Name: Mesure spécifique au cycle cellulaire de h2AX et dapoptose après stress génotoxique par cytométrie de flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Découvrez l'analyse cellulaire du cycle cellulaire, de γH2AX et de l'apoptose par cytométrie de flux pour évaluer les cassures double-brin de l'ADN. Cette méthode permet d'étudier les réponses aux traitements radiochemothérapeutiques en oncologie clinique et radiobiologie.

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Nous remercions l'équipe de l'installation de cytométrie de flux du Centre allemand de recherche sur le cancer (DKFZ) pour son soutien.

<ol><li>Jensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+non-small+cell+lung+cancer+with+intensity-modulated+radiation+therapy+in+combination+with+cetuximab%3A+the+NEAR+protocol+%28NCT00115518%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518).</a> BMC Cancer. 6, 122(2006).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Glioblastoma+and+Carcinoma+Xenograft+Tumors+Treated+by+Combined+Radiation+and+Imatinib+%28Gleevec%29%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec).</a> Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).</li>
<li>Timke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor%2FPlatelet-Derived+Growth+Factor+Receptor+Inhibition+Markedly+Improves+Radiation+Tumor+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimodal+glioblastoma+treatment+consisting+of+concurrent+radiotherapy%2C+temozolomide%2C+and+the+novel+TGF-%CE%B2+receptor+I+kinase+inhibitor+LY2109761%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761.</a> Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage%2C+Aging%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA Damage, Aging, and Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).</li>
<li>Rodgers, K., McVey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-Prone+Repair+of+DNA+Double-Strand+Breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+Damage+Response%3A+Making+It+Safe+to+Play+with+Knives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives.</a> Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+during+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).</li>
<li>Escribano-Díaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cell+Cycle-Dependent+Regulatory+Circuit+Composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+Controls+DNA+Repair+Pathway+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice.</a> Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Bakr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+crosstalk+between+DNA+damage+response+proteins+53BP1+and+BRCA1+regulates+double+strand+break+repair+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice.</a> Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).</li>
<li>Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+repair+in+higher+eukaryotes+and+its+role+in+genomic+instability+and+cancer%3A+Cell+cycle+and+proliferation-dependent+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation.</a> Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+of+clinical+carbon+ion+versus+photon+radiation+in+human+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells.</a> Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+suberoylanilide+hydroxamic+acid+with+heavy+ion+therapy+shows+promising+effects+in+infantile+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+oncology%22%5BJournal%5D)">Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines.</a> Radiation oncology. 6 (1), 119(2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+%CE%B3H2AX+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Thiemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+suberoylanilide+hydroxamic+acid+in+combination+with+radiotherapy+in+a+malignant+rhabdoid+tumor+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 52(2012).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+retain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+resistant+to+carbon+ion+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy.</a> Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+exhibit+resistance+to+topoisomerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition.</a> Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+maintain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+treatment+with+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin.</a> Scientific Reports. 6, 20035(2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+sensitive+to+bleomycin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment.</a> Scientific Reports. 6, 26645(2016).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+radiosensitizes+radioresistant+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells.</a> Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).</li>
<li>Münz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Radiation+Resistance+of+Human+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+Is+Independent+of+Their+Tissue+of+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).</li>
<li>Dean, P. N., Jett, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+analysis+of+DNA+distributions+derived+from+flow+microfluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry.</a> Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).</li>
<li>Fox, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+the+computer+analysis+of+synchronous+DNA+distributions+obtained+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry.</a> Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).</li>
<li>Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+features+that+discriminate+between+foci+induced+by+high-+and+low-LET+radiation+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts.</a> Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).</li>
<li>Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+light+microscopy+shows+nanostructure+of+carbon+ion+radiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+foci%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB%22%5BJournal%5D)">Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci.</a> FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).</li>
<li>Schipler, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+complexity+levels+and+their+possible+contributions+to+the+probability+for+error-prone+processing+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice.</a> Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).</li>
<li>Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fragmentation+by+charged+particle+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">DNA fragmentation by charged particle tracks.</a> Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).</li>
<li>Friedland, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+track-structure+based+evaluation+of+DNA+damage+by+light+ions+from+radiotherapy-relevant+energies+down+to+stopping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping.</a> Scientific Reports. 7, 45161(2017).</li>
<li>Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+Fragments+Are+a+Hallmark+of+Heavy+Charged-Particle+Irradiation+and+May+Underlie+Their+Greater+Therapeutic+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy.</a> Frontiers in Oncology. 6, 130(2016).</li>
<li>Böcker, W., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Methods+for+analysis+of+foci%3A+validation+for+radiation-induced+gamma-H2AX+foci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells.</a> Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Löbrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3H2AX+foci+analysis+for+monitoring+DNA+double-strand+break+repair%3A+Strengths%2C+limitations+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization.</a> Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La méthode décrite est facile à utiliser et offre une mesure rapide, précise et reproductible de la réponse aux dommages à l'ADN, y compris l'induction et la réparation de la rupture à double brin (DSB), les effets du cycle cellulaire et la mort des cellules apoptotiques. La combinaison de ces points de terminaison fournit une image plus complète de leurs interrelations que les essais individuels. La méthode peut être largement appliquée comme un test complet de génotoxicité dans les domaines de la biologie de la radiora...

