Utilisation d'un microréseau d'antigène de la grippe pour mesurer l'étendue des anticorps sériques à travers les sous-types de virus

Le microrésexe antigène grippal permet de mesurer simultanément plusieurs isotypes d’anticorps contre plus de 300 souches de grippe à partir d’un petit volume d’échantillons de sang d’un seul microlitre. Le microarray facilite une mesure à haut débit de l’étendue des anticorps antigrippaux dans le paysage antigénique des souches grippales. En caractérisant les anticorps antigrippaux plus en détail que ce qui avait été possible auparavant, ce microrése peut aider à déterminer pourquoi certaines personnes développent une infection grippale et d’autres non.

La technique du microrésexe antigène a été appliquée à 35 agents pathogènes différents dans notre laboratoire, permettant la mesure des anticorps contre 60 000 cibles antigènes et à partir de 50 000 échantillons de sérum prélevés dans des cas de maladies infectieuses et de contrôles sains dans le monde entier. Ayant enseigné cette technique par le biais d’ateliers en personne, nous avons constaté que la capacité de démontrer visuellement la technique est cruciale pour sa compréhension et sa performance. Al Jasinskas et Rafael De Assis, scientifiques de notre laboratoire, démontreront la procédure.

Pour imprimer les antigènes à l’aide d’une imprimante microrésoré, sélectionnez une imprimante avec des broches de repérage de microrésorité à faible volume qui peuvent aspirer les antigènes à partir d’une plaque source de 384 puits dans le canal de l’échantillon et déposer les antigènes par contact direct et action capillaire sur des glissières en verre enduit de nitrocellulose de 16 tampons. Dans le logiciel d’impression, entrez le nombre de plaques d’échantillon qui seront utilisées dans le nombre de plaques boîte de texte et sélectionnez le type de plaque qui sera utilisé pour l’analyse. Sélectionnez une configuration d’épingle et réglez les décalages d’origine sur les distances entre l’origine de la diapositive et l’endroit où les broches d’impression commenceront à imprimer sur les diapositives.

Sous l’onglet de conception du tableau, définissez la taille et la forme des tableaux et sélectionnez les paramètres pour la façon dont les broches d’impression ramasseront et distribueront les échantillons. Configurez les protocoles de nettoyage et de ballonnement des broches et définissez la séquence dans laquelle les blocs d’échantillon sont imprimés sur les diapositives. Le logiciel de tableau construira un fichier d’index de grille annoté pour décrire l’agencement des antigènes dans chaque microrésexe.

Après avoir programmer le logiciel d’impression avec le protocole désiré, démarrez l’impression. Une fois terminé, placez des glissières de microrésoré non prouvées dans une boîte à l’épreuve de la lumière dans une armoire de dessiccator à température ambiante. Pour sonder sera pour les anticorps sur le microrése, utilisez des clips pour fixer les diapositives microarray côté pad vers le haut sur les chambres de sondage et placer les chambres dans les cadres.

Soyez prudent lors de l’assemblage des glissières, car elles sont facilement cassées et vérifiez toute fuite après la réhydratation. Si nécessaire, démonter et remonter les glissières pour corriger les fuites. Réhydrater les diapositives avec 100 microlitres de tampon de blocage filtré par puits et diluer le sera à un rapport de un à 100 en 100 microlitres de tampon de blocage par échantillon.

Ensuite, incubez les toboggans réhydratés de microarray et le sera dilué pendant 30 minutes à température ambiante et 100 à 250 rotations par minute sur un shaker orbital. À la fin de l’incubation, utilisez des pointes de pipette reliées à une ligne sous vide avec un flacon de collecte secondaire pour aspirer soigneusement le tampon bloquant du coin de chaque chambre sans toucher les coussinets et ajouter immédiatement le sera dilué aux coussinets sans laisser sécher les coussinets. Ensuite, placez les cadres couverts dans des plateaux contenant des serviettes en papier humide scellées pour maintenir l’humidité et incuber les cadres pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur un shaker à bascule.

