Name: Isolement, transfection et culture des monocytes humains primaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Découvrez l'isolement, la culture et la transfection des monocytes humains primaires pour étudier la fonction immunitaire. Cette méthode optimise l'analyse des mécanismes moléculaires de la dysfonction immunitaire dans le VIH.

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Les auteurs aimeraient remercier le noyau de biorepository clinique/tumoral du VIH d'avoir fourni des échantillons de patients et le noyau de métabolisme d'immunologie cellulaire pour fournir l'analyse de cytométrie de flux. Ce projet a été financé par NIH P20GM121288 et P30GM114732.

Toutes les méthodes décrites ci-dessous ont été approuvées par le Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans Institutional Review Board. Tout le sang a été recueilli après avoir obtenu le consentement éclairé.
REMARQUE : L'ensemble de la procédure est effectué dans des conditions stériles dans une installation de biosécurité de niveau 2 (BSL2) afin que la prudence soit utilisée pour manipuler les matériaux biologiques. En particulier, chaque étape est effectuée à l'aide de techniques stériles sous un cabinet de biosécurité. Après chaque étape impliquant le sang, les produits sanguins, les cellules, ou le pipetage de produit de cellules, il est important de rincer tous les matériaux en plastique (c.-à-d., pipettes sérologiques, bouts de pipette, et tubes) avec 10% d'eau de Javel d'un récipient de rectification à l'intérieur du capot avant l'élimination appropriée.
1. Isolement des monocytes humains primaires par sélection négative immunomagnétique
<ol><li>Recueillir 40 ml de sang entier frais (à partir d'unpatient séropositif ou d'un contrôle sain) dans quatre tubes à vide de 10 ml d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) (10 mL de sang par tube). À l'aide de techniques stériles sous un cabinet de biosécurité, transférer les 40 ml de sang dans un tube de propylène conique de 50 ml.</li>
	<li>Suivant le protocole du fabricant pour le kit d'isolement des monocytes humains sélectionnés (Table of Materials), ajoutez 2 ml de cocktail d'isolation monocyte, fourni dans le kit, au tube de sang. Perles magnétiques Vortex, également fournies dans le kit, pour 30 s, et ajouter 2 ml au tube de sang.<ol>
<li>Si moins de 40 ml de sang sont disponibles, réduire les réactifs ajoutés. Pour mélanger la solution, pipette de haut en bas avec une pipette sérologique en plastique de 25 ml et incuber pendant 5 min à température ambiante (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Séparer le mélange sanguin également en quatre tubes de 50 ml et ajouter 30 ml de salline stérile tamponnée par phosphate (PBS) contenant 1 mM EDTA à chaque tube. Mélanger en pipetting de haut en bas avec une pipette sérologique en plastique de 25 ml.</li>
	<li>Placez les tubes dans des supports d'aimant pendant 10 min pour enlever les perles magnétiques conjuguées par anticorps. Utilisez quatre supports d'aimant simultanément, un pour chaque tube, pour permettre des temps d'incubation et d'isolement constants pour chaque échantillon de sang.</li>
	<li>Dessinez le contenu à partir du centre de chaque tube, à l'aide d'une pipette, alors qu'ils sont encore dans les supports d'aimant. Veillez à ne pas dresser les globules rouges (pas plus de 10 % du volume de départ de 10 ml) et placez le contenu dans l'un des quatre nouveaux tubes de 50 ml.</li>
	<li>Ajouter 500 l de perles magnétiques vortexées à chaque tube de 50 ml. Pipette de haut en bas avec une pipette de 25 ml et incuber à RT pendant 5 min. Ensuite, placez les tubes dans des supports d'aimant pendant 5 min.</li>
	<li>Transférer soigneusement le contenu du centre de chaque tube tout en conservant des supports d'aimant dans l'un des quatre nouveaux tubes de 50 ml. Placez directement chaque nouveau tube de 50 ml dans les supports d'aimant pendant 5 min.</li>
	<li>Transférer soigneusement le contenu du centre de chaque tube dans l'un des quatre nouveaux tubes de 50 ml. Faites tourner tous les nouveaux tubes de 50 ml à 300 x g pendant 5 min. Aspirez le supernatant et suspendez les quatre granulés de cellules dans un total de 10 ml de PBS stérile.</li>
	<li>Comptez les cellules par exclusion bleue trypan à l'aide d'un hémocytomètre. REMARQUE : 8-20 x 106 cellules sont généralement obtenues à partir de 40 ml de sang entier.</li>
</ol>2. Cultiver des monocytes humains primaires
<ol><li>À l'aide d'un bain d'eau de 37 oC, le préfère RPMI 1640 sans sérum chaud est complété par 1 % de pénicilline-streptomycine (pen/streptocoque) et (tout en continuant d'utiliser des techniques stériles dans le cadre d'un cabinet de biosécurité) à suspendre les monocytes isolés dans ce milieu à une concentration de 1 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Ajouter 1 ml de cellules en suspension à chaque puits d'une plaque de 6 puits ou dans un plat de 35 mm (le nombre final de cellules doit être de 1 x 106 cellules/plaque), et placer dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2. Attendez 0.5-1.0 h pour que les cellules adhèrent.</li>
	<li>À l'aide d'un bain d'eau à 37 oC, sérum bovin fœtal (SF) à inactivé par la chaleur chaude (SF). Ajouter 100 l (10 % de concentration finale) de FBS à chaque assiette. Ajouter des facteurs de croissance aux cellules pour favoriser la différenciation des macrophages.<ol>
