Identification des ARN circulaires à l'aide du séquençage de l'ARN

Ce protocole est le résultat de l’évaluation des aspects clés de la préparation de la bibliothèque circRNA, tels que le type de kit, le traitement RNase R, les quantités d’entrée et leur impact sur la détection de l’ARN circ. Il permet une détection optimale du circARN et fournit des données sur les paramètres réglables en fonction des besoins de l’utilisateur. L’identification des circARN dans différents types d’échantillons nous aidera à mieux comprendre la distribution de leur expression et ouvre la voie à la délimitation du rôle fonctionnel de ces molécules.

Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel échantillon total d’ARN. Il est important de conserver les échantillons d’ARN sur la glace avant de commencer le protocole. Évaluez les valeurs RIN et DV200 sur le Bioanalyzer Agilent ou le TapeStation avant la préparation, et suivez les procédures appropriées lorsque vous travaillez avec l’ARN.

Commencez par diluer l’ARN total à quatre microgrammes dans 39 microlitres d’eau sans RNase et pipetting de haut en bas pour mélanger. Dans un tube séparé, utilisez 1x RNase R Buffer pour diluer le RNase R à une concentration de travail de deux unités par microlitre. Pipette 39 microlitres de l’ARN total et cinq microlitres de 10x RNase R Reaction Buffer dans un tube de réaction de 1,5 microlitre, et mélanger.

Ajouter six microlitres de la RNase R.Then diluée ajuster la pipette au volume de réaction complet, et mélanger la solution en pipetting de haut en bas 10 fois. Placez le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, en vous assurant que le volume de réaction complet est immergé dans le bain d’eau. Ensuite, placez le tube sur la glace et procédez immédiatement au nettoyage et à la concentration de l’ARN.

Avant de commencer, préparez le tampon de lavage d’ARN en mélangeant le concentré avec 48 millilitres de 100% éthanol, et placez des colonnes de purification dans des tubes de collecte. Une fois prêt, ajouter deux volumes de tampon de liaison ARN à l’échantillon RNase R traité, et bien mélanger. Ajouter 150 microlitres de 100% d’éthanol au mélange pour un total de 300 microlitres, transférer tout le volume à la colonne, et centrifugeuse pendant 30 secondes.

Retirez le flux à travers, et ajouter 400 microlitres de tampon de préparation d’ARN directement à la colonne. Centrifugeuse pendant 30 secondes, et jeter le flux à travers. Ensuite, ajoutez 700 microlitres de tampon de lavage d’ARN à la colonne, centrifugeuse pendant 30 secondes, et jetez le flux à travers.

Ajouter 400 microlitres supplémentaires du tampon de lavage, centrifugeuse pendant deux minutes, et transférer la colonne dans un tube frais sans RNase de 1,5 millilitre. Ajouter délicatement 11 microlitres d’eau sans RNase directement à la colonne en tenant la pointe pipette juste au-dessus du filtre de colonne. Laissez reposer l’échantillon pendant une minute à température ambiante, puis centrifugez-le pendant une minute.

Assurez-vous qu’il y a un écoulement dans le tube de 1,5 millilitre et jetez la colonne. L’échantillon d’ARN purifié peut être conservé à moins 80 degrés Celsius ou utilisé immédiatement pour la préparation de la bibliothèque. Transférer 10 microlitres de l’ARN total purifié dans un puits propre dans une plaque PCR de 96 puits.

Ajouter cinq microlitres de rRNA Binding Buffer suivi de cinq microlitres de rRNA Removal Mix, puis pipette doucement de haut en bas pour mélanger les reagents. Sceller la plaque et l’incuber pendant cinq minutes à 68 degrés Celsius sur un bloc thermocycleur préprogrammé et préchauffé. Après l’incubation, laisser reposer la plaque à température ambiante pendant une minute.

Retirer le joint de la plaque et ajouter 35 microlitres de perles d’enlèvement de rRNA à température ambiante vortexées à l’échantillon. Réglez la pipette à 45 microlitres, et pipette de haut en bas 10 à 20 fois pour bien mélanger. Laissez reposer l’assiette à température ambiante pendant une minute.

Transférez la plaque sur un support magnétique et incubez-la pendant une minute ou jusqu’à ce que la solution se dégage. Transférer le surnatant dans un nouveau puits dans l’assiette. Ensuite, transférez la plaque du support magnétique au support de la plaque.

Vortex ARN nettoyer les perles jusqu’à ce qu’ils soient bien dispersés, et ajouter 99 microlitres de perles à l’échantillon. Pipette de haut en bas pour mélanger, et incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes. Transférez la plaque sur le support magnétique et laissez-la là pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que la solution se dégage, puis retirez et jetez tout supernatant du puits.

Avec la plaque encore sur le support magnétique, ajouter 200 microlitres de 80% d’éthanol fraîchement préparé au puits sans perturber les perles. Laissez l’éthanol dans le puits pendant 30 secondes, puis retirez-le et jetez-le. Ajouter 11 microlitres d’Elution Buffer au puits, et pipette de haut en bas pour mélanger.

Incuber la plaque à température ambiante pendant deux minutes, puis la transférer sur le support magnétique, et la garder là jusqu’à ce que la solution se dégage. Transférer 8,5 microlitres du supernatant dans un nouveau puits sur la même plaque et ajouter 8,5 microlitres d’Elute, Primer, Fragment High Mix à chaque puits contenant un échantillon. Pipette de haut en bas 10 fois pour bien mélanger, sceller la plaque, et l’incuber pendant huit minutes dans un thermocycleur préchauffé à 94 degrés Celsius.

Refroidissez l’échantillon à quatre degrés Celsius, retirez la plaque du thermocycleur et centrifugez-la brièvement. Deux trousses de préparation à la bibliothèque, TruSeq et KAPA, ont été évaluées pour ce protocole. Dans l’ensemble, un plus grand nombre d’ARN circulaires et un pourcentage plus faible d’ARN ribosomal ont été détectés lors de l’utilisation du kit TruSeq, de sorte que TruSeq a été sélectionné pour d’autres expériences.

L’importance du prétraitement RNase R a été évaluée en comparant les données générées par les bibliothèques prétraitées et non prétraitées. Comme prévu, un plus grand nombre d’ARN circulaires ont été systématiquement identifiés dans les bibliothèques prétraitées par rapport aux bibliothèques non prétraitées. La quantité d’ARN d’entrée a été optimisée pour détecter une plus grande diversité d’ARN circulaires.

Les bibliothèques ont été préparées à l’aide d’un, deux et quatre microgrammes d’ARN d’entrée, et la plus grande diversité d’espèces circulaires d’ARN a été observée lors de l’utilisation de quatre microgrammes d’ARN total. Le protocole optimisé a été utilisé pour comparer les abondances circulaires d’ARN dans cinq régions du cerveau de quatre donneurs en bonne santé et pour d’autres types de tissus de six donneurs en bonne santé. Dans l’ensemble, une plus grande abondance de RNase circulaire a été observée dans le cerveau par rapport à d’autres types de tissus.

Il est important de se rappeler de suivre les procédures appropriées lorsque vous travaillez avec l’ARN, y compris le port de gants, le nettoyage complet du banc et des pipettes avec des lingettes RNase ou spray avant de commencer le protocole, et de garder l’ARN sur la glace à l’avance. Après cette procédure, la validation orthogonale telle que le séquençage sanger des jonctions identifiées de circARN peut être exécutée. La découverte de nouveaux circARN et d’autres preuves de leur présence forment un nouveau domaine de recherche pour explorer leurs fonctions biologiques.