Name: Utilisation de tissus congelés dans l’analyse de la comète pour l’évaluation des dommages à l’ADN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Apprenez à préparer des tissus congelés pour l'analyse de la comète afin d'évaluer les dommages à l'ADN. Cette méthode simplifie la logistique et minimise les erreurs techniques lors de la manipulation des échantillons.

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Les auteurs sont redevables à Lincoln Martin et Kelley Owens pour une assistance technique experte préparant et marquant des diapositives de comète et le Dr Carol Swartz pour avoir effectué des analyses statistiques. Les auteurs reconnaissent également les contributions de soutien des membres des programmes de toxicologie génétique, de toxicologie d’enquête et d’autopsie à l’ILS.

Les tissus ont été récoltés lors de la conduite d’études effectuées dans des installations accréditées par l’AAALAC dans les laboratoires contractuels du PNP conformément aux règlements sur les bonnes pratiques de laboratoire (21 CFR Partie 58) et aux protocoles d’utilisation des animaux approuvés par l’Animal institutionnel Comité de soins et d’utilisation (IACUC) dans chaque laboratoire.
1. Récolte et transformation des tissus
REMARQUE: Il est utile de préparer des tubes d’échantillon en double (p. ex., foie) ou de transférer environ la moitié d’un échantillon dans un autre tube de stockage (p. ex., du duodénum, estomac) pour permettre une réanalyse, si nécessaire. Afin de réduire au minimum la variabilité potentielle de l’échantillon à l’échantillon pour les tissus des voies intestinales, il est recommandé de prendre soin de goûter la même région de tissu par rapport à l’estomac pour chaque animal, et un échantillon soit divisé pour générer des échantillons en double. Des forceps en plastique sont recommandés pour le transfert de tissus collants tels que le cerveau. En option, les préparations de tissus hachées, grattées ou homogénéisées peuvent être filtrées pour obtenir des suspensions homogènes à cellule unique à l’aide d’une passoire cellulaire de 40 m fixée à un tube conique.
<ol><li>Retirez tout tissu, organe et débris raccordés attachés de l’organe.s) d’intérêt. Immédiatement après l’enlèvement, tamponner l’organe vigoureusement dans un bateau de poids de taille moyenne contenant 7 ml de solution froide de mouchoir fraîchement préparé(Mg,Ca et phénol rouge-libre Hank’s Balanced Salt Solution, 10% v /v DMSO, et 20 mM EDTA pH 7.5) pour enlever le sang résiduel et les débris.</li>
	<li>Transférer chaque organe dans un autre bateau à poids propre contenant une solution de mincing froide suffisante (7 ml) pour maintenir le tissu immergé, sur la glace, jusqu’à nouvel examen.</li>
	<li>Retirez une section de chaque organe d’intérêt et placez-la dans une cassette d’intégration. Fixer dans 10% neutre formaline tampon, garniture, et paraffine incorporé selon les procédures standard du laboratoire pour l’évaluation histopathologique future possible.</li>
	<li>Pour le foie, couper une section longitudinale de 5 mm du lobe gauche et balayez doucement dans la solution de mincing froide de 7 ml. Placer la bande de tissu dans un bateau à poids moyen propre contenant 7 ml de solution de mincing froid et maintenir sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à traiter davantage (étape 1.8 ou 1.11).</li>
	<li>Pour le duodénum, couper une portion de 10 mm du duodénum proximal à l’estomac. À l’aide d’une aiguille de 21 à 25 G, rincer pour enlever les débris et les bactéries.
	<ol>
<li>Insérer l’aiguille dans une extrémité du duodénum et rincer avec 1 ml de solution de mincing froid.</li>
		<li>Rincer l’autre direction en renversant le duodénum et en répétant avec une autre solution de 1 ml de mincing. Jetez l’aiguille.</li>
		<li>Trancher le duodénum ouvert et le rincer dans une solution de mincing de 7 ml avant de le mettre dans un bateau de poids de taille moyenne contenant 7 ml de solution de mincing propre; maintenir sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à traiter davantage (étape 1.8 ou 1.11).</li>
	</ol></li>
	<li>Pour le cerveau, il peut être utile de diviser d’abord le cerveau en deux hémisphères; un hémisphère peut être sauvé pour une histopathologie possible (voir étape 1.2).
	<ol>
<li>Disséquer la région du cerveau (s) d’intérêt et doucement swish dans 7 ml de solution de mincing froid.</li>
		<li>Transférer les tissus(s) dans un bateau à poids moyen propre contenant 7 ml de solution de mincing froid et maintenir sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à traiter davantage (étape 1.8 ou 1.11; notez que les petites régions comme le cervelet et l’hippocampe peuvent ne pas nécessiter d’autre rognage).</li>
	</ol></li>
	<li>Pour l’estomac
	<ol>
<li>Retirer et jeter le forestomach. Ouvrez l’estomac glandulaire et lavez-vous des aliments à l’aide d’un tampon de mâche froide de 7 ml dans un bateau de poids de taille moyenne.</li>
		<li>Retirez une bande de 5 mm de l’estomac glandulaire proximal au duodénum pour la fixation pour l’évaluation possible de l’histopathologie (voir étape 1.2).</li>
		<li>Placer le reste de l’estomac dans un tampon de mincing froid de 7 ml dans un bateau de poids de taille moyenne et incuber sur la glace pendant 15 à 30 minutes. REMARQUE: Cette étape d’incubation peut ne pas être nécessaire; cette étape a été incluse dans le protocole de validation jaCVAM, mais n’est pas mentionnée dans la directive de l’OCDE sur les tests8,9.</li>
		<li>Transférer l’estomac à un morceau propre de paraffine (ou plat Petri ou peser le bateau) et gratter doucement l’épithélium de surface deux fois ou plus à l’aide d’une lame de scalpel ou d’un grattoir en polytetrafluoroethene (PTFE) pour enlever les débris. Ramassez la muqueuse gastrique avec des forceps et rincez avec 1 ml de tampon de mincing froid à l’aide d’un tuyauterie. Transférer le tissu gastrique sur une surface ou un plat propre.</li>
