Identifier les mutations par fusion à haute résolution dans une population de riz de TILLING
2 septembre 2019
Dans cet article, nous présentons le protocole qui est décrit comme l'analyse de fusion à haute résolution (HRM)-basée Sur les lésions locales induites par la cible dans les génomes (TILLING). Cette méthode utilise des changements de fluorescence lors de la fusion du duplex d'ADN et convient au dépistage à haut débit de l'insertion/suppression (Indel) et de la sous-stition de base unique (SBS).
Il serait très utile pour les caractères reproducteurs qui sont techniquement difficiles ou coûteux à déterminer, tels que la résistance aux maladies, la teneur en minéraux. C’est une technique assez simple, rentable et à haut débit. Pour commencer, placez quatre disques de feuilles dans chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits.
Ajouter 50 millilitres de solution tampon A dans chaque puits. Congeler la plaque dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, décongelez la plaque à température ambiante.
Incuber à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajouter 50 microlitres de tampon B à chaque puits, et bien mélanger par vortex. Centrifuger la plaque pendant une minute à 1500 fois g.
Recueillir le supernatant comme ADN pour PCR. Tout d’abord, utilisez le supernatant d’ADN à partir d’un modèle ainsi que pcr pour optimiser la température d’annealing. Ajoutez des réaccents et un microlitre de supernatant d’ADN dans chaque puits PCR.
Placez les tubes PCR dans un bloc thermique capable de gradient et ajustez le programme de chauffage selon le manuscrit pour déterminer la température d’annealage optimale pour chaque fragment cible. Effectuer l’électrophoresis pour le produit PCR sur 1% gels agarose pour examiner les amplicons. Déterminez la température d’annealage optimale qui permet l’amplification spécifique du fragment cible.
Pour effectuer l’analyse de la MRH, combinez des reagents, y compris un microlitre de 10 fois le colorant fluorescence et un microlitre du supernatant d’ADN dans chaque puits de plaques compatibles avec la MRH. Dans chaque assiette, inclure un échantillon parent de type sauvage et un contrôle négatif sans ADN. Ajouter une goutte d’huile minérale à chaque puits pour éviter l’évaporation.
Ensuite, sceller la plaque avec un film adhésif, et centrifugeuse à 1000 fois g pendant une minute. Exécutez le PCR à l’aide de la température d’annealage optimisée. Maintenant, retirez le film adhésif de la plaque, et insérez la plaque dans une machine de MRH.
Dans le logiciel, sélectionnez New Run à partir du menu du fichier, ou appuyez sur le bouton Exécuter en haut de l’écran. Spécifiez les températures de départ et de fin de la fonte de 55 à 95 degrés Celsius. Sélectionnez des échantillons pour l’analyse de fusion à haute résolution et excluez les échantillons similaires au contrôle négatif.
Normaliser les courbes de fusion pour avoir le même début et la même fin de fluorescence. Confirmez visuellement que les curseurs à température maximale minimale et inférieure inférieure se trouvent dans une région des courbes. Gardez le delta F, différence de fluorescence, niveau au réglage par défaut de 05.
À partir de la liste de sélection des normes, sélectionnez la variante commune par rapport à la variante et choisissez la sensibilité normale. Sélectionnez H12 pour utiliser le type sauvage comme commande. Les échantillons d’une valeur delta F supérieure à 05 sont considérés comme contenant des plantes mutantes.
Ensuite, à l’aide d’une méthode CTAB, extraire l’ADN de chacune des quatre plantes de la piscine mutante avec la courbe de fusion significativement différente du type sauvage. Après quantification à l’aide d’un spectrophotomètre, ajuster l’ADN avec le NanoDrop 2000 à une concentration finale d’environ 25 nanogrammes par microlitre. Ajoutez 0,4 microlitres d’amorces PCR dans l’échantillon d’ADN dans les tubes PCR, placez-les dans un cycleur thermique et ajustez le programme pour amplifier le fragment cible.
Ensuite, envoyez les produits PCR à une entreprise pour séquençage. Après séquençage sanger, comparer la lésion moléculaire en comparant les séquences entre la plante M2 et le type sauvage. Dans cette étude, la numérisation et l’analyse des semis M2 pour les mutations dans les gènes OsLCT1 ou SPDT ont montré que la plupart des échantillons présentaient des courbes de fusion pas significativement différentes du type sauvage avec delta F inférieur à 05.
Les mutants ont montré des courbes de RMH significativement différentes avec des delta F supérieurs à 05 à des températures de 90 à 92 degrés Celsius et 81,5 à 83,5 degrés Celsius, respectivement. Le type de mutation et la position sur les gènes de 4560 semis M2 ont été confirmés par les chromatogrammes de séquençage. Un emplacement hétérozygote avec une mutation de G à A à 4,304 paires de base d’OsLCT1 a été identifié.
Un nucléotide unique Une insertion est apparue aux 4 240 paires de base d’OsLCT1, et une suppression trinucléotide TTC a été observée à la position de 5 948 à 5 950 paires de base de SPDT. J’optimise le PCR avant l’analyse HRM. Le colorant dans le gel est un peu nocif.
N’oubliez pas de mettre des gants lors de l’exécution du gel.
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Aperçu
Cet article présente un protocole d'analyse par fusion haute résolution (HRM) fondé sur la méthode Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING). Cette méthode est efficace pour le criblage à haut débit des mutations par insertion/suppression (Indel) et par substitution d'une seule base (SBS).
