Extraction de cortisol à partir de matrices de nageoires d'esturgeon et de mâchoires

Notre méthode introduit un nouvel indicateur de stress alternatif qui pourrait être une plate-forme pour de nombreuses études futures pour mesurer le cortisol dans de nouvelles matrices non plot et cheveux. Les avantages de cette technique sont sa simplicité et sa capacité à être utilisé pour évaluer les niveaux de stress, même chez les animaux abattus. L’établissement d’une relation entre des niveaux élevés de cortisol et des animaux ou des humains en bonne santé utilisant cette technique peut aider au diagnostic de certaines maladies.

Cette méthode peut également être utilisée pour étudier des échantillons biologiques vieux de plusieurs siècles tels que ces vieux fossiles pour évaluer les niveaux de stress dans la durée de vie de l’échantillon. Pour l’extraction du cortisol, peser 300 plus ou moins 10 milligrammes de chaque échantillon sur une échelle d’analyse numérique avec une précision de 0,0001 avant de placer les échantillons dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres. Ajouter trois millilitres d’isopropanol à chaque tube d’échantillon et faire pivoter les tubes à 80 rotations par minute pendant 2,5 minutes pour laver le cortisol et éliminer toute contamination externe potentielle.

Après le dernier lavage, sécher à l’air les échantillons à température ambiante pendant sept jours avant de laver les échantillons trois fois de plus comme démontré à l’aide d’eau fraîche ultra pure pour chaque lavage. Pesez 75 plus ou moins cinq milligrammes d’échantillon séché d’aileron ou d’os de mâchoire et utilisez un batteur de perle pour finalement moudre l’échantillon à 50 hertz pendant 32 minutes. Ensuite, livrer 1,5 millilitres de méthanol à chaque tube d’aileron ou de mâchoire en poudre et placer les échantillons sur un rotateur à tube à 40 rotations par minute pendant 18 heures à température ambiante.

Après l’extraction du cortisol, sédimenter les tissus de l’échantillon par centrifugation. Et transférer le haut d’un millilitre du cortisol jaunâtre et organique contenant de la couche de chaque échantillon dans des tubes micro-centrifugés individuels de 1,5 millilitre. Séchez les échantillons de cortisol à 38 degrés Celsius dans une hotte de fumée pendant la nuit pour évaporer le méthanol.

Le lendemain matin, ajouter 400 microlitres de PBS à chaque tube et vortex et centrifugeuse les échantillons pour recueillir le cortisol. Pour l’analyse ELISA, chargez 25 microlitres de chaque échantillon de cortisol standard extrait et contrôlez en double dans les puits appropriés d’une plaque ELISA de 96 puits. Chargez 25 microlitres de diluant Assay dans deux puits pour servir de zéro et dans chaque puits de liaison non spécifique.

Mélanger 15 microlitres d’enzymes conjuguées avec 24 millilitres de diluant Assay et ajouter 200 microlitres de conjugués à chaque puits. Mélanger la plaque sur un rotateur pendant cinq minutes à 500 rotations par minute. Suivi d’une incubation d’une heure à température ambiante.

À la fin de l’incubation, laver la plaque quatre fois avec 300 microlitres de 1x Wash Buffer par puits. Inverser rapidement la plaque sur l’évier après chaque lavage pour jeter le tampon et gonfler la plaque sur une pile de serviettes en papier. Après le dernier lavage, ajouter 200 microlitres de solution de substrat TMB à chaque puits et placer la plaque sur le rotateur pendant cinq minutes à 500 rotations par minute.

Après le mélange, incuber la plaque pendant 25 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, ajouter 50 microlitres de solution d’arrêt à chaque puits. Et mélanger le contenu de la plaque sur le rotateur pendant trois minutes à 500 rotations par minute ou jusqu’à ce que tous les puits soient passé du vert au jaune.

Ensuite, lisez la densité optique des échantillons et utilisez le logiciel de micro plaque pour convertir les niveaux de cortisol dans chaque échantillon en picogrammes par milligramme. Dans cette analyse représentative, les niveaux de cortisol avaient tendance à être plus élevés dans les échantillons d’ailerons lavés à l’isopropanol que chez ceux lavés à l’eau, mais aucune différence significative dans les niveaux de cortisol des nageoires n’a été observée chez les espèces d’esturgeons. Il n’y avait pas d’interaction significative entre les solvants de lavage et les espèces d’esturgeons.

L’examen du cortisol des mâchoires de H.Huso pour déterminer si les mâchoires d’esturgeon pourraient être employées comme matrice alternative aux ailerons a indiqué que le solvant de lavage n’a eu aucun effet significatif sur le niveau de cortisol mesuré dans l’esturgeon de H.Huso. En outre, les données ont révélé une forte similitude entre les nageoires de trois espèces d’esturgeons testées et chez les mâchoires H.Huso. Il est important d’utiliser le batteur de perles pour moudre les échantillons en poudre fine et d’utiliser un kit d’essai commercial approprié ELISA pour une mesure réussie du cortisol.

Cette méthode peut également être utilisée pour détecter le cortisol dans les dents et d’autres matrices dures, car les mesures du niveau de cortisol fournissent des informations importantes sur la façon dont l’environnement affecte la biologie animale. La méthode pourrait être utilisée comme une nouvelle approche pour évaluer les niveaux de cortisol dans les dents humaines de lait infantile et dans l’endocrinologie pédiatrique, la biologie psycho, les études comportementales, archéologiques et médico-légales.