		<li>Gratter soigneusement l’épithélium de l’estomac 4 à 5 fois (plus, si nécessaire) dans la solution de mincing (généralement 250 L/souris ou 500-1,000 L /rat) avec le dos d’une lame de scalpel ou un grattoir PTFE pour libérer les cellules. Optionnellement, rincez le tissu avec un volume environ égal de solution de mincing pour récupérer plus de cellules. Recueillir la solution de mincing contenant des cellules libérées à l’aide d’un tuyauterie et transférer dans un tube de microcentrifuge sur la glace.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour les échantillons de tissus de 1,5 ou 2,4 mm, couper une section de 3 à 4 mm de tissu hépatique ou de tissu cérébral ou 5 mm de dudodenum et transférer à un tube de microcentrifuge étiqueté de 1,5 ou 2,0 ml contenant 1 ml de solution de mincing froid. Hacher rapidement (30 s) avec des ciseaux de hache jusqu’à ce qu’ils soient finement dispersés, tout en gardant l’échantillon froid. L’échantillon doit sembler légèrement nuageux; cependant, il est courant que certaines pièces restent qui se déposeront au fond du tube.</li>
	<li>Pour utiliser le tissu frais, maintenir les tubes contenant du tissu haché ou des cellules épithéliales grattées sur la glace; utiliser le tissu pour préparer les glissements de comètes à moins d’environ 1 h de la récolte (décrite à la section 2).</li>
	<li>Pour la congélation des échantillons de tissus, immédiatement après le mincing ou la collecte de cellules épithéliales grattées
	<ol>
<li>Fixer le couvercle du tube et déposer le tube dans un flacon Dewar contenant de l’azote liquide; les tubes peuvent être maintenus dans l’azote liquide pendant la durée de l’autopsie (3 h).</li>
		<li>Récupérez les tubes à l’aide d’une louche et placez-les sur de la glace sèche pour les trier. Transférer les tubes dans une boîte de congélation sur de la glace sèche et entreposer la boîte dans un congélateur à -80 oC.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour la préparation de cubes de tissu congelés, couper plusieurs petits morceaux de tissu (4 mm de diamètre et 6 mm de longueur; Figure 1).
	<ol>
<li>Déposez-les directement dans un bateau de poids de taille moyenne ou tout autre navire approprié contenant de l’azote liquide.</li>
		<li>Attendez quelques secondes que les morceaux congelent complètement et transfèrent des cubes de tissus congelés individuels dans un tube de microcentrifuge étiqueté ou un cryotube maintenu sur de la glace sèche; ne laissez pas les morceaux s’agglutiner pendant le processus de congélation.</li>
		<li>Transférer les tubes dans une boîte de congélation sur de la glace sèche et entreposer la boîte dans un congélateur à -80 oC.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparation de la diapositive
<ol><li>
Pour les tissus hachés/grattés
	<ol>
<li>Maintenir les tubes contenant des tissus frais sur la glace humide.</li>
		<li>Placez les tubes de tissu congelé dans un bain d’eau à température ambiante jusqu’à ce que les échantillons soient complètement décongelés, tout en s’assurant qu’ils sont gardés froids. Transférer immédiatement les tubes sur la glace.</li>
		<li>Immédiatement avant de retirer les cellules pour le transfert à l’agarose (étape 2.3), mélanger délicatement chaque suspension cellulaire; pour les échantillons non filtrés, laissez les gros morceaux se déposer au fond du tube. Maintenir tous les tubes sur la glace jusqu’à ce que des toboggans aient été préparés pour tous les échantillons.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pour le tissu en cubes
	<ol>
<li>Récupérez les tubes contenant des cubes de tissus du congélateur de 80 oC et maintenez-le sur la glace sèche jusqu’à la préparation de la glissière.</li>
		<li>Aliquot 1 mL de Medium Merchant (0,14 M NaCl, 1,47 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 10 mM NaEDTA, pH 7,4) ou solution de mincing dans un tube de microcentruge étiqueté de 1,7 mL pour chaque échantillon et maintenir la glace.</li>
		<li>Travailler rapidement pour éviter le dégel des tissus, placer un cube de tissu dans l’extrémité ouverte d’un dispositif de mincing de tissu de température ambiante(figure 1). Plusieurs morceaux de tissu peuvent être utilisés; si nécessaire, le tissu congelé peut être coupé ou fissuré en petits morceaux à l’aide d’un mortier froid et d’un pilon pour réduire la taille du cube pour s’insérer dans l’appareil.</li>
		<li>Insérez rapidement un piston de seringue assorti à la taille dans l’appareil pour pousser le tissu à l’extrémité de maille qui devrait alors être placée dans le tube de microcentrifuge contenant la solution de mincing froid ; éviter de forcer le liquide à déborder le tube. Immerger l’extrémité de maille de l’appareil pour environ 5-10 s dans la solution de mincing froid pour permettre au tissu de décongeler complètement.</li>
		<li>Déprimez complètement le piston jusqu’à ce que les cellules soient vues extrudant à travers les pores de maille. Tirez ensuite le piston vers le haut d’environ 2,5 cm et appuyez à nouveau complètement; répéter le processus plusieurs fois jusqu’à ce que la solution de mincing devienne turbide.</li>
		<li>Si nécessaire, l’échantillon peut être concentré pour augmenter la densité cellulaire par centrifugation réfrigérée pendant 5 min à 1100 tr/min et l’ablation d’une partie du supernatant.</li>
		<li>Répétez le processus pour tous les échantillons à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire propre pour chaque échantillon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer 50 l de suspension cellulaire dans un tube contenant 450 L de 0,5 % de point de fusion bas à 37 oC. REMARQUE: Les volumes peuvent être ajustés, mais la quantité d’agarose doit être de 1 %.</li>
	<li>Préparer et marquer des diapositives comme décrit précédemment10,11.</li>
</ol>