<li>Macrophages de premier choix pour un phénotype de type M1 en ajoutant 25 ng/mL de facteur de stimulation de la colonie granulocyte-macrophage (GM-CSF) aux médias. Macrophages de premier choix pour un phénotype de type M2 en ajoutant 50 ng/mL de facteur de stimulation de la colonie de macrophages (M-CSF) aux médias28. REMARQUE : Les deux GM-CSF et M-CSF permettent la différenciation de monocyte à un phénotype de macrophage général (M0) tout en amorçant des cellules pour M1 ou M2, respectivement7,28,30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Transfecting monocytes humains primaires dans la culture
<ol><li>Monocytes transfect avec miRNA imite ou inhibiteurs ou siRNA à l'aide d'un kit contenant un réactif de transfection à base de polymère (Tableau des matériaux).<ol>
<li>Suivant le protocole du fabricant pour le kit de transfection (et la poursuite de l'utilisation de techniques stériles sous un cabinet de biosécurité), diluer d'abord les miRNA sélectionnés imite/inhibiteurs ou siRNAs dans le tampon à une concentration finale de 1,83 M. Préparer 10 'L d'imitation diluée / inhibiteur par transfection de 1 x 106 cellules.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer le réactif de transfection en ajoutant 1 ll du polymère fourni à un tube microcentrifuge frais de 1,5 mL, suivi immédiatement par l'ajout de 90 l de tampon fourni (pour un total de 91 l de réactif par transfection). Vortex pour 3-5 s.</li>
	<li>Pipette 90 l de solution de transfection dans le tube contenant 10 l d'imitation/inhibiteur ou siRNA dilué de miRNA. Mélanger par pipetting douce et couver pendant 15 min à RT.</li>
	<li>Ajouter 100 l de complexe de transfection à un puits (ou plat) de 1 x 106 monocytes plaqués. Incuber les cellules pendant 4 h à 37 oC, puis remplacer le milieu par 3 ml de milieu xfpf (RPMI 1640 complété par 1 % de pénicilline-streptomycine et 10 % de FBS inactivé par la chaleur) contenant soit GM-CSF, soit M-CSF.</li>
</ol>4. Différenciation et activation M1/M2
<ol><li>Les monocytes commencent immédiatement à se différencier des macrophages M0 larges sur le placage dans la culture. Le troisième jour après le placage, continuer à utiliser des techniques stériles sous un cabinet de biosécurité et remplacer les médias par 3 ml de nouveaux médias RMPI 1640 (complété s'ajouter à 1% de pénicilline-streptomycine, 10% de FBS inactivé par la chaleur, et soit 25 ng/mL GM-CSF pour promouvoir la polarisation M1-like ou 50 ng/mL M-CSF pour promouvoir M2-as. Culture des cellules dans ces conditions pour un total de 6 jours à partir du placage initial dans un incubateur à 37 oC, 5% CO2.</li>
	<li>Pour faire progresser la polarisation des cellules apprêtées au phénotype M1-macrophage, activez les cellules le jour 6 de l'incubation en remplaçant les médias cellulaires par de nouveaux supports contenant 5 % de FBS inactivé par la chaleur, 1 % de stylo/streptocoque, 100 ng/mL E. colidérivé du lipopolysaccharide (LPS) et 20 ng/mL d'interféron gamma (IFN- ).</li>
	<li>Pour faire progresser la polarisation des cellules apprêtées au phénotype M2-macrophage, activez les cellules le jour 6 de l'incubation en remplaçant les médias cellulaires par de nouveaux supports contenant 5 % de FBS inactivé par la chaleur, 1 % de stylo/streptocoque, 10 ng/mL M-CSF et 20 ng/mL d'interleukine 4 (IL-4).</li>
	<li>Après 24 h, récoltez les cellules pour les analyses d'ARN, de protéine ou de cytométrie d'écoulement.<ol>
<li>Lorsque les cellules sont prêtes à être rectifiées, lavez les cellules dans le plat 2x avec PBS (à RT pour l'extraction de l'ARN ou refroidies sur la glace pour l'extraction des protéines). Parce que les macrophages différenciés sont maintenant fermement attachés aux plaques, lyser les cellules dans les plaques directement pour obtenir du matériel pour les analyses d'ARN et de protéines.</li>
		<li>Pour la collecte du matériel pour la cytométrie d'écoulement, ajouter le PBS contenant 2 mM EDTA au plat, incuber les cellules pendant 10 min à 37 oC, gratter doucement les cellules du plat, et recueillir le contenu dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml avant de procéder avec les protocoles standard.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Cytométrie de flux
<ol><li>Rincer les cellules dans PBS pour enlever le milieu de culture. Faites baisser 100 000 cellules (par état de cytométrie d'écoulement) et suspendez à nouveau la pastille dans 100 L de PBS contenant 2 l d'inhibiteur de liaison HuFcR. Incuber à RT pendant 15 min.</li>
	<li>Ajoutez 50 ll de tampon de coloration et les anticorps désirés (ici, CD80, CD83, CD163 et CD209 ont été utilisés) dans les quantités recommandées.</li>
	<li>Mélanger délicatement et incuber à 4 oC dans l'obscurité pendant 30 min.</li>
	<li>Laver 2x avec du PBS et resuspendre les cellules tachées dans 150 OL de PBS avant d'exécuter l'échantillon sur un cytofluorimètre.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le protocole présenté démontre l'utilisation de cellules primaires de sujets infectés par le VIH comme modèle pour l'étude des monocytes et des macrophages. Les patients atteints de VIHet de coart vivent avec une infection pendant plusieurs années et peuvent également avoir d'autres co-infections liées à un système immunitaire compromis. Pour étudier l'immunomodulation en présence d'une infection chronique par le VIH, des cellules ont été prélevées directement sur des patients. Comme il a été démontré que les ...

