Synthèse hiérarchique et programmable d'oligosaccharide d'un pot
6 septembre 2019
Ce protocole montre comment utiliser le logiciel Auto-CHO pour la synthèse hiérarchique et programmable d'oligosaccharides. Il décrit également la procédure générale pour les expériences de détermination RRV et la glycosylation d'un pot de SSEA-4.
Nous démontrons comment utiliser notre logiciel nouvellement développé, Auto-CHO, pour la synthèse hiérarchique et programmable d’oligosaccharide d’un pot. Auto-CHO inclut des algorithmes sur des blocs de construction élargis, avec des valeurs de réactivité relative prédites par l’apprentissage automatique. Le logiciel Auto-CHO fournit une ligne directrice précieuse pour la sélection des blocs de construction, et un plan hiérarchique pour la synthèse multiple d’un pot de glycans plus complexes par la composition des fragments.
Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie des cancers ou des maladies infectieuses par les thérapeutiques à base de glucides. Avant d’utiliser Auto-CHO, assurez-vous que l’environnement Java Runtime a été installé dans un PC ou un Mac. La démonstration visuelle de la manipulation du logiciel Auto-CHO et l’expérience connexe de détermination de la valeur de réactivité aideront les chimistes à suivre le protocole et à poursuivre l’expérience rapidement.
Pour effectuer l’initialisation logicielle de l’environnement Java Runtime, rendez-vous sur le site Auto-CHO et téléchargez le logiciel selon le système d’exploitation. Actuellement, Auto-CHO prend en charge Windows, macOS et Ubuntu. Le dernier guide d’utilisation PDF est fourni sur le site Auto-CHO.
Pour les utilisateurs de Windows, dézidez les fenêtres Auto-CHO. zip, et double clic sur Auto-CHO. pot dans le dossier Auto-CHO Windows pour démarrer le programme.
Entrez la structure glycan désirée. Choisissez de dessiner une structure glycan ou de lire un fichier de structure existant. Pour entrer en dessinant, cliquez sur modifier glycan par GlycanBuilder, ou la zone de cliquez ici pour modifier la cible synthétique pour dessiner et modifier la structure de requête par GlycanBuilder.
L’information sur le lien et la gazouillité ne doit pas être ignorée. Cliquez sur les boutons Globo-H, SSEA-4 ou OligoLacNAc pour afficher les exemples. Fermez le dialogue GlycanBuilder pour terminer l’édition.
Définissez les paramètres de recherche dans l’onglet paramètres pour obtenir des résultats de recherche raisonnables. Cliquez sur le bouton correct pour activer de nouveaux paramètres. Le paramètre par défaut est de rechercher uniquement dans la bibliothèque expérimentale.
S’il est souhaité de rechercher à la fois les bibliothèques expérimentales et virtuelles, sélectionnez l’onglet bibliothèque de blocs de construction virtuels. Sélectionnez utiliser des bibliothèques expérimentales et virtuelles, et appliquer le filtrage pour afficher des blocs de construction virtuels avec certains critères. Les blocs de construction expérimentaux et virtuels peuvent travailler ensemble pour améliorer la capacité de recherche d’Auto-CHO.
Actuellement, Auto-CHO fournit plus de 50 000 blocs de construction virtuels, avec des VRR prévus dans la bibliothèque. Vérifiez un ou plusieurs blocs de construction virtuels désirés que l’utilisateur aimerait utiliser pour la recherche. Cliquez sur le bouton des blocs de construction virtuels sélectionnés pour afficher uniquement les blocs de construction virtuels sélectionnés.
Cliquez sur le bouton des blocs de construction virtuels filtrés pour afficher uniquement les blocs de construction virtuels avec certains critères définis par l’utilisateur. Cliquez sur le bouton afficher tous les blocs de construction virtuels pour afficher tous les blocs de construction virtuels disponibles et réinitialiser le filtre. Sélectionnez l’onglet structure de requête et cliquez sur le bouton bibliothèque du bloc de construction de recherche pour trouver les solutions synthétiques d’un pot pour la structure de requête.
Ensuite, confirmez les paramètres. Recherchez la visionneuse de résultats. Le résultat de recherche est affiché dans l’onglet visualisation des résultats.
Les accepteurs finaux réducteurs de différents nombres de résidus sont affichés dans la colonne d’accepteur final réductrice. Ensuite, sélectionnez un accepteur final réducteur. Les solutions sont affichées sur la liste des solutions synthétiques.
Des fragments sont montrés dans la liste des fragments pour suggérer combien de fragments doivent être utilisés dans la synthèse. Le système fournit des informations détaillées sur chaque fragment, y compris le RRV du fragment, le rendement informatique, ainsi que sur le groupe protecteur qui doit être protégé pour l’utilisation du fragment dans la réaction d’un pot. Les blocs de construction utilisés pour assembler le fragment sélectionné et les informations de connexion fragmentaire sont également affichés.