<ol><li>van der Leede, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+and+data+interpretation+of+the+in+vivo+comet+assay+in+pharmaceutical+industry%3A+EFPIA+survey+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).</li>
<li>ICH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Conference+on+Harmonisation+of+Technical+Requirements+for+Registration+of+Pharmaceuticals+for+Human+Use+%28ICH%29+S2%28R1%29%3A+Guidance+on+Genotoxicity+Testing+and+Data+Interpretation+for+Pharmaceuticals+Intended+for+Human+Use%5BTitle%5D)+AND+%22ICH%22%5BJournal%5D)">International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) S2(R1): Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use.</a> ICH. , (2012).</li>
<li>EFSA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientific+opinion+on+genotoxicity+testing+strategies+applicable+to+food+and+feed+safety+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+Journal%22%5BJournal%5D)">Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment.</a> EFSA Journal. 9 (9), 2379(2011).</li>
<li>Lorenzo, Y., Costa, S., Collins, A. R., Azqueta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%2C+DNA+damage%2C+DNA+repair+and+cytotoxicity%3A+hedgehogs+are+not+always+dead%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead.</a> Mutagenesis. 28 (4), 427-432 (2013).</li>
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<li>Jackson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+freezing+tissues+and+cells+for+analysis+of+DNA+strand+break+levels+by+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Validation of freezing tissues and cells for analysis of DNA strand break levels by comet assay.</a> Mutagenesis. 28 (6), 699-707 (2013).</li>
<li>Recio, L., Kissling, G. E., Hobbs, C. A., Witt, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Comet+assay+dose-response+for+ethyl+methanesulfonate+using+freshly+prepared+versus+cryopreserved+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (2), 101-113 (2012).</li>
<li>Uno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JaCVAM-organized+international+validation+study+of+the+in+vivo+rodent+alkaline+comet+assay+for+detection+of+genotoxic+carcinogens%3A+II.+Summary+of+definitive+validation+study+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">JaCVAM-organized international validation study of the in vivo rodent alkaline comet assay for detection of genotoxic carcinogens: II. Summary of definitive validation study results.</a> Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 45-76 (2015).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OECD+Guideline+for+the+Testing+of+Chemicals%3A+In+Vivo+Mammalian+Alkaline+Comet+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22OECD%22%5BJournal%5D)">OECD Guideline for the Testing of Chemicals: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay.</a> OECD. 489, (2016).</li>
<li>Hobbs, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+evaluation+of+six+chemicals+of+known+genotoxic+potential+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Comet assay evaluation of six chemicals of known genotoxic potential in rats.</a> Mutation Research/Genetetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 786-788, 172-181 (2015).</li>
<li>Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Alkaline+Comet+Assay+and+Enzyme-modified+Alkaline+Comet+Assay+for+Measuring+DNA+Strand+Breaks+and+Oxidative+DNA+Damage+in+Rat+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 53833(2016).</li>
<li>Hobbs, C. A., Chhabra, R. S., Recio, L., Streicker, M., Witt, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+of+styrene-acrylonitrile+trimer+in+brain%2C+liver%2C+and+blood+cells+of+weanling+F344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity of styrene-acrylonitrile trimer in brain, liver, and blood cells of weanling F344 rats.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 53 (3), 227-238 (2012).</li>
<li>Hobbs, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+the+flavonol+anti-oxidants%2C+alpha-glycosyl+isoquercitrin+and+isoquercitrin%2C+for+genotoxic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of the flavonol anti-oxidants, alpha-glycosyl isoquercitrin and isoquercitrin, for genotoxic potential.</a> Food and Chemical Toxicology. 113, 218-227 (2018).</li>
<li>Pant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vehicle+and+positive+control+values+from+the+in+vivo+rodent+comet+assay+and+biomonitoring+studies+using+human+lymphocytes%3A+historical+database+and+influence+of+technical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Vehicle and positive control values from the in vivo rodent comet assay and biomonitoring studies using human lymphocytes: historical database and influence of technical aspects.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 633-642 (2014).</li>
</ol>

Ces travaux ont été soutenus par le Programme de recherche intra-muros des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) sous contrat HHSN273201300009C; toutefois, les déclarations, les opinions ou les conclusions qui y sont contenues ne représentent pas nécessairement les déclarations, les opinions ou les conclusions du NIEHS, des NIH ou du gouvernement des États-Unis.