L'infection par le virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) provoque un dysfonctionnement immunitaire grave, qui peut entraîner des infections opportunistes et le syndrome d'immunodéficience acquise (sida). Bien que les patients infectés par le VIH qui subissent une multithérapie soient caractérisés par de faibles charges virales et des numérations normales de CD4et de lymphocytes T, le fonctionnement du système immunitaire peut être compromis chez ces personnes, ce qui entraîne une réponse immunitaire dysfonctionnelle qui a été associée à un risque accru de développer un cancer1. Les mécanismes de dysfonctionnement immunitaire chez les patients séropositifs sous la cothérapie demeurent largement inconnus. Par conséquent, caractériser les cellules immunitaires d'origine du patient et étudier leur biologie et leur fonction est un élément essentiel de la recherche actuelle sur le VIH.
Les monocytes et les macrophages sont des régulateurs clés des réponses immunitaires et jouent un rôle fondamental dans l'infection par le VIH2,3,4,5. Hétérogènes et plastiques de nature, les macrophages peuvent être largement classés en activéclassiquement (M1) ou alternativement activés (M2). Bien que cette classification générale soit nécessaire lors de la mise en place de conditions expérimentales, le statut de polarisation des macrophages peut être inversé par une variété de cytokines6,7,8,9. Bien que plusieurs études aient étudié les effets de l'infection par le VIH sur les monocytes et les cellules dendritiques, les détails moléculaires des réponses monocytes-négociées sont en grande partie inconnus6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Parmi les facteurs impliqués dans la régulation et la fonction des cellules immunitaires, il a été démontré que les microARN (miARN) courts et non codants qui régulent l'expression des gènes après la transcription, jouent un rôle important dans le contexte des principales voies cellulaires (c.-à-d. la croissance, la différenciation, le développement et l'apoptose)20. Ces molécules ont été décrites comme d'importants régulateurs de facteurs de transcription essentiels pour dicter la polarisation fonctionnelle des macrophages21. Le rôle potentiel des miARN dans les monocytes des personnes infectées par le VIH subissant une multithérapie a été étudié, mais les progrès dans le domaine exigent beaucoup plus de travail22,23,24,25,26. Cet article traite d'une méthode optimisée pour transfect miRNAs et siRNAs dans les monocytes humains primaires des patients et des contrôles HIV-infectés.
Ce protocole repose sur des réactifs et des kits disponibles dans le commerce, car la continuité de la procédure technique permet d'éliminer les variables expérimentales inutiles lorsqu'on travaille avec des échantillons cliniques. Néanmoins, la méthode fournit des conseils importants (c.-à-d., le nombre de cellules plaquées ou une brève incubation avec des médias sans sérum pour favoriser l'adhérence des cellules à la plaque). En outre, les conditions de polarisation utilisées dans ce protocole sont dérivées de l'ouvrage publié27,28,29.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Tubes de prélèvement sanguin en plastique avec K2EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de coloration brillant</td><td>BD Horizon</td><td>563794</td><td>Cytométrie en flux</td></tr><tr><td>CD14 PerCP</td><td>Invitrogen</td><td>46-0149-42</td><td>Anticorps conjugué par cytométrie</td></tr><tr><td>en flux CD163 BV711</td><td>BD Horizon</td><td>563889</td><td>Cytométrie en flux - anticorps conjugué</td></tr><tr><td>CD209 BV421</td><td>BD Horizon</td><td>564127</td><td>Cytométrie en flux - anticorps conjugué</td></tr><tr><td>CD80 FITC</td><td>BD Horizon</td><td>557226</td><td>Horizon Anticorps conjugué</td></tr><tr><td>CD83 APC</td><td>BD Horizon</td><td>551073</td><td>Cytométrie en flux - anticorps conjugué</td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation</td> Kit <td>StemCell Technologies</td><td>19669</td><td></td></tr><tr><td>EIF4EBP1 mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>9644</td><td>Anticorps monoclonal pour Western blot</td></tr><tr><td>EIF4EBP1 siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-29594</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de Bovin fœtal Defined Heat Inactivated</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux Gallios</td><td>Beckman Coulter</td><td>B43618</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH mAb</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47724</td><td>Anticorps monoclonal pour le Western blot</td></tr><tr><td>HuFcR Inhibiteur de liaison</td><td>eBiosciences</td><td>14-9161-73</td><td>Tampon de blocage de la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse Kaluza</td><td>Beckman Coulter</td><td>B16406</td><td>Logiciel pour analyser les données de cytométrie</td></tr><tr><td>en flux Lipopolysaccharides de Escherichia coli O55:B5</td><td>Sigma</td><td>L4524</td><td></td></tr><tr><td>miRCURY LNA microRNA Mimic has-miR-146a-5p</td><td>Qiagen</td><td>YM00472124</td><td></td></tr><tr><td>MISSION miRNA Negative Control</td><td>Sigma</td><td>HMC0002</td><td>MiARN brouillé conjugué à un colorant proche infrarouge</td></tr><tr><td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Humain Recombinant GM-CSF</td><td>R& D Systems</td><td>215-GM-050</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gamma humain recombinant ;</td><td>R& D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 humain recombinant</td><td>R& D Systems</td><td>204-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF humain recombinant</td><td>R& D Systems</td><td>216-MC-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 avec L-Glutamine</td><td>Corning</td><td>10040CVMP</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle brouillé siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-37007</td><td></td></tr><tr><td>Kit de réactifs de transfection Viromer Blue</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td><td></td></tr><tr><td>WST-1 Réactif de prolifération cellulaire</td><td>Roche</td><td>5015944001</td><td>Essai colorimétrique pour évaluer la viabilité cellulaire</td></tr></tbody></table>