Le but de l'oncologie est de tuer ou d'inactiver les cellules cancéreuses sans nuire aux cellules normales. De nombreuses thérapies induisent directement ou indirectement le stress génotoxique dans les cellules cancéreuses, mais aussi dans certaines d'autres qui s'étendent dans les cellules normales. La chimiothérapie ou les médicaments ciblés sont souvent combinés avec la radiothérapie pour améliorer la radiosensibilité de la tumeur irradiée1,2,3,4,5, ce qui permet une réduction de la dose de rayonnement pour minimiser les lésions normales des tissus.
Le rayonnement ionisant et d'autres agents génotoxiques induisent différents types de dommages à l'ADN, y compris les modifications de base, les liens croisés des brins et les ruptures à brin unique ou double. Les ruptures de double brin d'ADN (DSBs) sont les lésions d'ADN les plus sérieuses et leur induction est essentielle à l'effet de tueur de cellules du rayonnement ionisant et de divers drogues cytostatiques dans la radiochimiothérapie. Les DSB ne nuisent pas seulement à l'intégrité du génome, mais favorisent également la formation de mutations6,7. Par conséquent, différentes voies de réparation d'ESTB, et les mécanismes pour éliminer les cellules irrémédiablement endommagées comme l'apoptose se sont développées pendant l'évolution. L'ensemble de la réponse aux dommages à l'ADN (DDR) est régulée par un réseau complexe de voies de signalisation qui atteignent de la reconnaissance des dommages à l'ADN et l'arrêt du cycle cellulaire pour permettre la réparation de l'ADN, à la mort cellulaire programmée ou l'inactivation en cas de défaillance de réparation8.
La méthode cytométrique présentée de flux a été développée pour étudier le DDR après le stress génotoxique dans un test complet qui couvre l'induction et la réparation d'ESTD, aussi bien que des conséquences de la rupture de réparation. Il combine la mesure du marqueur DSB largement appliqué H2AX avec l'analyse du cycle cellulaire et l'induction de l'apoptose, en utilisant l'analyse classique subG1 et une évaluation plus spécifique de l'activation de la caspase-3.
La combinaison de ces paramètres dans un seul analyse réduit non seulement le temps, la main-d'œuvre et les coûts, mais permet également la mesure du cycle cellulaire spécifique à l'induction et la réparation de l'ORD, ainsi que l'activation de la caspase-3. De telles analyses ne seraient pas possibles avec des essais effectués indépendamment, mais elles sont très pertinentes pour une compréhension complète de la réponse aux dommages à l'ADN après un stress génotoxique. Beaucoup de médicaments anticancéreux, tels que les composés cytostatiques, sont dirigés contre la division des cellules et leur efficacité dépend fortement du stade du cycle cellulaire. La disponibilité de différents processus de réparation DSB dépend également de l'étape de cycle cellulaire et le choix de voie qui est critique pour la précision de réparation, et détermine à son tour le sort de la cellule9,10,11, 12. En outre, la mesure spécifique au cycle cellulaire des niveaux d'ORD est plus précise que l'analyse mise en commun, parce que les niveaux d'ORD dépendent non seulement de la dose d'un composé génotoxique ou d'un rayonnement, mais aussi de la teneur en ADN de la cellule.
La méthode a été utilisée pour comparer l'efficacité de différentes radiothérapies pour surmonter les mécanismes de résistance dans le glioblastome13 et pour disséquer l'interaction entre le rayonnement ionisant et les médicaments ciblés dans l'ostéosarcome14,15 et les cancers tératoïdes rhabdoïdes atypiques16. En outre, la méthode décrite a été largement utilisée pour analyser les effets secondaires de la radio et de la chimiothérapie sur les cellules souches mésenchymales17,18,19,20,21, 22,23,24, qui sont essentiels pour la réparation des dommages normaux induits par le traitement de tissu et ont une application potentielle en médecine régénérative.