Pour l’étiquetage des anticorps secondaires conjugués à points quantiques, aspirez soigneusement le sera comme il vient de le démontrer et rincez les diapositives avec trois lavages dans 100 microlitres de tampon TTBS frais par puits pendant cinq minutes chacun sur un shaker orbital. Les diapositives sont ensuite incubées avec un mélange d’anticorps secondaires conjugués à points quantiques, puis lavées trois fois comme décrit dans le protocole, en utilisant la même technique que ce qui vient d’être démontré. Après le dernier lavage, retirez soigneusement les glissières des chambres et rincez doucement les glissières à l’eau distillée double filtrée, puis placez chaque glissière dans un tube de 50 millilitres.

Ensuite, séchez les glissières par centrifugation. Pour obtenir des images des diapositives de microréseau, allumez d’abord l’imageur portatif et placez soigneusement la diapositive pour être photographiée face vers le bas dans le support de diapositive dans la chambre d’imagerie. Ouvrez le logiciel d’imagerie et sous l’onglet configurer l’imageur, sélectionnez la configuration de diapositive appropriée.

Sous l’onglet contrôle de l’image, sélectionnez le canal fluorescent approprié et ajustez les temps d’exposition et d’acquisition en fonction de la réactivité du sera. Ensuite, cliquez sur capture pour démarrer l’acquisition de l’image. À la fin de l’acquisition, utilisez les grilles orientées sur les marqueurs fiduciaux pour détecter les taches de tableau.

Pour mesurer l’intensité de la tache, dans le panneau d’informations de fichier, téléchargez le fichier gal et spécifiez le dossier où les fichiers de sortie d’analyse doivent être enregistrés dans la section options d’analyse. Sous l’onglet contrôle de l’image, ouvrez l’une des images acquises pour les quantifier et sélectionnez automatiquement. Dans la section d’analyse de tableau, créez un modèle fiducial tel qu’indiqué par le logiciel.

Cliquez sur l’analyse des lots pour sélectionner le dossier qui contient les images à quantifier et sélectionnez le modèle fiducial qui vient d’être créé. Le logiciel analysera chaque image et quantifiera l’intensité du spot. Ensuite, analyser les données brutes pour comparer la liaison anticorps entre les antigènes et à travers les spécimens de sérum.

Dans cette étude représentative, les anticorps secondaires utilisés étaient l’IgG anti-humain de chèvre conjugué à l’émission quantique de points à 800 nanomètres et l’IgA anti-humain de chèvre conjugué à l’émission quantique de points à 585 nanomètres pour la détection multiplexe des anticorps IgG et IgA respectivement. Dans la carte thermique résultante, seuls les sous-types cliniquement pertinents avec une haute représentation ont été étiquetés pour économiser de l’espace avec le signe plus désignant tous les sous-types restants d’un nombre plus élevé. Le sérum IgA et l’IgG ont été regroupés par leurs formes moléculaires et sous-types d’hémagglutinine et de neuraminidase.

Démontrer la grande spécificité des anticorps du groupe de tête d’hémagglutinine pour les sous-types cliniques et la réactivité croisée élevée de l’hémagglutinine entière et des anticorps triamerized entiers d’hémagglutinine avec l’inclusion de la région de stock. Les réponses aux anticorps grippaux mesurées sur le microrésexe peuvent être confirmées par des techniques traditionnelles, y compris l’inhibition de l’hémagglutination et les analyses de micronéutralisation. Cette technique a permis de mieux comprendre la spécificité des sous-types d’anticorps pour le groupe tête de la grippe et l’importance relative des anticorps IgA et IgG pour la susceptibilité grippale.

Bien qu’aucun des matériaux ne soit extrêmement dangereux, tous les échantillons de sérum humain doivent être manipulés conformément aux protocoles institutionnels de biosécurité.