Fabrication de cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) pour l'immunothérapie adoptive

Le dé-lib-er-ating un produit de cellule T de CAR avec la compétence fonctionnelle qui engraft, prolifèrent et a l’activité cit-el-uric suivant l’infusion est un composant clé d’une immunothérapie adoptive efficace. Par exemple, dans les tumeurs solides, les cellules T de CAR elles peuvent pénétrer les tumeurs pleines et elles reçoivent la stimulation optimale d’antigène ;cependant, leur engraftment et prolifération globaux sont entravés dans les personnes. Le principal avantage de cette approche est qu’elle peut conserver la qualité des cellules T car ou l’état de différenciation des cellules T car sans générer de cellules T différenciées en phase terminale ou épuisées, ce qui aurait diminué la capacité proliférante ou une mauvaise fonction efficace après perfusion.

Cette technique peut être difficile parce que les cellules T sont très sensibles à leur concentration cellulaire ou à la surface des vaisseaux dans qui elles ont cultivé. Ainsi que leurs besoins métaboliques. Essentiellement, les cellules T doivent être maintenues heureuses tout au long du processus, sinon elles ne se développeront pas.

Pour commencer cette procédure, définissez des plats de culture de 6 puits. Activez les lymphocytes T humains primaires frais ou cryo-préservés en les mélangeant avec des perles magnétiques anti-CD3 CD28, à un rapport de trois perles par cellule T dans les puits des plats de culture. Culture des cellules T dans X-Vivo 15 milieu complété par le sérum humain normal d’AB, L-glutamine, he-pees et IL2.

Activez les cellules T à une concentration d’un million de cellules T par millilitre pendant l’expansion. Et les culture à 37 degrés Celsius avec 20% d’oxygène, 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité. Après la stimulation pendant la nuit, ajouter des supernatants lentiviraux aux cellules T activées.

Calculer le volume de supernatants nécessaires pour atteindre une multiplicité d’infection entre trois et cinq. Continuer à culturer les cellules en utilisant les mêmes conditions. Le troisième jour, recueillir un aliquot représentatif des cellules de cryo-préservation.

Avant la cryo-préservation, enlever les perles magnétiques en pipetting doucement et la séparation magnétique. Préparer le milieu de congélation, qui contient pbs avec 0,5%DMSO. Et rangez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.

Ensuite, centrifugez les cellules T à 300 fois G pendant cinq minutes. Jeter le supernatant et ajouter cinq millilitres de PBS. Centrifugez à nouveau les cellules à 300 fois G pendant cinq minutes et jetez le PBS.

Nous suspendons le pellant en un millilitre de cryo-conservation froide moyenne. Congeler les cellules T dans un contenant de congélation réfrigéré. Et stockez à moins 80 degrés Celsius pendant 48 heures.

Après cela, transférer les cellules congelées à l’azote liquide. Lavez le reste des cellules T une fois dans cinq millilitres de PBS pour éliminer tout vecteur résiduel. Centrifugeuse à 300 fois G pendant cinq minutes.

Puis, décanter le PBS et re-suspendre le pellant cellulaire dans le milieu de culture des cellules T à une concentration de 500.000 cellules par millilitre. Diviser les cellules T en deux cultures conçues 45 et neuf. Comptez les lymphocytes T par cytométrie d’écoulement à l’aide de perles de comptage et d’anticorps monoclonaux sur les CD4 et CD8 humains.

Ainsi qu’un colorant de viabilité. Redyez les cultures tous les deux jours pour les maintenir à une concentration de 500 000 cellules par millilitre. Le cinquième jour, comptez et cryo-conservez le jour cinq cultures comme décrit précédemment.

Le septième jour, laver 500 000 cellules dans PBS. Et les suspendre à nouveau dans 100 microlitres de fluorescence activé tampon de tri cellulaire. Ensuite, détectez l’expression des protéines de surface de la RCA par immuno-coloration avec une cytométrie fluorescente conjuguée anti-CAR 19 par cytométrie d’écoulement.

Le jour neuf compter et cryo-préserver le jour neuf cultures comme décrit précédemment. Dans cette étude, la fonction et l’efficacité des cellules T car qui sont récoltées à des intervalles variables dans toute la culture X-Vivo sont mesurées. En utilisant les méthodes décrites dans cette vidéo, les cellules T sont stimulées et développées pendant trois ou neuf jours.

Le profil de différenciation des cellules tel qu’indiqué par la stratégie de gating montré ici, est analysé en mesurant l’abondance de glycoprotéines distinctes exprimées à la surface de la cellule. Un changement progressif vers la différenciation effectrice est observé au fil du temps au cours de la culture X-Vivo. La fonction effectrice et la capacité proliférative des cellules T car en réponse à l’antigène sont ensuite évaluées.

Les cellules qui sont moins développées sont fonctionnellement supérieures à celles largement cultivés sur une plus longue durée. Dans un modèle humain de souris xénogreffe de TOUS la puissance des cellules T car récoltées à différentes périodes de temps est comparée. Les cellules de neuf jours montrent une réponse anti lukemique dépendante de la dose avec une réponse complète d’une valeur élevée de trois millions; et une perte d’efficacité pour la faible dose de 500 000.

Cependant, le jour trois cellules ont montré le contrôle persistant de tumeur dans les doses élevées et basses. Cette réponse est associée au nombre absolu de CAR-T 19 dans le sang périphérique des souris. Dans l’ensemble, ces résultats fournissent la preuve que les cellules T du RCA récoltées plus tôt surpassent celles récoltées plus tard.

Après cette procédure, des analyses de fonction supplémentaires telles que l’analyse d’hippocampe peuvent être exécutées pour mesurer leurs propriétés métaboliques telles que la consommation d’oxygène ou la capacité de spir-it-ed. Plusieurs cycles de restimulation peuvent également être effectués pour donner un aperçu de leur différenciation et de leur persistance des cellules T de la RCA. En utilisant ce travail comme base, nous et d’autres chercheurs sommes engagés dans des études pour abréger davantage le processus culturel.

Il peut également être étendu dans la conception des approches de base pour d’autres antigènes cancéraux. Il faut toujours prendre soin de vous lorsque vous travaillez avec le lentivirus. Mais même lorsque le lentivirus est conçu pour être incompétent de réplication.