Comme démontré précédemment7,12,13, correctement manipulé flash congelé tissu haché fournit de bons résultats dans l’essai de la comète. En fait, les valeurs d’ADN de queue de base pour les rats hachés congelés et le foie de souris préparés dans notre laboratoire sont généralement de 6 %, comme le recommande la ligne directricede l’OCDE pour les échantillons de foie de rat fraîchement hachés. De bons résu...

L’essai de comète est de plus en plus utilisé comme un moyen d’évaluer les dommages à l’ADN dans les cellules cultivées et les tissus exposés à des produits chimiques ou d’autres facteurs de stress environnementaux1. L’essai peut détecter des ruptures d’ADN à deux brins et à un brin, des lésions alkali-labile, et des ruptures à brin unique associées à la réparation incomplète de l’ADN. Le Conseil international pour l’harmonisation des exigences techniques pour les produits pharmaceutiques à usage humain (ICH) recommande un analyse de rupture de brin d’ADN tel que l’analyse de la comète comme un deuxième test pour compléter l’essai de micronuclée érythrocyte rongeur pour évaluer la génototoxicité in vivo et comme un test de suivi pour évaluer le mode d’action dans les organes cibles de l’induction tumorale2. L’Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) recommande l’analyse de la comète in vivo comme un test de suivi approprié pour étudier la pertinence d’un résultat positif dans un test de génototoxicité in vitro3. En 2014, une ligne directrice d’essai de l’OCDE a été approuvée pour l’essai de la comète rongeur, augmentant ainsi l’acceptabilité de l’essai pour l’utilisation dans les essais réglementaires du potentiel génotoxique. L’essai est basé sur la séparation électrophorétique des boucles d’ADN détendues et des fragments qui migrent des nucléoïdes des cellules lysed. Fondamentalement, les cellules simples sont incorporées dans l’agarose qui a été superposée sur des lames de microscope. Les diapositives sont ensuite immergées dans un tampon de lyse suivi d’une solution alcalin (pH et 13), qui permet à l’ADN nucléaire étroitement enroulé de se détendre et de se détendre. Les diapositives sont ensuite placées dans un champ électrique, ce qui stimule la migration de l’ADN chargé négativement vers l’anode, créant des images qui ressemblent à des comètes; la quantité relative d’ADN dans la queue de la comète par rapport à la tête de la comète est directement proportionnelle à la quantité de dommages à l’ADN; Le contenu de l’ADN dans la queue est généralement quantifié à l’aide d’un logiciel d’imagerie numérique.
Étant donné que l’analyse de la comète détecte l’ADN fragmenté, la quantification précise des dommages causés par l’ADN induit par l’exposition peut être confondue par la fragmentation de la chromatine associée à la nécrose ou à l’apoptose résultant d’une cytotoxicité ou d’un stress induit par le traitement. En outre, des dommages à l’ADN peuvent se produire à la suite d’une tonte mécanique ou d’un traitement inadéquat de l’échantillon4. L’importance de maintenir le tissu récolté réfrigéré avant la préparation de la diapositive pour minimiser le niveau de base des dommages à l’ADN a été démontrée précédemment5,6. De nombreux laboratoires préparent des glissades d’essai de comètes à partir de tissus frais; cependant, cela peut être difficile sur le plan logistique lors de la préparation de diapositives de plusieurs types de tissus par animal dans une étude avec un grand nombre d’animaux. De plus, cela pose un problème lorsque la préparation et l’analyse des diapositives doivent se produire dans un laboratoire éloigné, ce qui nécessite l’expédition d’échantillons. Par exemple, le Programme national de toxicologie des États-Unis comprend l’analyse de la comète comme élément de son programme de tests toxicologiques génétiques (https://ntp.niehs.nih.gov/testing/types/genetic/index.html) et intègre parfois l’essai dans des études de toxicité de 28 ou 90 jours de dose de répétition; cela nécessite la collecte de tissus par le laboratoire de la vie et le transfert d’échantillons à un autre laboratoire pour analyse. Pour ce faire, les morceaux de tissus sont hachés, et / ou les cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal sont grattés et les suspensions cellulaires sont flash congelés et stockés dans un congélateur pour l’expédition ultérieure et le stockage par le laboratoire de réception jusqu’à l’analyse7. Une bonne manipulation des échantillons est cruciale pour obtenir des données de haute qualité à l’aide de tissus congelés; cependant, la manipulation reproductible des échantillons de tissus pendant les autopsies exécutées par le personnel en constante évolution est difficile à contrôler, particulièrement dans les laboratoires dans la vie qui ne récoltent pas systématiquement des tissus pour l’essai de comète. La formation de recyclage du personnel de autopsie ou l’utilisation d’une unité mobile composée de personnel de laboratoire expérimenté pour recueillir des échantillons de tissus frais ou congelés est souvent trop coûteuse, pas faisable, ou tout simplement sous-évaluée.
Pour mieux assurer une génération constante d’échantillons de tissus de haute qualité pour le transfert vers un site éloigné pour l’analyse des analyses d’analyses d’analyses d’analyses de comètes, l’utilité d’une méthode publiée6 de préservation des tissus à partir de cubes de tissu congelés flash a été explorée. Dans cette méthode, des cubes de tissu congelés sont chargés dans un dispositif de mâchage des tissus en acier inoxydable(figure 1) qui est placé dans un tube de microcentrifuge contenant un tampon froid. Le cube de tissu est ensuite poussé à travers un petit maillage de jauge à l’extrémité de l’appareil. Forcer à plusieurs reprises la suspension de tissu par le tamis de maille dans les deux directions résultats plusieurs fois dans une suspension relativement uniforme de cellule simple. Les échantillons préparés par cette méthode comparaient favorablement en qualité aux échantillons de tissus frais et congelés préparés par le mincing. Comme avantage supplémentaire, contrairement aux échantillons hachés, les cubes de tissu peuvent être stockés congelés pendant de longues périodes de temps et donnent encore des résultats de haute qualité dans l’essai de la comète.