<table><tbody><tr><td>1 000 et micro ; L filtres</td><td>Nerbe plus</td><td>07-693-8300</td><td></td></tr><tr><td>100-1 000 & micro ; Pipette L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>tubes de 12 mm x 75 mm avec capuchon de crépine de cellule, 35 & micro ; m taille des pores de maille</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>tubes de 15 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro ; L filtres</td><td>Nerbe plus</td><td>07-662-8300</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &micro ; Pipette L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidin-2-phénylindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Dissoudre dans l’eau à 200 &micro ; g/mL et stocker les aliquotes à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Anticorps, RRID : AB_2248011</td><td>BioLegend</td><td>613406</td><td>Dilué 1:20</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414</td><td>BD Pharmingen</td><td>560626</td><td>Dilué 1:20</td></tr><tr><td>BD FACSClean solution</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td>Pour la routine de nettoyage du cytomètre après la mesure</td></tr><tr><td>BD FACSRinse solution</td><td>BD Biosciences</td><td>340346</td><td>Pour la routine de nettoyage du cytomètre après la mesure</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate salin tamponné (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L 182</td><td>Dissoudre dans l’eau jusqu’à une concentration de 1x</td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco avec glutamine stable</td><td>Biochrom</td><td>FG 0415</td><td>Matériel de culture cellulaire de routine pour l’exemple de lignée cellulaire utilisée dans le protocole</td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior (sérum fœtal bovin)</td><td>Biochrom</td><td>S 0615</td><td>Matériel de culture cellulaire de routine pour l’exemple de lignée cellulaire utilisée dans le protocole</td></tr><tr><td>Logiciel FlowJo v10</td><td>LLC</td><td>commande</td><td></td>en ligne</tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Milieu d’enrobage pour la préparation facultative de lames microscopiques à partir d’échantillons colorés</td></tr><tr><td>Filtres en cellulose pliés, grade 3hw</td><td>NeoLab</td><td>11416</td><td></td></tr><tr><td>LSRII ou LSRFortessa cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Calbiochem</td><td>474787</td><td>médicament facultatif pour le contrôle positif de l’apoptose</td></tr><tr><td>Multifuge 3SR+</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>AppliChem</td><td>A3813</td><td>Préparer une solution fraîche à 4,5 %. Diluer dans du PBS en chauffant à 80 &deg ; C avec agitation lente sous la hotte. Couvrez la fiole d’une feuille d’aluminium pour éviter les pertes de chaleur. Laissez la solution refroidir à température ambiante et ajustez le volume final. Passez la solution à travers un filtre en cellulose.</td></tr><tr><td>Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor&reg ; 555 Conjugué) RRID : AB_10694639</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3475</td><td>Diluer 3:200</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>155 016</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques, 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques, 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques, 5 mL</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>SuperKillerTRAIL (ligand modifié induisant l’apoptose lié au TNF)</td><td>Biomol</td><td>AG-40T-0002-C020</td><td>médicament facultatif pour l’apoptose contrôle positif</td></tr><tr><td>T25 flacons de culture cellulaire</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td>Matériel de culture cellulaire de routine pour la lignée cellulaire exemple utilisée dans le protocole</td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-025500</td><td>Matériel de culture cellulaire de routine pour l’exemple de lignée cellulaire utilisée dans le protocole</td></tr><tr><td>U87 MG Cellules de glioblastome</td><td>ATCC</td><td>ATCC-HTB-14</td><td>Exemple de lignée cellulaire utilisée dans le protocole</td></tr></tbody></table>