Pour les blocs de construction expérimentaux, visualisez et vérifiez les structures chimiques des blocs de construction sélectionnés dans la structure chimique de la région des blocs de construction, et consultez le navigateur détaillé des blocs d’information. Dans un flacon inférieur rond de 10 millilitres, combinez les deux donneurs de thioglycoside, le méthanol absolu, et la séchrite dans DCM. Remuer ensuite à température ambiante pendant une heure.
Prenez un aliquot de 30 microlitres de ce mélange et injectez le mélange dans la chromatographie liquide haute performance en trois injections distinctes. Mesurer le coefficient entre l’absorption et la concentration de la molécule donneuse dans les conditions de séparation de base. Ajouter une solution de 0,5 molaire N-Iodosuccinimide dans l’acéonitrile dans le mélange de réaction, suivie de l’ajout d’une solution d’acide trifluorométhane trifluoromésulfonique molaire de 0,1.
Remuer le mélange à température ambiante pendant deux heures. Ensuite, diluer le mélange de réaction avec quatre millilitres de DCM. Filtrer et laver la réaction avec du thiosulfate de sodium aqueux saturé, contenant 10 % de carbonate d’hydrogène de sodium.
Maintenant, extraire la couche aqueuse trois fois avec cinq millilitres de DCM. Mélanger toutes les couches organiques et laver avec cinq millilitres de saumure. Séchez ensuite les couches combinées avec environ 200 milligrammes de sulfate de magnésium anhydre.
Secouez légèrement le mélange pendant 30 secondes et filtrez-le à travers un entonnoir avec un papier filtre cannelé afin d’enlever le sulfate de magnésium. Puis recueillir le filtrate dans un flacon de fond rond de 25 millilitres. Retirer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif.
Dissoudre les résidus dans un millilitre de DCM. Prenez un aliquot de 30 microlitres de ce mélange, et injectez-le dans la chromatographie liquide haute performance dans trois injections distinctes. Mesurer les concentrations des donneurs restants par HPLC, dans les mêmes conditions de séparation.
Mesurer la réactivité relative. D’après la valeur relative de réactivité du DR4, la valeur relative de réactivité du DX1 est de trois. Le résultat de recherche Auto-CHO basé sur les paramètres par défaut indique que SSEA-4 peut être synthétisé par une réaction de deux plus un plus trois un pot.
Lorsqu’un accepteur final réducteur de trisaccharide est sélectionné, le programme affiche quatre solutions potentielles pour la requête. La première solution a un fragment, et son rendement calculé est d’environ 94%Le fragment peut être synthétisé par deux blocs de construction. Le RRV du premier bloc de construction disaccharide est 1462, et le RRV du deuxième monosaccharide est 32.0.
La structure chimique du premier bloc de construction suggéré utilisé dans la réaction d’un pot est également montrée. L’expérience d’un pot montre que SSEA-4 peut être synthétisé avec succès dans le rendement de 43% par cette suggestion. SSEA-4 peut être synthétisé par trois unités suggérées par Auto-CHO.
Ces unités comprennent silele disaccharide bloc de construction un, bloc de construction monosaccharide deux, et la réduction de l’accepteur final trois. Pour les paramètres, nous vous suggérons de définir des paramètres avec des critères plus stricts au début. Pour le choix de la bibliothèque de bloc de construction, nous suggérons de rechercher la bibliothèque expérimentale seulement au début.
Grâce à cette démonstration, nous espérons que des glycanes plus importants, tels que les antigènes de glucides associés à la tumeur, peuvent être synthétisés par l’approche d’un pot pour d’autres études. Après cette procédure, la synthèse de tous ces antigènes peut être effectuée afin de concevoir des vaccins anticancéraux à base de glucides. Nous espérons également que l’intelligence artificielle et les algorithmes informatiques peuvent faciliter la synthèse automatisée du glycan au profit du traitement et de la prévention des maladies.
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Aperçu
Ce protocole illustre l'utilisation du logiciel Auto-CHO pour la synthèse hiérarchique et programmable en un seul récipient d'oligosaccharides. Il comprend une démonstration visuelle de la manipulation du logiciel et d'expériences de détermination du RRV.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Synthèse d'oligosaccharides
- Développement de logiciels
- Applications de l'apprentissage automatique
Contexte
- Le logiciel Auto-CHO facilite la synthèse des oligosaccharides.
- Des algorithmes prédisent les valeurs de réactivité relative à l'aide de l'apprentissage automatique.
- Des directives sont fournies pour le choix des blocs de construction.
- Des implications pour les applications thérapeutiques dans le cancer et les maladies infectieuses.
Objectif de l'étude
- Démontrer les fonctionnalités du logiciel Auto-CHO.
- Fournir un protocole pour la glycosylation en un seul réacteur.
- Faciliter la synthèse de glycanes complexes par composition de fragments.
Méthodes utilisées
- Synthèse hiérarchique d'oligosaccharides.
- Algorithmes d'apprentissage automatique pour prédire les valeurs de réactivité.
- Démonstrations visuelles de l'utilisation de logiciels.
- Expériences de détermination du RRV.