<table><tbody><tr><td>Cryoflacons Corning</td><td>Costar</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Feuilles de cire dentaire</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72670</td><td></td></tr><tr><td>Dissection (hachage) Micro-ciseaux</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-953-1B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hank</td><td>Gibco</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Teknova</td><td>P0315-10</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr> Tubes à microfuge <tr>à<td>faible point de fusion</td><td>Agarose Lonza</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>(1,7 mL)</td><td>Corning</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Na2 HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Buffered Formalin</td><td>Leica</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blades</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Piston (1 mL)</td><td>Fisher Scientific ou Vitality Medical</td><td>14-826-88 ; 8881901014</td><td>Seringue à tuberculine Becton Dickinson ou Monoject</td></tr><tr><td>Dispositif de hachage de tissus</td><td>NorGenoTech (Oslo, Norvège)</td><td>Aucun</td><td>Faible variabilité du diamètre observée qui peut affecter l’étanchéité du piston.</td></tr><tr><td>Pince à épiler, plastique</td><td>Alizés Direct</td><td>DF8088N</td><td>Nylon renforcé, non stérile, à pointe émoussée, autoclavable ;</td></tr><tr><td>tradewindsdirect.com Weigh Boats</td><td>Krackler Scientific/Heathrow Scientific</td><td>6290-14251B</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de tissus congelés dans l’analyse de la comète pour l’évaluation des dommages à l’adn

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

L’essai de comète gagne en popularité comme moyen d’évaluer les dommages à l’ADN dans les cellules et les tissus cultivés, en particulier après l’exposition à des produits chimiques ou à d’autres facteurs de stress environnementaux. L’utilisation de l’analyse de la comète dans les essais réglementaires pour le potentiel génotoxique chez les rongeurs a été motivée par l’adoption d’une ligne directrice d’essai de l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) en 2014. Les diapositives d’analyse de comète sont généralement préparées à partir de tissus frais au moment de l’autopsie; cependant, la congélation d’échantillons de tissus peut éviter les problèmes logistiques associés à la préparation simultanée de diapositives à partir de plusieurs organes par animal et de nombreux animaux par étude. La congélation permet également d’expédier des échantillons de l’installation d’exposition à un autre laboratoire pour analyse, et le stockage des tissus congelés facilite le report d’une décision de générer des données sur les dommages à l’ADN pour un organe donné. L’essai de comète alcalin est utile pour détecter les ruptures d’ADN à double brin et à brin liés à l’exposition, les lésions alkali-labile, et les ruptures de brin associées à la réparation incomplète d’excision d’ADN. Cependant, les dommages à l’ADN peuvent également résulter de la tonte mécanique ou des procédures de traitement inadéquates de l’échantillon, confondant les résultats de l’essai. La reproductibilité dans la collecte et le traitement des échantillons de tissus pendant les nécropsies peut être difficile à contrôler en raison de la fluctuation du personnel de laboratoire avec des niveaux variables d’expérience dans la récolte des tissus pour l’essai de la comète. Il est coûteux d’améliorer la cohérence grâce à une formation de recyclage ou au déploiement d’unités mobiles dotées d’un personnel de laboratoire expérimenté et n’est pas toujours possible. Pour optimiser la génération constante d’échantillons de haute qualité pour l’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’analyse d’essai de comète, une méthode pour homogénéiser des cubes de tissu congelés flash à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire personnalisé a été évaluée. Des échantillons préparés pour l’analyse de la comète par cette méthode ont comparé favorablement en qualité aux échantillons de tissus frais et congelés préparés en mâmant pendant l’autopsie. En outre, de faibles dommages à l’ADN de base ont été mesurés dans les cellules des cubes congelés de tissu après stockage prolongé.

