Échafaudages d'impression de noyau/coquille pour l'ingénierie tissulaire des structures tubulaires

La fabrication de structures tubulaires est une approche prometteuse de l’ingénierie tissulaire des réseaux vasculaires, qui reste l’un des défis majeurs dans la culture de tissus épais in vitro. Le principal avantage de la technique core/shell est la simple production d’échafaudages creux en une seule étape, réduisant le temps de fabrication et permettant potentiellement l’impression directe avec des cellules. La préparation d’une formulation d’hydrogel avec les propriétés viscoélastiques appropriées, et le maintien d’un flux équilibré continu des matériaux de noyau/coquille est crucial pour l’impression 3D des échafaudages stables.

Pour commencer, remplissez la seringue stérile de 5 mL d’hydrogel fraîchement préparé. Remplissez une deuxième seringue de 5 mL, munie d’une aiguille émoussée de calibre 27, avec une solution de liaison croisée fraîchement préparée. Assembler la buse du noyau/coquille.

Insérez une aiguille à extrémité émoussée G27 comme composant central et attachez l’aiguille à l’aide de la vis. L’aiguille intérieure doit dépasser d’environ 1 mm de la buse extérieure de la coquille centrale. Connectez la seringue avec la solution de liaison croisée à l’aiguille G27 dans la buse et chargez la seringue dans l’une des montures d’extrème d’une imprimante 3D stérilisée à l’éthanol.

Montez la seringue avec de l’hydrogel dans la deuxième extrigeuse et connectez-la à la buse. Utilisez une serrure Luer pour connecter un tube court à l’entrée latérale Luer de la buse de noyau/coquille. Ajustez soigneusement manuellement l’alignement jusqu’à ce que la buse touche la surface avant de retirer la buse à une distance égale au diamètre de la buse extérieure.

Importez le code g de l’échafaudage généré et appuyez sur Lire pour lancer le processus d’impression. Après impression, retirez soigneusement le substrat avec l’échafaudage imprimé et versez la solution secondaire de liaison croisée sur l’ensemble de l’échafaudage. Incuber l’échafaud pendant une minute à température ambiante.

Pour détacher l’échafaud du substrat, tirez doucement l’échafaud sur le côté. Si l’échafaudage adhère fortement au substrat, insérez un bord tranchant entre les deux matériaux pour les séparer. Transférer l’échafaud dans un récipient frais.

Les UV stérilisent les deux côtés de l’échafaudage pendant 30 minutes de chaque côté. Ensuite, placez l’échafaud dans un milieu de culture cellulaire incolore et incuber l’échafaudage à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant au moins 24 heures. Le lendemain, récoltez le huvex d’une culture in vitro avec 0,25% trypsine pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Lorsque les cellules se sont détachées, arrêter la réaction enzymatique avec 3 mL de milieu de culture cellulaire fraîche et de recueillir les cellules par centrifugation. Suspendre à nouveau la pastille dans un milieu de culture frais contenant du phénol rouge et diluer les cellules à 3,4 fois 10 à la cinquième concentration endothéliale par millilitre de concentration. Chargez les cellules dans une seringue stérile de 5 mL munie d’une aiguille de calibre 27 et localisez un point d’entrée dans l’échafaudage.

Aligner l’aiguille avec la section droite du filament de l’échafaudage, percer soigneusement l’échafaudage à un angle bas. Confirmez que l’aiguille se trouve dans le filament creux du chenal et déprimez doucement le piston pour injecter environ 1 à 2 mL de suspension cellulaire dans l’échafaudage. L’écoulement de la suspension doit être visible à travers l’échafaud translucide.

Lorsque l’échafaudage entier a été rempli de suspension cellulaire, submergez l’échafaud dans le milieu de culture cellulaire fraîche, et retournez l’échafaud à l’incubateur de culture cellulaire pour un jusqu’à 10 jours. Pour l’imagerie vivante/morte à la fin de l’incubation, rincez l’échafaudage avec du PBS et utilisez une aiguille émoussée pour injecter soigneusement la solution vivante/morte dans l’échafaudage. Confirmez que la solution a rempli tout l’échafaudage et placez l’échafaud à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

À la fin de l’incubation, rincer l’échafaudage à l’aide de PBS et transférer délicatement l’échafaud sur une toboggan en verre. Les cellules colorées peuvent ensuite être observées dans les échafaudages au microscope à fluorescence. Dans cette section transversale d’un échafaudage fraîchement imprimé et post-traité, un canal creux clairement visible peut être observé dans le filament.

Même après 72 heures d’incubation dans le milieu de culture cellulaire à 37 degrés Celsius comme démontré, le filament conserve la structure creuse sur toute la longueur de l’échafaudage. Ici, un essai vivant/mort représentatif des cellules endothéliales après 48 heures de culture dans un échafaudage est montré. Les cellules vivantes peuvent être identifiées par leur signal fluorescent vert vif.

Cette technique est à la base de la fabrication en une seule étape d’échafaudages tubulaires creux et peut être améliorée par impression directe à l’aide de cellules incorporées dans la bio-encre.