Résultats principaux
- Démonstration réussie de la synthèse monopot des oligosaccharides.
- Directives efficaces pour le choix des blocs de construction.
- Instructions visuelles claires à l'intention des chimistes.
- Applications thérapeutiques potentielles mises en évidence.
Conclusions
- Le logiciel Auto-CHO est un outil précieux pour la synthèse des oligosaccharides.
- Le machine learning améliore le processus de synthèse.
- Le protocole permet une exécution rapide des expériences.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La synthèse programmable en une seule étape des oligosaccharides permet l'assemblage rapide de glycanes complexes pour la validation de cibles thérapeutiques, réduisant ainsi les délais de développement des candidats médicaments à base de glucides. Le logiciel Auto-CHO offre une sélection prédictive des blocs de construction et une planification hiérarchique de la synthèse, soutenant la réduction des risques mécanistiques en phase précoce de découverte. Cette approche améliore le tri des portefeuilles en renforçant la confiance dans les relations structure-activité des glycanes avant tout investissement préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à la synthèse rapide de structures de glycanes définies, comme SSEA-4, pour la validation de marqueurs de cellules souches.
- Valeur opérationnelle : Contribue à l'atténuation des risques biologiques en générant des lots homogènes d'oligosaccharides destinés à des tests de validation fonctionnelle de cibles.
- Valeur prédictive : Facilite la cartographie des relations structure-activité afin de prioriser les épitopes glycaniques présentant un potentiel thérapeutique dans les cibles contre le cancer et les maladies infectieuses.
Développement de tests et de criblages
- Prêt-à-employer pour tests : Produit des préparations normalisées de glycanes adaptées au développement de puces à sucres et de tests de liaison.
- Résultats quantitatifs : Fournit des rendements mesurables et des profils de pureté permettant un criblage fiable de composés vis-à-vis des protéines liant les glycanes.
- Réutilisation de la plateforme : Permet l'amélioration itérative des bibliothèques de blocs constitutifs grâce aux retours des utilisateurs sur les blocs virtuels, renforçant ainsi l'extensibilité du criblage à long terme.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : La synthèse démontrée du SSEA-4, un marqueur des cellules souches pluripotentes, soutient l'alignement des biomarqueurs en médecine régénérative et le ciblage des cellules souches cancéreuses.
- Continuité translationnelle : Offre une voie de passage de la synthèse à l'échelle de la découverte à l'évaluation préclinique d'antigènes glucidiques associés aux tumeurs pour le développement de vaccins.
- Progression ajustée au risque : Permet la production de glycanes à structure définie afin de réduire l'ambiguïté dans l'évaluation de l'efficacité immunologique et du profil de sécurité.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase initiale de découverte en permettant une synthèse glycanique guidée par des hypothèses, en alimentant l'identification de composés d'intérêt par des structures antigéniques définies et en soutenant la validation préclinique grâce à une production reproductible de glycans.
- Biologie de la découverte : Soutient la réduction des risques mécanistiques en clarifiant les voies biosynthétiques et en validant les cibles glycaniques par une synthèse chimique définie.
- Criblage : Génère des panels de glycanes prêts à l'essai avec des rendements quantifiés pour le criblage à haut débit des interactions glycanes-protéines.
- Analytique : Fournit des valeurs de réactivité relative et des rendements calculés comme paramètres quantitatifs permettant de comparer l'efficacité des voies de synthèse et de prédire leur succès.
- Recherche translationnelle : S'intègre aux travaux précliniques en permettant la synthèse d'antigènes carbohydratés associés aux tumeurs pour l'évaluation de candidats-vaccins.
- Réutilisation institutionnelle : Fonctionne comme une capacité réutilisable grâce à l'expansion virtuelle pilotée par rétroaction d'Auto-CHO, réduisant ainsi la planification redondante de synthèses dans différents projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique liée à la fonction des glycanes.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité de la production d'oligosaccharides grâce à des protocoles standardisés en un seul réacteur.
- Valeur stratégique : Permet de mieux évaluer les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en facilitant une exploration rapide des relations structure-activité, réduisant ainsi le risque d'échec biologique en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une hiérarchisation des candidats fondés sur les glycanes, ajustée au risque, grâce à des prédictions clairement définies en matière d'accessibilité synthétique et de rendement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise en chimie des glucides et en interprétation des structures des glycanes pour une sélection efficace des unités de construction.
- Nécessite un accès à une HPLC et à une infrastructure standard de synthèse organique pour la détermination des RRV et le suivi des réactions.
- Exige une standardisation interéquipes de la nomenclature des glycanes et des formats de saisie structurale afin d'assurer des requêtes cohérentes dans Auto-CHO.
- Implique des considérations d'adaptation lors de l'extension à des unités de construction non thioglycosidiques ou à d'autres stratégies de groupes protecteurs.
- Est limité par la précision des RRV prédites par apprentissage machine pour des unités de construction nouvelles, nécessitant une validation expérimentale pour des prédictions à haute fiabilité.
