Présentation d'un Knockout Génique Directement dans la phase Amastigote de Trypanosoma cruzi à l'aide du système CRISPR/Cas9

Il est difficile d’utiliser le stade d’infection hôte de T.cruzi dans les expériences parce que l’amastigote est un parasite intracellulaire oblitérateur. Notre technique de culture permet à l’amastigote de se répliquer temporairement à l’extérieur de la cellule hôte, afin que nous puissions effectuer des expériences directement sur cette étape cliniquement pertinente du parasite. Yukie Akutsu, technicien de notre institut, démontrera la procédure.

Maintenir une co-culture parasite hôte selon les instructions manuscrites. Lorsque le parasite exprimant cas9 est prêt pour la différenciation, recueillir le supernatant dans un tube conique, et vérifier la qualité de l’échantillon sous un microscope. S’il y a un nombre significatif d’amastigotes extracellulaires, effectuez une procédure de natation pour isoler les trypomastigotes.

Faites tourner le mélange de trypomastigotes et d’amastigotes pendant quinze minutes sous forme de 2 100 fois G.Puis jetez la plupart des supernatants, en laissant 0,5 à 1 millilitre de milieu dans le tube. Capuchon lâchement le tube, et incuber la pastille à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures, ce qui permettra aux trypomastigotes actifs de nager hors de la pastille. Après l’incubation, transférer le supernatant avec les trypomastigotes dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.

Tournez-le vers le bas, et resuspendez la pastille avec 5 millilitres de DMEM. Transférez le parasite dans un flacon de culture T-25 et incubez le flacon à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié. Environ 95% des parasites se différencieront en amastigotes après 24 heures.

Centrifugeuse la culture des amastigotes extracellulaires pendant 15 minutes à 2100 fois G, et jeter le supernatant. Resuspendre la pastille avec tampon d’électroporation contenant fourni solution de supplément à une densité cellulaire finale d’une fois 10 à la 8e cellules par millilitre. Aliquot 100 microlitres des parasites résuspendus en tubes de microcentrifugeuse de 1,5 litre.

Ajouter ensuite de cinq à 10 microgrammes d’ARN Guide et mélanger délicatement au pipetage. Transférer le mélange dans une cuvette d’électroporation de deux millimètres et appliquer une impulsion avec le dispositif d’électroporation. Ensuite, transférez le contenu de la cuvette dans un flacon T-25, contenant cinq millilitres de milieu LIT préchauré, laissez le bouchon en vrac et incubez le flacon à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone.

Surveillez la croissance cellulaire soit par la poursuite de la culture axenique, soit sous forme d’amastigotes intracellulaires après l’infection des cellules hôtes. Si vous surveillez la croissance cellulaire sous forme d’amastigotes axeniques, secouez doucement le flacon pour résusquer les amastigotes extracellulaires dans la solution, et mélangez 20 microlitres de la culture avec un microlitre de solution d’iodure de propidium dans un tube de microcentrifugeuse. Il est important de ne pas laisser le flacon de culture à l’extérieur de l’incubateur plus longtemps que nécessaire parce que la température est l’un des facteurs qui permet la prolifération axenique de l’amastigote.

Appliquez l’échantillon sur un hémocytomètre et observez-le au microscope à fluorescence. Comptez ensuite le nombre d’amastigotes viables qui ne sont pas tachés par l’iodure de propidium. Pour surveiller la croissance des cellules KNOCK-OUT sous forme d’amastigotes intracellulaires, les cellules de l’hôte de graines 3T3 dans une plaque de 12 puits avec DMEM.

Un jour après l’électroporation recueillir les amastigotes KO par centrifugation, jeter le supernatant, et resuspendre les parasites avec deux millilitres de DMEM. Retirez le milieu de la culture cellulaire hôte et ajoutez les amastigotes résuspendus. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone pendant deux jours, ce qui permettra aux amastigotes d’établir une infection.

Après les deux jours, laver les amastigotes extracellulaires à l’extérieur des cellules hôtes avec DMEM, et ajouter d’autres DMEM frais. Poursuivre l’incubation pendant deux jours supplémentaires, puis visualiser les noyaux des cellules hôtes et les amastigotes intracellulaires. Il a été démontré que les amastigotes T.Cruzi transfectés avec l’ARN guide contre le gène essentiel TcCGM1 montrent un défaut de croissance significatif par rapport à un groupe témoin.

Lors de la surveillance de la croissance sous forme d’amastigotes intracellulaires, la fraction des noyaux hôtes associés aux noyaux T.Cruzi est significativement plus faible dans le groupe knockout TcCGM1 par rapport au contrôle. Au contraire, la transfection de l’ARN guide contre l’une des protéines de tige paraflagellar TcPAR1 n’affecte pas significativement la croissance cellulaire après quatre jours de culture axenique ou inhiber la croissance des amastigotes intracellulaires. Cependant, cinq jours après l’infection, le nombre de trypomastigotes qui émergent de la cellule hôte est significativement plus faible dans tcpar1 knockout co-culture par rapport à la co-culture de contrôle.

En outre, les trypomastigotes différenciés à l’intérieur de la cellule hôte dans le groupe témoin sont apparus plus actifs que ceux du groupe knockout. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier les effets des gènes exogènes au stade de l’amastigote au lieu de transfecter l’ARN guide en amastigote exprimant Cas9, vous pouvez transfecter le plasmide en amastigote de type sauvage pour exprimer un gène exogène.