A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Cette méthode rentable peut trouver de larges applications dans le diagnostic moléculaire et le dépistage des troubles liés au S FXS et à l’X fragile. Il est rapide dans le délai d’exécution et moins d’investissement dans l’équipement. Notre analyse basée sur pcr peut faciliter la classification de l’éventail complet des désordres FXS et fragiles X-associés, y compris intermédiaire, prémutation, et mutation complète avec la robustesse et le temps rapide de rapport.

La procédure sera démontrée par Weng Chua de PerkinElmer Singapour. Commencez par enlever le mélange tampon PCR, échantillon de diluant et échantillons d’ADN du congélateur de 20 degrés Celsius, et les laisser à température ambiante pendant 20 à 30 minutes pour décongeler. Avant d’utiliser les reagents, vortex et les faire tourner brièvement vers le bas.

Mesurez la concentration de l’échantillon d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre et, au besoin, diluez-le à 25 nanogrammes par microlitre avec un échantillon diluant. Étiquetez les puits d’une plaque PCR pour identifier les échantillons d’ADN de référence et testés et calculer le nombre de réactions nécessaires pour l’essai, la référence et les échantillons de contrôle négatifs. Préparez le mélange principal pcr en combinant 15 microlitres de mélange tampon PCR à 0,6 microlitres de diluant échantillon et 0,4 microlitres de polymétéase pour chaque réaction.

Vortex le mélange et le faire tourner vers le bas. Ensuite, distribuez 18 microlitres du mélange dans chaque puits. Puis pipette deux microlitres de chaque ADN dans le puits approprié.

Mélanger les réachemits en faisant monter et descendre cinq fois, puis sceller la plaque. Placez la plaque dans le thermocycleur et exécutez le PCR selon les instructions manuscrites. Préchauffer le shaker de l’incubateur à 65 degrés Celsius et ajouter 80 microlitres de tampon 1X TE à chaque produit PCR.

Utilisez une pipette multicanal pour transférer les échantillons dans une plaque de nettoyage PCR et mettre la plaque dans le shaker. Incubez-le à 65 degrés Celsius tout en secouant à 1200 RPM pendant 10 minutes. Après l’incubation, refroidir le shaker de l’incubateur jusqu’à 25 degrés Celsius, régler l’instrument sous vide à 250 millibar et aspirer la solution à travers le filtre.

Après 15 minutes, les puits ne devraient pas avoir de liquide restant. Éteignez le vide et ajoutez 50 microlitres de tampon 1X TE à chaque puits. Aspirez la solution pendant 10 minutes en utilisant les paramètres de vide précédents.

Séchez le fond de la plaque de filtre en appuyant fermement sur une pile de serviettes en papier, puis ajoutez 20 microlitres de tampon 1X TE au centre inférieur de chaque puits. Placez la plaque dans le shaker et incubez à 25 degrés Celsius tout en secouant à 1200 RPM pendant cinq minutes. Après l’incubation, transférer au moins 15 microlitres du produit PCR purifié dans une plaque PCR fraîche de 96 puits.

Avant de commencer, apportez le concentré de colorant d’ADN, la matrice de gel d’ADN, le marqueur d’ADN, l’échelle d’ADN, et les échantillons purifiés d’ADN à la température ambiante. Installez la station d’amorçage en remplaçant la seringue et en ajustant la plaque de base, puis relâchez le levier du clip de seringue et faites-le glisser vers la position supérieure. Démarrez le logiciel de dimensionnement et préparez le mélange de colorant gel.

Vortex le concentré de colorant pendant 10 secondes, puis tournez-le vers le bas. Ensuite, ajoutez 25 microlitres du colorant à un flacon matriciel de gel et vortex la solution à mélanger. Transférer le mélange de colorant gel sur un filtre à spin, le placer dans la centrifugeuse, et le faire tourner pendant 10 minutes à 1500 fois g.

Lorsque vous êtes prêt à charger le mélange de colorant gel, insérez une nouvelle puce d’ADN dans la station d’amorçage et ajoutez neuf microlitres du mélange de colorant gel dans le puits qui est marqué de G.Fermez la station d’amorçage et assurez-vous que le piston est positionné à la marque d’un millilitre. Appuyez sur le piston seringue vers le bas jusqu’à ce qu’il soit tenu par le clip. Attendez exactement 30 secondes, puis relâchez le clip.

Attendez encore cinq secondes, puis tirez lentement le piston vers la position d’un millilitre. Ouvrez la station d’amorçage et ajoutez neuf microlitres de mélange de colorant gel dans les puits marqués de G.Ajoutez cinq microlitres de marqueur dans le puits marqué d’un symbole d’échelle et chacun des 12 puits d’échantillon. Ajouter un microlitre de l’échelle au puits avec le symbole de l’échelle et un microlitre du produit PCR ou de l’eau aux puits de l’échantillon.

Vortex la puce pendant une minute à 2400 RPM. Insérez-le dans le bioanalyseur et exécutez la puce dans les cinq minutes. Lorsque l’exécuter est terminé, exportez les données de pointe sous forme de fichiers de table csv.

Un échantillon femelle de prémutation et un échantillon femelle à mutation complète sont utilisés comme échantillons de référence. Un pic marqueur supérieur et inférieur est inclus dans le profil de taille du fragment, et il y a habituellement un pic complexe d’amorce à environ 95 paires de base. Ces échantillons de référence sont utilisés pour construire une courbe standard de régression.

La courbe standard de régression linéaire est ensuite utilisée pour calculer la taille répétée d’échantillons inconnus. Les échantillons normaux cliniques, intermédiaires, de prémutation, de mutation complète, et de mutation complète de mosaïque peuvent être correctement classifiés avec cette méthode. Dans certains cas, un seul pic est affiché dans les résultats de l’électrophoresis microfluidique, ce qui est probablement dû à la présence d’allèles homozygotes normaux.

Un type de résultat sous-optimal est le biais de base, qui peut être ambigu ou non interprète, et est soupçonné d’être causé par un mauvais fonctionnement de l’instrument. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important d’assurer une quantité appropriée d’ADN et de qualité avant de commencer le protocole. Le séquençage du gène FMR1 peut être effectué pour identifier le modèle d’interruption AGG.

Et l’enzyme de restriction méthylation-sensible ou l’essai de modification de bisulfide peut être employé pour surveiller l’état de méthylation. Il s’agit d’une technique rapide, robuste et rentable. Il aidera d’autres chercheurs à mener une étude basée sur la population sur l’état porteur de FXS et de troubles fragiles associés à l’X.