mesure spécifique au cycle cellulaire de h2ax et d'apoptose après stress génotoxique par cytométrie de flux

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

La méthode présentée ou les versions légèrement modifiées ont été conçues pour étudier les réponses spécifiques de traitement et les effets secondaires de divers traitements anticancéreux utilisés en oncologie clinique. Il permet une analyse quantitative et longitudinale de la réponse aux dommages à l'ADN après un stress génotoxique, induit par la radiothérapie et une multitude de médicaments anticancéreux. La méthode couvre toutes les étapes de la réponse aux dommages à l'ADN, fournissant des points de terminaison pour l'induction et la réparation des ruptures à double brin d'ADN (DSB), l'arrêt du cycle cellulaire et la mort cellulaire par apoptose en cas de défaillance de réparation. La combinaison de ces mesures fournit des informations sur les effets du traitement dépendant du cycle cellulaire et permet ainsi une étude approfondie de l'interaction entre la prolifération cellulaire et les mécanismes d'adaptation contre les dommages à l'ADN. Comme l'effet de nombreux traitements contre le cancer, y compris les agents chimiothérapeutiques et le rayonnement ionisant, est limité ou varie fortement selon les phases spécifiques du cycle cellulaire, les analyses corrélatives reposent sur une méthode robuste et faisable pour évaluer les effets du traitement. sur l'ADN d'une manière spécifique au cycle cellulaire. Ce n'est pas possible avec des essais à extrémité unique et un avantage important de la méthode présentée. La méthode n'est pas limitée à une ligne cellulaire particulière et a été soigneusement testé dans une multitude de tumeurs et de lignées cellulaires tissulaires normales. Il peut être largement appliqué comme un test complet de génotoxicité dans de nombreux domaines de l'oncologie en plus de la radio-oncologie, y compris l'évaluation des facteurs de risque environnemental, le dépistage des médicaments et l'évaluation de l'instabilité génétique dans les cellules tumorales.

Les cellules humaines de glioblastome U87 ou LN229 ont été irradiées avec 4 Gy de rayonnement de photon ou d'ion de carbone. Les niveaux de h2AX et l'apoptose spécifiques au cycle cellulaire ont été mesurés à différents moments jusqu'à 48 h après irradiation à l'aide de la méthode cytométrique du débit présentée ici (figure 3). Dans les deux lignées cellulaires, les ions de carbone ont induit des niveaux de pointe plus élevés de H2AX qui ont diminué plus lentement et sont demeurés significat...

La méthode présentée combine l'analyse quantitative des ruptures à double brin d'ADN (DSB), de la distribution du cycle cellulaire et de l'apoptose pour permettre l'évaluation par cycle cellulaire de l'induction et de la réparation de l'ASD ainsi que les conséquences d'une défaillance de réparation.

