dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres.Transférer une glissière de microrésais ARN dans le tube de centrifugeuse, fermer le couvercle et envelopper avec un film d’étanchéité en plastique. Agiter doucement le tube de centrifugeuse sur un shaker orbital pendant une heure et 30 minutes à température ambiante. Ensuite, retirez la lame et lavez-la deux fois avec 20 millilitres d’acétylonitrile sec avant de sécher dans une centrifugeuse de microrésais pendant quelques secondes.Après la première étape de déptection transférer la glissière d’ARN dans la solution hydrazine hydrate, fermer le couvercle et envelopper avec un film d’étanchéité en plastique. Après deux heures de secousses douces sur un shaker orbital, retirez la lame et lavez-la deux fois avec 20 millilitres d’acétylonitrile sec. Ensuite, séchez dans une centrifugeuse de microarray pendant quelques secondes.Si le microrése d’ARN contient également des nucléotides d’ADN, procédez à une troisième étape de dépprotection. Ajouter le microarray ADN/ARN à un tube de 50 millilitres contenant une solution EDA-éthanol après 5 min à température ambiante, retirer la lame et laver le microrése deux fois avec 20 millilitres d’eau stérile. Séchez la lame dans une centrifugeuse de microrésaille et conservez-la dans un dessiccateur.Dans un tube stérile de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre, préparez le tampon d’hybridation contenant de l’ADN étiqueté Cy3, tel que décrit dans le protocole du texte. Mélanger et vortex la solution. Placez soigneusement une chambre d’hybridation autoadhésive de 300 microlitres sur la zone de synthèse sur chaque glissière et pipet dans la solution d’hybridation.Couvrir les trous de la chambre de points adhésifs et envelopper toute la glissière dans du papier d’aluminium. Placez la glissade de microarray dans le four d’hybridation, couvrez-la et laissez-la pivoter doucement à la température d’hybridation sélectionnée pendant deux heures. Après deux heures, détachez la glissière, retirez le papier d’aluminium, pipette la solution d’hybridation, et arrachez soigneusement la chambre d’hybridation.Transférer les glissières dans un tube de centrifugeuse contenant 30 millilitres de tampon de lavage non rigoureux. Agiter vigoureusement pendant deux minutes à température ambiante. Transférer la glissière dans un tube de centrifugeuse contenant 30 millilitres de tampon de lavage rigoureux et agiter vigoureusement pendant une minute.Enfin, transférez la glissière dans un tube de centrifugeuse contenant 30 millilitres de tampon de lavage final. Agiter pendant quelques secondes. Séchez la lame dans une centrifugeuse en microarray.Maintenant, placez le microrése sec, zone de synthèse face vers le bas, dans le support de diapositives du scanner microarray. Pour déprotéger et fendre les bibliothèques d’ADN, plongez la glissière dans la solution de clivage, dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Fermer le tube et envelopper avec un film d’étanchéité en plastique, avant de tourner doucement dans un shaker orbital pendant deux heures à température ambiante.Après deux heures, retirer la lame et la laver deux fois avec 20 millilitres d’acétylonitrile scrupuleusement sec avant de la laisser sécher à l’air libre. À l’aide d’une pipette, appliquer 100 microlitres d’eau stérile sur la zone de synthèse désormais discernable. Pipet la solution de haut en bas à quelques reprises avant de la transférer dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Répétez le processus et combinez l’allongement du microarray dans le même tube. Évaporer la puce évacuez à la sécheresse, puis redissolvez-la en 10 microlitres de H2O sans nucléase. Voici les résultats d’un test d’hybridation effectué sur un microarray contenant les versions ADN et ARN d’une séquence de 25mer.L’analyse apparaît dans un format greenscale correspondant à l’excitation, spectre d’émission de fluorescence Cy3, avec l’intensité de fluorescence enregistrée dans les unités arbitraires. Il existe une variabilité significative des valeurs absolues de fluorescence entre les expériences. Les résultats de trois synthèses indépendantes utilisant les mêmes paramètres de fabrication et la même manipulation post-synthétique sont affichés.L’ADN de 25mer, lorsqu’il est hybridé à son brin d’ADN complémentaire étiqueté Cy3, donnera des signaux de fluorescence allant de 20 000 à 30 000, très rarement au-dessus ou au-dessous. L’ARN de 25mer, lorsqu’il est hybridé au même complément d’ADN étiqueté Cy3, donnera des intensités de fluorescence sur les caractéristiques correspondantes allant de 15 000 à 20 000. Cependant, l’intensité de fluorescence des duplex ARN/ADN tombera parfois en dessous de 8000, quand les duplex ADN/ADN correspondants seront encore fluorés dans la fourchette de 20 000 à 30 000.Dans de tels cas, les résultats de l’ARN peuvent être considérés comme sous-optimaux. Comme pour toute autre expérience basée sur l’ARN, il est important de se rappeler que les microrésiteurs d’ARN sont sensibles à la dégradation et doivent être manipulés dans des conditions stériles. Les bibliothèques d’acide nucléique prélevées dans les microrésaires peuvent être utilisées dans le séquençage de l’ADN ou de l’ARN ainsi que dans l’encodage d’informations numériques sur l’ADN.Le NED produit une lumière UV intense qui ne doit pas être directement regardée. Pour cette raison, il est conseillé de porter des lunettes de protection pendant que l’instrument est utilisé.

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