isolement, transfection et culture des monocytes humains primaires

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) demeure un problème de santé majeur malgré l'introduction d'un traitement antirétroviral combiné (coART) au milieu des années 1990. Bien que la thérapie antirétrovirale abaisse efficacement la charge virale systémique et rétablisse le nombre normal de cD4et de lymphocytes T, elle ne reconstitue pas un système immunitaire complètement fonctionnel. Un système immunitaire dysfonctionnel chez les personnes infectées par le VIH subissant une multithérapie peut être caractérisé par une activation immunitaire, un vieillissement précoce des cellules immunitaires ou une inflammation persistante. Ces conditions, ainsi que les facteurs comorbides associés à l'infection par le VIH, ajoutent de la complexité à la maladie, qui ne peut pas être facilement reproduite dans les modèles cellulaires et animaux. Pour étudier les événements moléculaires sous-jacents au dysfonctionnement immunitaire dans ces patients, un système à la culture et manipuler les monocytes primaires humains in vitro est présenté ici. Plus précisément, le protocole permet la culture et la transfection des monocytes CD14 primaires obtenus auprès de personnes infectées par le VIH qui subissent une multithérapie ainsi que de contrôles séronégatifs. La méthode implique l'isolement, la culture et la transfection des monocytes et des macrophages dérivés de monocytes. Tandis que des kits et des réactifs disponibles dans le commerce sont employés, le protocole fournit des bouts importants et des conditions optimisées pour l'adhérence réussie et la transfection des monocytes avec des imitations et des inhibiteurs de miRNA aussi bien qu'avec des siRNAs.