Mesure spécifique au cycle cellulaire de h2AX et d'apoptose après stress génotoxique par cytométrie de flux

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

La méthode fournit des informations sur les effets du traitement dépendant du cycle cellulaire et permet et une étude approfondie de l’interaction entre la prolifération cellulaire et les mécanismes d’adaptation contre les dommages à l’ADN. Cette méthode combine des points de terminaison importants de la réponse de dommages d’ADN comprenant la reconnaissance et la réparation de frag de double brin, les effets de cycle cellulaire, et la mort éventuelle de cellules par apoptose dans un essai complet. Nous avons utilisé cette technique principalement pour étudier les réponses spécifiques au traitement et les effets secondaires des traitements radiochemotherapeutic en oncologie clinique.L’essai est très utile pour les études corrélatives dans les domaines de la radiobiologie et de la radiothérapie, mais il peut également être appliqué à divers autres domaines de l’oncologie. Après avoir recueilli les cellules de la culture selon les procédures standard de collecte cellulaire, résuspendez la pastille en un millilitre de PBS. Et transférer les cellules en deux millilitres de solution de fixation dans une hotte.Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, recueillir les cellules par centrifugation et décanter le surnatant. Il est important de fixer les cellules comme une suspension à cellule unique, et de garder le temps de fixation constant pour tous les échantillons. Donnez aux cellules adhérentes suffisamment de temps pour se détacher pour obtenir des cellules bien arrondies pour l’analyse.Puis desserrez la pastille en tapant et en réutilisant les cellules en trois millilitres de 70% d’éthanol. Pour laver les cellules avant de les soutrer, sédimenter les cellules par centrifugation et desserrer la pastille en tapant. Puis résuspendez les cellules avec deux lavages consécutifs avec trois millilitres de solution de lavage et un lavage avec un millilitre de solution de lavage.Jeter le supernatant entre chaque lavage. Après le dernier lavage, aspirez soigneusement le supernatant sans déranger la pastille et resuspendez la pastille de lucent dans 100 microlitres du cocktail d’anticorps d’intérêt. Après une heure à température ambiante, recueillir les cellules par centrifugation et aspirer soigneusement le supernatant sans déranger la pastille.Ensuite, resuspendez la pastille desserrée dans 100 à 250 microlitres de solution de coloration de l’ADN et distribuez les cellules à travers le bouchon de passoire cellulaire d’un tube d’échantillon avec une taille de pore en maille de 35 micromètres. Pour analyser les cellules par cytométrie d’écoulement, ouvrez l’onglet paramètres dans la fenêtre du cytomètre et sélectionnez les paramètres indiqués dans le tableau. Ensuite, ouvrez la fenêtre de la feuille de travail et créez des parcelles comme indiqué.Chargez un échantillon de commande sur le cytomètre et appuyez sur le bouton d’exécuteur. Sélectionnez le premier tube dans la fenêtre du navigateur et cliquez sur le nom du tube. Ajustez les tensions du détecteur pour la dispersion avant et latérale et le DAPI dans l’onglet paramètres de la fenêtre de l’inspecteur.Appuyez sur le bouton veille pour continuer avec la configuration de la feuille de travail dans le logiciel. Utilisez l’outil de barrière de polygone pour définir la population des cellules dans la zone de dispersion avant par rapport à la parcelle latérale de zone de dispersion et utilisez l’outil de porte de rectangle pour définir la population des cellules simples dans la parcelle de zone DAPI avec versus DAPI. Contrôle de presse G pour afficher la hiérarchie de la population et cliquez sur les noms de porte par défaut pour les renommer.Par la suite, cliquez à droite sur tous les histogrammes pour sélectionner les populations et les cellules individuelles du menu contexte. Acquérir des échantillons de contrôle et traités afin d’optimiser les tensions du détecteur pour les fluorophores couplés aux anticorps afin de couvrir toute la plage dynamique du signal. Pour mesurer les échantillons, appuyez sur le bouton d’exécuteur sur le cytomètre et utilisez le tableau de bord d’acquisition dans le logiciel pour mesurer les échantillons.Sélectionnez ensuite des