Étude 1 Le foie a été récolté à partir de deux cohortes de rats mâles Sprague Dawley administré de l’huile de maïs pendant 4 jours, décalé par une semaine. Des diapositives ont été préparées à partir de tissus fraîchement hachés, de tissus hachés congelés et de tissus en cubes congelés traités dans la solution moyenne ou de mincing de Merchant à l’aide du dispositif de mincing tissulaire. Les tissus congelés obtenus auprès d’animaux de la première cohorte ont été évalués après l’entreposage du congéla...

Ce protocole décrit plusieurs procédures pour la préparation d’échantillons de tissus congelés de haute qualité au moment de l’autopsie pour une utilisation dans l’essai de la comète pour évaluer les dommages à l’ADN : 1) tissu haché, 2) cellules épithéliales grattées du tractus gastro-intestinal, et 3) tissu en cubes d’échantillons, nécessitant l’homogénéisation à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire.

Utilisation de tissus congelés dans l’analyse de la comète pour l’évaluation des dommages à l’ADN

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

Ce protocole est important parce que l’utilisation de tissus congelés simplifie la logistique lors de l’évaluation de plusieurs tissus, permet le transfert d’échantillons à un laboratoire éloigné pour analyse, et permet de reporter une décision d’analyser un tissu pendant des mois. Le principal avantage de cette technique est que l’utilisation de tissu cube congelé ne nécessite pas de personnel formé à l’essai de comète à l’autopsie, et minimise les possibilités d’erreurs techniques et de dommages mécaniques à l’ADN introduits lors de la manipulation de l’échantillon. Cette technique s’est utilisée dans le développement de médicaments précliniques, l’évaluation de l’innocuité des produits chimiques entrant dans l’environnement et les additifs alimentaires.Les tissus congelés peuvent être utilisés dans l’analyse de la comète pour évaluer le potentiel génotoxique, la réparation de l’ADN, les effets protecteurs contre les dommages causés par l’ADN induits par la chimiothérapie ou la radiothérapie, et pour la biosurveillance environnementale. Idéalement, les expériences devraient être conçues pour permettre le traitement de chaque échantillon de tissu jusqu’à l’étape de congélation avant que les organes prélevés sur le prochain animal ne soient disponibles pour le traitement. Les tissus congelés peuvent être poursuivis dans l’analyse de la comète pour évaluer le potentiel génotoxique, la réparation de l’ADN, les effets protecteurs contre les dommages causés par l’ADN induits par la chimiothérapie ou la radiothérapie, et pour la biosurveillance environnementale.Carole Bobbitt, formatrice technique, et Eileen Gilas, directrice du laboratoire de toxicologie d’investigation, serviront aujourd’hui de prosectors. Lincoln Martin, associé de recherche, et Amélie Ladesseur, technicienne en histologie, feront la démonstration de la manipulation des échantillons. Pour commencer cette procédure, retirez tout tissu, organe et débris de connexion attaché d’un organe d’intérêt.Swish immédiatement l’organe vigoureusement dans un bateau de pesage de taille moyenne contenant environ sept millilitres de froid, solution de hachage fraîchement préparé pour enlever le sang résiduel et les débris. Transférez l’organe dans un autre bateau de pesage propre contenant une solution de hachage à froid suffisante pour garder le tissu immergé et le maintenir sur la glace jusqu’à ce qu’il soit traité plus avant. Pour le foie, couper une section longitudinale de cinq millimètres du lobe gauche et swish doucement dans environ sept millilitres de solution de hachage froid.Placez ensuite la bande de tissu dans un bateau de pesage propre de taille moyenne contenant environ sept millilitres de solution de hachage froid et maintenez sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à traiter davantage. Retirez une section du foie et placez-la dans une cassette d’intégration. Effectuer la fixation, la coupe et l’intégration de paraffine selon les procédures standard de laboratoire pour l’évaluation future possible d’histopathologie.Pour le dudénome, couper une partie de 10 millimètres du dudénodum proximal à l’estomac. Insérez une aiguille de calibre 21 à 25 dans une extrémité du dudénon et rincez-la avec un millilitre de solution de hachage à froid pour éliminer les débris et les bactéries. Retournez le dudénocumum, rincez-le à nouveau avec un millilitre de solution de hachage et jetez l’aiguille.Couper le dudénodum ouvert et le rincer en environ sept millilitres de solution de hachage. Rincez ensuite le dudénocumum et maintenez-le en solution de hachage sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à traiter davantage. Couper et fixer une partie du dudénodène restant pour l’évaluation future possible d’histopathologie comme précédemment décrit pour le foie.Pour le cerveau, il peut être utile de diviser d’abord le cerveau en deux hémisphères, avec un hémisphère étant sauvé pour l’histopathologie possible. Disséquer les régions cérébrales d’intérêt, puis les rincer doucement, et de maintenir sur la glace dans la solution de hachage jusqu’à ce que prêt à traiter plus loin, comme décrit précédemment pour le foie et le dudénodum. Pour l’estomac, enlever et jeter le forestomach.Coupez l’estomac glandulaire et lavez-le à l’aide de nourriture en le swishing dans un bateau de pesage de taille moyenne contenant environ sept millilitres de tampon de hachage froid. Enlevez une bande de cinq millimètres de proximal glandulaire d’estomac au dudénon pour la fixation pour l’évaluation possible d’histopathologie comme décrit précédemment. Placez le reste de l’estomac dans un bateau de pesage de taille moyenne contenant environ sept millilitres de tampon de hachage froid et incubez sur la glace pendant 15 à 30 minutes.Après cela, transférez l’estomac dans un morceau propre de paraffine et utilisez une lame de scalpel ou un grattoir à cellules en plastique pour gratter doucement l’épithélium de surface au moins deux fois pour enlever les débris. Ramasser la muqueuse gastrique avec des forceps et utiliser une pipette pour le rincer avec un millilitre de tampon de hachage froid. Transférer le tissu de l’estomac rincé sur une surface ou un plat propre et ajouter une solution de hachage à froid.Utilisez l’arrière d’une lame de scalpel ou d’un grattoir à cellules en plastique pour gratter soigneusement l’épithélium de l’estomac quatre à cinq fois pour libérer les cellules. Ensuite, utilisez une pipette pour recueillir la solution de hachage contenant les cellules libérées, et transférez-la dans un tube de microcentrifugeuse sur la glace. Pour les échantillons de tissus de hachage, coupez une section de foie, de cerveau ou de dudénodenum et transférez-la dans un tube de microcentrifugeuse étiqueté contenant