À l'aide de la procédure décrite, les monocytes humains primaires provenant de personnes infectées par le VIH et de donneurs en bonne santé ont été isolés. Toutes les données présentées ici ont été obtenues à partir desujets séropositifs et soumis à une multithérapie avec des charges virales faibles (lt;20 copies/mL) ou indétectables et des numérations normales de CD4et de lymphocytes T. Immédiatement après l'isolement, les cellules ont été souillées, et la cytométri...

Présenté ici est un protocole optimisé pour isoler, cultiver, transfecter, et différencier les monocytes primaires humains des individus infectés par le VIH et des contrôles sains.

Isolement, transfection et culture des monocytes humains primaires

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

L’infection par le VIH provoque un dysfonctionnement immunitaire même chez les personnes qui suivent un traitement antirétroviral sans virus détectable. Cette méthode permet l’étude de la fonction monocyte qui sont les régulateurs clés de la réponse immunitaire. Nous avons optimisé cette technique pour l’isolement, la culture et la transfection des monocytes primaires humains.Nous utilisons cette méthode pour comprendre les mécanismes moléculaires du dysfonctionnement immunitaire chez les personnes infectées par le VIH, mais elle peut être appliquée à toute autre étude immunitaire impliquant des monocytes. Si c’est la première fois que vous travaillez avec du sang humain, n’oubliez pas de suivre les protocoles de biosécurité appropriés et de traiter tous les échantillons comme des matériaux potentiellement infectieux. Après avoir recueilli 40 millilitres de sang entier humain frais dans quatre tubes à vide EDTA de 10 millilitres, utilisez une technique stérile pour transférer tout le sang dans un seul tube conique de propylène de 50 millilitres dans une armoire de biosécurité.Suivant les instructions du fabricant à partir d’un kit d’isolation des monocytes humains sélectionnés, ajo

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Nous présentons ici un protocole qui génère de grandes quantités de monocytes murins à partir de moelle osseuse hétérogène pour des applications translationnelles. Par rapport à d’autres, cette nouvelle méthode permet de réduire le nombre d’animaux sacrifiés et de réduire les coûts en évitant des méthodes coûteuses telles que la séparation magnétique de cellules à gradient élevé (MACS).

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Un protocole est présenté pour la culture cellulaire de macrophages dérivés de monocytes humains différenciés par le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF). Le protocole utilise la cryoconservation des monocytes associée à leur différenciation en macrophages. Ensuite, les macrophages récoltés peuvent ensuite être ensemencés dans des puits de culture aux densités cellulaires requises pour la réalisation d’expériences.

Culture de Macrophages Factor macrophage colony-stimulating Differentiated humaine monocytes dérivés

Cette étude compare deux méthodes différentes d’isolement de monocytes humains pour obtenir des cellules dendritiques (DC) in vitro. Les monocytes sont sélectionnés par adhérence ou enrichis négativement par séparation magnétique. Le rendement et la viabilité des monocytes ainsi que la viabilité, la prolifération et l’expression des marqueurs de surface CD11c/CD14 seront comparés entre les deux méthodes.

Caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes d&#39;isolement

Ce protocole décrit le flux de travail pour obtenir des macrophages dérivés des monocytes (MDM) à partir d’échantillons de sang humain, une méthode simple pour introduire efficacement des rapporteurs de complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) de caspase inflammatoire dans le MDM humain sans compromettre la viabilité et le comportement des cellules, et une approche basée sur l’imagerie pour mesurer l’activation des caspases inflammatoires dans les cellules vivantes.

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Méthode simple et efficace pour tester des agents immunomodulateurs pour la génération de cellules dendritiques tolérogènes à partir de monocytes CD14+ humains

Découvrez l'isolement, la culture et la transfection des monocytes humains primaires pour étudier la fonction immunitaire. Cette méthode optimise l'analyse des mécanismes moléculaires de la dysfonction immunitaire dans le VIH.

Isolement, transfection et culture des monocytes humains primaires

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