fichiers, des exportations et des expériences pour sélectionner l’exportation d’annuaires dans la boîte de dialogue pour enregistrer les données sous forme de fichiers FCS à points. Pour évaluer les données, faites glisser et déposez les fichiers FCS point dans le navigateur d’échantillon du logiciel d’analyse cytométrique de flux. Et utilisez l’outil polygone pour définir la population des cellules dans la parcelle de zone de dispersion avant contre latérale et pour exclure les débris de l’analyse.Dans la parcelle de zone DAPI avec versus DAPI, utilisez l’outil rectangle pour définir la population des cellules individuelles et exclure de l’analyse les doublets ou touffes cellulaires. Dans l’histogramme de secteur de DAPI, utilisez l’outil de bisector pour distinguer des cellules simples avec une teneur normale d’ADN des cellules apoptotiques avec l’ADN dégradé. Sélectionnez la biologie des outils et le cycle cellulaire pour ouvrir l’outil de modélisation du cycle cellulaire et sélectionnez Dean-Jett Fox pour estimer la fréquence des cellules dans les phases G un S et G deux M.Créer G un S et G deux et M barrières de phase dans le DAPI avec versus DAPI parcelle de zone de la population cycle cellulaire pour permettre un cycle cellulaire spécifique gamma H deux A X mesure. Utilisez l’outil bisector pour distinguer la phosphohistone H de trois cellules positives et négatives dans l’histogramme de la région Alexa 555 de la population du cycle cellulaire et pour distinguer la base cas trois cellules positives et négatives dans l’histogramme de la région Alexa 647 de la population de cellules individuelles. Contrôle de presse T pour ouvrir l’éditeur de table et configurer la table comme indiqué.Sélectionnez ensuite Fichier pour définir le format et la destination dans la section sortie du ruban de menu et exporter les données dans une feuille de diffusion. Les ions de carbone induisent des niveaux de pointe gamma H deux AX plus élevés dans les cellules du glioblastome qui diminuent plus lentement et restent significativement élevés en 24 à 48 heures par rapport au rayonnement photon à la même dose physique. Pour les ions de carbone et le rayonnement photon, les niveaux gamma H deux AX étaient les plus élevés dans les cellules de phase G un probablement parce que la réparation de rupture de double brin d’ADN est limitée à la voie de l’extrémité non homologous joignant à ce stade dans le cycle cellulaire.Conformément au taux d’induction de rupture à double brin plus élevé et à la cinétique de réparation plus lente, les ions de carbone induisent une arrestation plus forte et plus durable du cycle cellulaire en phase G deux et un taux plus élevé d’apoptose que les photons. Selon la force de l’effet de traitement, la résolution des différentes phases du cycle cellulaire peut être difficile. Dans certaines lignées cellulaires, la concentration de DAPI a un impact important sur la qualité du profil du cycle cellulaire et doit être ajustée.Les diapositives peuvent être préparées à partir des échantillons restants après la cytométrie d’écoulement afin d’évaluer le nombre, la taille et la forme des foyers gamma H deux AX et de faire la distinction entre la coloration gamma H deux AX focale et parnucléaire. En utilisant notre méthode, nous pourrions montrer que les cellules souches mésenchymales sont relativement résistantes contre les rayonnements ionisants et l’inhibition de la topoisomerase, mais sensibles à la gliomyacine. Comme les vapeurs de PFA sont toxiques, toujours utiliser un capot de fumée lors de la préparation de la solution de fixation et pendant l’étape de fixation.N’oubliez pas non plus de porter des gants lors de la manipulation dapi.

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Mesure de dommages et réparation de l&#39;ADN dans les splénocytes de souris Après chronique<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;exposition à de très faibles doses de bêta et gamma Rayonnement

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Découvrez l'analyse cellulaire du cycle cellulaire, de γH2AX et de l'apoptose par cytométrie de flux pour évaluer les cassures double-brin de l'ADN. Cette méthode permet d'étudier les réponses aux traitements radiochemothérapeutiques en oncologie clinique et radiobiologie.

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