un millilitre de solution de hachage à froid.Utilisez des ciseaux hachants pour hacher rapidement l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit finalement dispersé, tout en veillant à ce que l’échantillon reste froid. L’échantillon devrait avoir l’air légèrement nuageux. Cependant, il est courant que certaines pièces restent qui se déposent au fond du tube.Pour utiliser le tissu pendant qu’il est frais, maintenez les tubes contenant les échantillons sur la glace. Pour congeler les échantillons de tissus, fixez le couvercle du tube immédiatement après le hachage ou la collecte et déposez le tube dans un flacon de Dewar contenant de l’azote liquide. À la fin de la récolte des tissus, utilisez une louche pour récupérer les tubes de l’échantillon et placez-les sur de la glace sèche pour trier.Transférer les tubes dans une boîte de congélation sur de la glace sèche et conserver la boîte dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Pour préparer des cubes congelés de tissu, coupez plusieurs petits morceaux de tissu et déposez-les individuellement directement dans un bateau de pesage de taille moyenne ou un autre récipient approprié contenant de l’azote liquide pendant quelques secondes. Une fois les morceaux complètement congelés, transférer les cubes de tissu congelés individuellement dans des tubes de microcentrifugeuse étiquetés, ou cryo-tubes, sur de la glace sèche.À la fin de la récolte des tissus, transférer les tubes dans une boîte de congélation sur de la glace sèche et conserver la boîte dans un congélateur à moins 800 degrés Celsius. Lorsque vous utilisez des tissus fraîchement hachés ou grattés maintenus sur de la glace mouillée, préparez des diapositives de comète dans l’heure qui suit la récolte. Lorsque vous utilisez du tissu haché ou gratté congelé, placez des tubes de tissu congelé dans un bain d’eau à température ambiante jusqu’à ce que les échantillons soient complètement décongelés tout en veillant à ce qu’ils soient maintenus au froid.Une fois les échantillons décongelés, transférez immédiatement les tubes sur la glace. Pour les tissus en cubes, récupérer les tubes contenant les cubes du congélateur et les conserver sur la glace sèche jusqu’à la préparation de la glissade. Aliquot un millilitre de milieu marchand ou une solution de hachage dans un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre étiqueté pour chaque échantillon et maintenir sur la glace.En travaillant rapidement pour éviter la décongélation, placez un cube de tissu dans l’extrémité ouverte d’un dispositif de hachage des tissus à température ambiante. Insérez rapidement un piston de seringue assorti de taille dans l’appareil pour pousser le tissu dans l’extrémité de maille, qui devrait alors être placée dans le tube de microcentrifugeuse contenant la solution de hachage froid. Immerger l’extrémité en maille de l’appareil pendant environ cinq à dix secondes dans la solution de hachage à froid pour permettre au tissu de décongeler complètement.Déprimez complètement le piston jusqu’à ce que les cellules soient vues extruder à travers les pores de maille. Puis tirez le piston vers le haut d’environ 2,5 centimètres et appuyez à nouveau complètement vers le bas. Répétez plusieurs fois, jusqu’à ce que la solution de hachage devienne trouble.Pour préparer les glissières, mélanger délicatement une suspension cellulaire et transférer 50 microlitres dans un tube contenant 450 microlitres de 0,5 % de faible point de fusion à 37 degrés Celsius. Préparez et marquez les diapositives telles qu’décrites dans le protocole de texte. Dans la première étude, le foie a été récolté à partir de deux cohortes de rats mâles sprague dawley véhicule de contrôle décalé d’une semaine.Les diapositives ont été préparées à partir de tissus fraîchement hachés, de tissus hachés congelés et de tissus congelés en cubes. Étant donné que l’OCDE a recommandé une limite supérieure pour l’ADN de la queue en pourcentage dans le foie de rat frais est de 6 %, ces résultats démontrent que l’une ou l’autre des méthodes de congélation peut bien fonctionner pour évaluer les tissus. Dans l’ensemble, les hérissons en pourcentage étaient parallèles à l’ADN de la queue en pourcentage, bien que les tissus congelés présentent une plus grande variabilité.Dans la deuxième étude, des souris femelles de B6C3F1 ont été administrées véhicule ou le méthane d’éthyle mutagenulfonate. Les résultats d’ADN de queue de pourcentage indiquent que le tissu de foie congelé comme cubes et plus tard traité utilisant le dispositif de hachage de tissu a donné des résultats très semblables à ceux obtenus pour le tissu fraîchement haché. Une augmentation statistiquement significative des dommages causés par l’ADN induit par le SME a été mesurée dans des échantillons de tissus traités par les trois méthodes.Dans la troisième étude, des échantillons de foie prélevés sur des souris femelles B6C3F1 dans une étude de toxicité chimique de 90 jours ont été analysés. Les dommages causés par l’ADN dans les tissus hachés congelés étaient élevés dans tous les groupes de doses, avec une variabilité importante entre les animaux et les animaux. Les résultats de l’ADN de la queue en pourcentage étaient corrélés avec les hérissons en pourcentage, ce qui indique que les hérissons ont contribué de façon substantielle au niveau élevé de dommages causés par l’ADN observé dans ces échantillons.En revanche, l’ADN endommagé et les hérissons en pourcentage étaient très bas dans le tissu en cubes congelé flash qui avait été préparé en parallèle avec les échantillons de tissus hachés. Ainsi, les cellules fortement endommagées se sont manifestées sous forme de hérissons dans les échantillons de tissus hachés n’étaient manifestement pas le résultat d’un processus biologique, mais ont probablement été introduites par perturbation mécanique, et, ou réchauffement des tissus pendant la procédure de hachage avant d’être congelés flash. Par conséquent, les données sur les tissus hachés ont été considérées comme peu fiables.En comparaison, des données de haute qualité ont été obtenues à partir du tissu congelé en cubes, même après un stockage prolongé. Il est essentiel de garder les tissus récoltés froids et humides, et de travailler rapidement pour congeler les échantillons. En outre, le tissu cube congelé doit être décongelé immédiatement avant l’étape d’homogénéisation.Les échantillons de tissus congelés conviennent à d’autres applications en aval, y compris, par exemple, les modifications de l’analyse de la comète pour détecter les dommages oxydatifs ou les liaisons croisées, et l’évaluation des changements dans l’expression des gènes. La prudence doit être de mise lors de la manipulation des lames de scalpel pour couper ou gratter les tissus, et lors de la manipulation de l’azote liquide pendant le processus de congélation.