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- génomique
- amélioration des plantes
- biologie moléculaire
Contexte
- L'analyse de fusion à haute résolution est une technique utilisée pour détecter des variations génétiques.
- Le TILLING permet d'identifier des mutations de manière économique.
- Cette méthode est particulièrement utile pour les caractères difficiles à évaluer.
- Elle peut être appliquée dans divers domaines, notamment l'agriculture et la génétique.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole d'utilisation de la HRM dans le TILLING.
- Faciliter le criblage à haut débit des variations génétiques.
- Améliorer l'efficacité de l'identification des mutations liées à des caractères importants.
Méthodes utilisées
- Préparation de disques foliaires dans une plaque PCR de 96 puits.
- Application de la solution tampon A dans chaque puits.
- Congélation et décongélation de la plaque PCR pour préparer les échantillons.
- Surveillance des variations de fluorescence lors de la fusion de l'ADN.
Résultats principaux
- Le protocole permet une détection efficace des Indels et des SBS.
- La capacité de haut débit améliore l'efficacité du criblage.
- Méthode rentable, adaptée à diverses applications de recherche.
- Facilite l'amélioration génétique pour des caractères tels que la résistance aux maladies.
Conclusions
- Le TILLING basé sur la HRM est un outil précieux en recherche génétique.
- La méthode simplifie le processus d'identification des mutations.
- Elle peut grandement contribuer au développement de variétés végétales améliorées.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Le TILLING basé sur la fusion à haute résolution (HRM) permet une détection haut débit et rentable des substitutions de base unique ainsi que des mutations d'insertion/suppression dans les génomes végétaux. Cette approche soutient la validation précoce des cibles en fournissant des données quantitatives de criblage des mutations qui éclairent les décisions d'amélioration génétique pour des caractères complexes tels que la résistance aux maladies et la teneur en nutriments. Son intégration avec une extraction d'ADN simple améliore l'efficacité du flux de travail dans les voies de découverte.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à la détection de mutations induites dans des gènes cibles comme OsLCT1 et SPDT.
- Valeur opérationnelle : Utilise l'analyse HRM après PCR sans traitement supplémentaire, réduisant ainsi le temps de manipulation et augmentant le débit.
- Valeur prédictive : Les valeurs Delta F supérieures à 0,5 identifient les échantillons mutants, facilitant une sélection fiable des hits pour la validation en aval.
Développement de tests et criblage
- Préparation du test : Les plaques compatibles avec l'analyse HRM recouvertes d'une couche de paraffine empêchent l'évaporation et garantissent une acquisition reproductible des courbes de fusion.
- Résultat quantitatif : Les courbes de fusion normalisées et les mesures de delta F permettent une comparaison objective entre les échantillons de type sauvage et les variants.
- Extensibilité : Le format en plaque de 96 puits permet le criblage de milliers de plantules M2, comme démontré avec 4 560 échantillons.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Les mutations confirmées par séquençage de Sanger fournissent des données sur les lésions moléculaires permettant de relier le génotype au phénotype dans les programmes de sélection.
- Alignement des biomarqueurs : Les SNPs et les indels identifiés servent de marqueurs détectables pour l'association à des caractères dans l'amélioration des cultures.
- Réduction des risques : La détection précoce des mutations réduit l'incertitude concernant l'hérédité des caractères avant les essais au champ.
Intégration des pipelines et des flux de travail
HRM-TILLING s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique en permettant le criblage de mutations après mutagenèse et avant la validation phénotypique, soutenant ainsi l'identification de candidats prometteurs en biotechnologie agricole.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses en identifiant des variants alléliques dans des gènes cibles grâce à une analyse sensible des courbes de fusion.
- Dépistage : Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs en HRM, permettant de normaliser la détection des mutations au sein de grandes populations.
- Analyse : Un seuil Delta F (>0,5) offre une base statistique pour distinguer les échantillons mutés des échantillons de type sauvage.
- Recherche translationnelle : Les mutations confirmées par séquençage permettent la corrélation génotype-phénotype afin d'aider à la sélection de caractères souhaités.
- Réutilisation en milieu professionnel : Le protocole peut être adapté à différents gènes cibles et espèces culturales autres que le riz, favorisant ainsi la réutilisation de la plateforme.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Détecte à la fois les SNPs et les indels avec une haute sensibilité, réduisant ainsi les faux négatifs lors du criblage des mutations.
- Valeur opérationnelle : Une extraction d'ADN simple, sûre et rapide (SSR) combinée à la HRM minimise l'utilisation de réactifs et les besoins en équipements.
- Valeur stratégique : Permet de prendre plus rapidement des décisions d'orientation (aller ou ne pas aller) dans les programmes de sélection en identifiant rapidement des variants alléliques utiles.
- Impact sur le portefeuille : Renforce la confiance dans la progression des lignées portant des mutations validées, réduisant ainsi le risque d'échec en phase avancée.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une connaissance de la configuration de l'instrument de HRM et de la normalisation des courbes de fusion.
- Requiert un accès à des thermocycleurs à gradient pour l'optimisation de la température d'hybridation.
- Dépend de plaques compatibles avec la HRM et de colorants fluorescents pour une analyse de fusion précise.
- Exige une capacité de séquençage pour confirmer les mutations identifiées par HRM.
- Les performances peuvent varier selon la longueur de l'amplicon et la teneur en GC, nécessitant une optimisation spécifique à la cible.