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Génétique

La vidéo montre le test de comète pour détecter les dommages à l’ADN après une exposition à des agents nocifs. Dans des conditions alcalines, l’ADN se déroule et se dénature, et lors de l’électrophorèse, l’ADN intact et endommagé migre différemment dans le gel d’agarose, formant une structure en forme de comète. L’ADN non endommagé qui migre lentement forme la tête de comète circulaire, tandis que les fragments d’ADN endommagés qui migrent rapidement forment la queue de comète allongée.

Dosage des comètes pour la détection des dommages à l’ADN dans les cellules

Le test des comètes est un moyen efficace de détection de ruptures simple et double brin, y compris alcali-labiles sites et DNA-DNA/DNA-protein liens croisés sur l'ADN dans toutes les cellules, y compris les neurones hippocampiques. La méthode tire parti de la migration différentielle de l'ADN dans un champ électrique dû à des différences de quantité de dommages de l'ADN.

Le dosage de dommages de l&#39;ADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de l&#39;essai de comète

Nous décrivons ici une plate-forme qui permet la détection de test des comètes de dommages à l'ADN avec un débit sans précédent. Les motifs de dispositif de cellules de mammifères dans une puce et permet le traitement parallèle de 96 échantillons. L'approche facilite l'analyse des lésions de l'ADN au niveau de base, les dommages à l'ADN induits exposition et réparation de l'ADN cinétique.

CometChip: Une plate-forme à haut débit de 96 puits pour la mesure de dommages de l&#39;ADN dans les cellules humaines Microarrayed

Test des comètes mesure cassures de l'ADN induites par différents facteurs. Si tous les facteurs (sauf stress oxydatif) causant des dommages de l'ADN sont maintenus constants, le montant des dommages à l'ADN est un bon paramètre indirect de stress oxydatif. L'objectif de ce protocole est d'utiliser test des comètes pour la mesure indirecte du stress oxydatif.

Comet Assay comme une mesure indirecte de stress oxydatif systémique

Le test des comètes est une méthode efficace pour détecter les lésions de l’ADN dont l’ADN simple et double-brin se brise. Nous décrivons la comète neutres et alcalins des essais pour mesurer les lésions de l’ADN dans les cellules cancéreuses pour évaluer les effets thérapeutiques de la chimiothérapie.

Évaluation In Vitro dommages à l’ADN à l’aide du test des comètes

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Des outils pour étudier le rôle de l&#39;architecture Protein HMGB1 dans le traitement des Helix effets de distorsion, l&#39;ADN spécifique du site InterStrand Crosslinks

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Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes

Cet article illustre un protocole détaillé pour l’isolement de l’ADN et construction de bibliothèque de séquençage haut-débit de matériel d’herbier dont le sauvetage de l’ADN de très mauvaise qualité.

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